CN108753636A

CN108753636A - 一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法

Info

Publication number: CN108753636A
Application number: CN201810601213.8A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 郭伟; 韩丽娟
Original assignee: Shandong Heng Lu Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Heng Lu Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-06-12
Also published as: WO2019237824A1; US11634720B2; JP7130284B2; EP3808836A1; JP2021517828A; US20210254081A1; CN108753636B; EP3808836A4

Abstract

本发明涉及一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法，属于有机化合物制备技术领域，将PcAAS和ADH序列导入酵母BY4741，得到生产酪醇的PcAAS‑ADH重组酵母；在所述PcAAS‑ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒、tyrA表达盒得到生产酪醇的PcAAS‑ADH‑Δpdc1‑tyrA重组酵母；将HpaBC的DNA序列导入PcAAS‑ADH‑Δpdc1‑tyrA重组酵母，得到生产羟基酪醇的PcAAS‑ADH‑HpaBC‑Δpdc1‑tyrA重组酵母。在酵母BY4741中构建酪醇或羟基酪醇生物合成途径，提高酪醇或羟基酪醇的产量。

Description

一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高产酪醇的基因重组酵母及一种异源合成羟基酪醇的酿酒酵母，以及所述酵母的构建方法。

背景技术

酪醇是天然的抗氧化剂，来源于橄榄油，是苯乙醇的一种衍生物。别名红景天苷元，是红景天的主要药用活性成分，是红景天苷、羟基酪醇的前体物质。可以保护细胞免受氧化伤害，是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体，酪醇可被用于医药剂。酪醇的衍生物羟基酪醇是一种具有很强的抗氧化作用及多种生理医药功能，羟基酪醇的抗氧化性强于酪醇，同时可以合成很多聚合物，且没有已知毒性，在生物医药、功能食品等行业应用广泛，具有预防心血管、骨质缺乏等疾病的发生。目前，羟基酪醇的获得主要是从橄榄叶中提取，从植物中提取，成本高，占用大量的耕地。

化学法中利用苯乙醇合成法，大多先采用保护羟基，然后硝化、还原、重氮化、水解得到对羟基苯乙醇，收率为70％。苯乙醇价格高供应紧张，利用硝基甲苯合成，价格低廉但步骤较长，产率低，利用对羟基苯乙烯合成产率达到96％，纯度99％，产率和纯度都很高，具有一定的价值，但原料成本较高。化学法制备酪醇原料成本高且环境不友好，这些都直接制约了酪醇的工业化生产。因此，生物法合成酪醇和羟基酪醇已经成为研究热点。

酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为C₈H₁₀O₂，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式为

多项专利成功构建了产酪醇的基因重组大肠杆菌。

专利名：“一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用”(申请号201310133238.7)；

专利名：“一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用”(申请号201410115011.4)；

专利名：“利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及重组方法及应用”(申请号201510242626.8)；

专利名：“一种产酪醇的重组菌株及其构建方法”(申请号201710091999.9)；

专利名：“异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法”(申请号201711054680.5)。

但是大肠杆菌内毒素的去除是大规模工业生产中的一个重大挑战。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，也称为脂多糖。脂多糖对人体能够产生毒性。

“Methods for the improvement of product yield and production in amicroorganism thtough the addition of alternate electron acceptors”中公开了一种重组酵母，利用酶转化调节代谢途径，生产甘油的方法。

“Breeding of a high tyrosol-producing sake yeast by isolation of anethanol-resistant mutant from a trp3mutant”公开了从酿酒酵母的色氨酸营养突变体中分离出一种耐乙醇的突变体，研制出了一种新型的高酪蛋白酵母菌育种策略。

同时，尚未检索到利用酵母，特别是酿酒酵母，生产酪醇和羟基酪醇的生物合成技术。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种生产酪醇的酵母。开发一种重组酵母，在酵母BY4741中构建酪醇生物合成途径，敲除酵母BY4741基因模板中的pdc1的基因片段，减弱酵母菌中合成乙醇的途径，提高酪醇的产量，并通过导入能够将生产酪醇的基因进一步转化成羟基酪醇的羟化酶基因，构建异源合成羟基酪醇的酵母菌株。

本发明的目的之二是提供一种生产羟基酪醇的酵母。

本发明的目的之三是提供一种生产酪醇的酵母的构建方法。

本发明的目的之四是提供一种生产羟基酪醇的酵母的构建方法。

本发明的目的之五是提供所述一种生产酪醇的酵母或构建方法在生产酪醇中的应用。

本发明的目的之六是提供所述一种生产羟基酪醇的酵母或构建方法在生产羟基酪醇中的应用。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种生产酪醇的酵母，将来源于香芹(Petroselinum crispum)的酪氨酸脱羧酶PcAAS(TryDC,Tyrosine decarboxylase)和来源于肠杆菌属(Enterobacteriaceae)的醇脱氢酶(ADH，Alcohol dehydrogenase)的DNA序列导入酵母BY4741，得到PcAAS-ADH重组酵母。

优选的，酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；酪氨酸脱羧酶的DNA序列为SEQ ID NO.2，能够表达SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

优选的，醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；醇脱氢酶的DNA序列为SEQ IDNO.4，能够表达SEQ ID NO.3所示氨基酸序列。

优选的，在所述PcAAS-ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒，得到PcAAS-ADH-Δpdc1重组酵母。

进一步优选的，所述pdc1基因敲除盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物分别扩增pdc1片段的上下游500bp同源臂，利用引物扩增G418抗性基因片段，将所述上下游500bp同源臂和G418抗性基因片段融合得到pdc1敲除盒。

优选的，在所述PcAAS-ADH-Δpdc1重组酵母中导入tyrA表达盒，得到PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母。

进一步优选的，所述tyrA表达盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物扩增上游500bp的同源臂，以所述pdc1敲除盒为模板，利用引物扩增tyrA片段，将上游500bp的同源臂和tyrA片段融合构建tyrA表达盒。

一种生产羟基酪醇的酵母，将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaBC，4-hydroxyphenylacetic hydroxylase)的DNA序列基因簇导入所述生产酪醇的PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母中，得到生产羟基酪醇的PcAAS-ADH-HpaBC-Δpdc1-tyrA重组酵母。

优选的，所述4-羟基苯乙酸羟化酶的氨基酸序列基因簇包括4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaB)的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaC)的氨基酸序列为SEQ IDNO.7。

优选的，4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaB)的DNA序列为SEQ ID NO.6，能够表达SEQ IDNO.5所示氨基酸序列；4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaC)的DNA序列为SEQ ID NO.8，能够表达SEQID NO.7所示氨基酸序列。

一种生产酪醇的酵母的构建方法，具体步骤为：

1)将PcAAS和ADH的DNA序列插入表达载体，构建载体-PcAAS-ADH重组表达质粒；

2)以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物分别扩增pdc1片段的上下游500bp同源臂，利用引物扩增G418抗性基因片段，将所得片段融合得到pdc1敲除盒；

3)以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物扩增上游500bp的同源臂，以pdc1敲除盒为模板，利用引物扩增tyrA片段，将所得片段融合构建tyrA表达盒；

4)将步骤2)得到的pdc1敲除盒和步骤3)得到的tyrA表达盒插入到步骤1)得到的载体-PcAAS-ADH质粒，得到PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA质粒，导入到酵母BY4741中，得到重组PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA酵母菌株；

优选的，步骤1)中的表达载体为pJFE3、pUC19、pδBLE2.0、pGK系列载体、pXP318。

进一步优选的，载体为pJFE3。

一种生产羟基酪醇的酵母的构建方法，具体步骤为：

1)将HpaB和HpaC基因合成构建HpaBC表达盒；

2)将HpaBC表达盒导入重组PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA酵母中，得到重组PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA-HpaBC酵母。

所述生产酪醇的酵母和生产酪醇的酵母的构建方法在生产酪醇中的应用。

优选的，所述应用的具体方式为将所述生产酪醇的酵母进行发酵培养得到酪醇；所述发酵培养的培养液为葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖和酪氨酸混合物中的一种或者它们的混合物。

所述生产酪醇的酵母和生产羟基酪醇的酵母的构建方法在生产羟基酪醇中的应用。

优选的，所述应用的具体方式为将所述生产羟基酪醇的酵母进行发酵培养得到羟基酪醇；所述发酵培养的培养液为葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖和酪氨酸混合物中的一种或者它们的混合物。

本发明的有益效果：

1)本申请中在PcAAS-ADH重组酵母中导入pdc1敲除盒，切断了酵母中合成乙醇的途径；经过PEP合成酪醇的代谢途径，提高酪醇的产量；

2)本申请中在PcAAS-ADH-Δpdc1重组酵母中导入tyrA表达盒，使PREP转化为4HPP的代谢步骤由双向变为单向，提高了酪醇的产量；

3)本申请开发一种酵母，构建酪醇生物合成途径，提高酪醇的产量，并通过导入能够将酪醇进一步转化成羟基酪醇的羟化酶基因，构建异源合成羟基酪醇的酵母菌株；和大肠杆菌相比，酿酒酵母具有安全性好，产量稳定，抗染菌能力强等优点，适合大规模的工业生产；

4)本发明提供了一个新型且环境友好型酪醇及羟基酪醇生物制备技术，为酪醇及羟基酪醇的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为以葡萄糖或酪氨酸为底物合成酪醇及羟基酪醇途径示意图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面结合实施例对本发明进一步说明：

表1为简写与英文的对照

简写	英文全称	中文
				Glucose	葡萄糖
PEP	Phosphoenolpyruvate	磷酸烯醇丙酮酸
			PREP	Prephenate	预苯酸
2HxThPP	2-(alpha-Hydroxyethyl)thiamine diphosphate	硫胺素二磷酸
			4HPP	4-Hydroxyphenylpyruvate	对羟苯基丙酮酸双氧化酶
Tyr	L-Tyrosine	酪氨酸
			4HPAA	4-Hydroxyphenylacetaldehyde	4-羟基苯乙醛
TYR-OL	4-Hydroxyphenylethanol	酪醇

实施例1

pJFE3-PcAAS-ADH重组表达质粒的构建

将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列根据宿主酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，获得SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对应的优化后核苷酸序列后，进行基因合成。选用引物，用TOYOBO公司的KOD FXDNA聚合酶扩增获得目标基因。琼脂糖凝胶电泳验证条带大小正确后切取条带，用OMEGA凝胶提取试剂盒回收基因片段。PCR扩增引物如下：

PcAAS-F的序列为SEQ ID NO.9；PcAAS-R的序列为SEQ ID NO.10；adh-F的序列为SEQ ID NO.11；adh-R的序列为SEQ ID NO.12；

将含有GBdir+pSC101-BAD-ETgA-tet质粒的E.coli菌株，在含有四环素抗性的平板上挑取单菌落至装有1mL LB液体培养基(灭菌，含4ug/mL四环素)的EP管中，30℃，200rpm培养过夜。使用高保真性KOD FX DNA聚合酶扩增目的基因片段，并保证每条片段都与相邻片段存在50bp的同源序列，PCR产物经凝胶电泳后使用DNA片段胶回收试剂盒回收，并测定DNA浓度。随后使用融合片段进行RED/ET质粒重组：

(1)在培养过夜的菌液中吸取40μL至1mL新鲜的含4μg/mL四环素的LB培养基中，于30℃，200rpm摇菌2h。

(2)使用T4DNA聚合酶对片段进行连接。反应体系如表2所示：

表2反应体系

将上述试剂加入PCR管中，反应条件如表3所示：

表3反应条件

(3)在步骤1所述菌液中加入40μL 10％L-阿拉伯糖溶液，37℃，200rpm摇菌40min；

(4)采用VSWP01300MF-Millipore白色MCE亲水0.025um光面13mm表面滤膜对步骤2所得反应后体系除盐40min；

(5)将步骤3菌液9000rpm离心1min，弃上清液，加入500μL无菌ddH₂O，重悬菌液，9000rpm离心1min，弃上清液，重复2次后弃上清液，加入50μL无菌ddH₂O重悬菌液并置于冰上；

(6)将除盐后的步骤4中的溶液与步骤5处理后的菌液混匀，冰上放置1min；

(7)吸取全部混合物进行电转(电转参数：1350V,200Ω,25mA,1uF)；

(8)加入1mL新鲜的LB液体培养基(灭菌，无抗性)至电转杯中，吹打均匀后吸出至EP管中。37℃，200rpm培养1h；

(9)取50μL菌液涂布至含有50-100ug/ml Amp的LB平板上，37℃培养过夜；

(10)挑单克隆进行PCR验证和测序验证。

实施例2

构建pdc1敲除盒

以酿酒酵母基因组为模板，使用引物PDC1UF/PDC1UR和PDC1DF/PDC1DR扩增pdc1片段基因的上下游500bp的同源臂，使用引物G418F/G418R扩增G418抗性基因片段采用融合PCR的方法，构建pdc1敲除盒测序验证。

引物序列：

PDC1UF的序列为SEQ ID NO.13；PDC1UR的序列为SEQ ID NO.14；G418F的序列为SEQ ID NO.15；G418R的序列为SEQ ID NO.16；PDC1DF的序列为SEQ ID NO.17；PDC1DR的序列为SEQ ID NO.18。

实施例3

构建tyrA表达盒

以酿酒酵母基因组为模板，使用引物PDC1F-YZ/PDC1UF1和上游500bp的同源臂，以实例2中构建的pdc1敲除盒为模板，以引物G418F1/PDCIR-YZ扩增tyrA和pdc1下游500bp的片段，以大肠杆菌BL-21(DE3)基因组为模板，使用引物tyrAF1/tyrAR1扩增基因tyrA片段采用融合PCR的方法，构建tyrA表达盒，测序验证。

引物序列：

PDC1F-YZ的序列为SEQ ID NO.19；PDC1UF1的序列为SEQ ID NO.20；TYRAF1的序列为SEQ ID NO.21；TYRAR1的序列为SEQ ID NO.22；G418F1的序列为SEQ ID NO.23；PDCIR-YZ的序列为SEQ ID NO.24。

实施例5

构建HpaBC表达盒

将SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7的氨基酸序列根据宿主酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，获得SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7对应的优化后核苷酸序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8后，进行基因合成。根据实施例1的方法构建HpaBC表达盒。

实施例6

微生物异源合成酪醇菌株的构建，以酿酒酵母为例：

将实施例1获得的菌株接种于含有液体LB培养基中，在37℃，200rpm条件下培养14h，采用OMEGA质粒提取试剂盒D6943-01，获得pJFE3-PcAAS-ADH重组表达质粒。采用PEG/LiAc法转化酿酒酵母BY4741，利用URA选择培养基进行筛选挑取单克隆，提取质粒，利用引物YZ1F和YZ1R进行PCR验证，获得PcAAS-ADH菌株。并分别将实施例2的pdc1敲除盒和实施例3的tyrA表达盒导入PcAAS-ADH菌株，获得PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA菌株。基于PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA菌株，采用PEG/LiAc法将实施例5中构建的HpaBC表达盒导入dpdc1-tyrA菌株中，获得PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA-HpaBC菌株。

YZ1F的序列为SEQ ID NO.25；YZ1R的序列为SEQ ID NO.26。

实施例7

合成酪醇微生物的发酵，以酿酒酵母为例：

在产酪醇及羟基酪醇的菌株PcAAS-ADH和PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA的平板上挑取单克隆，接种到5mL酵母选择营养缺陷型培养基中，在30-32℃，200rpm条件下培养24h，转接到50mL酵母选择营养缺陷型培养中，初始接种OD600为0.2，30℃，200rpm条件下培养12h后，转接到100mL酵母选择营养缺陷型培养中，初始接种OD600为0.2，分别采用添加葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖和酪氨酸等进行72小时发酵实验。采用文献(Satoh,Tajima et al.2012)报道的HPLC法检测发酵液中酪醇的浓度。不同碳源培养条件下酪醇产量如表4所示。

表4不同碳源下发酵72小时后酪醇的产量

实施例8

合成羟基酪醇微生物的发酵，以酿酒酵母为例：

在产羟基酪醇的菌株PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA-HpaBC的平板上挑取单克隆，接种到5mL酵母选择营养缺陷型培养基中，在30-32℃，200rpm条件下培养24h，转接到50mL酵母选择营养缺陷型培养中，初始接种OD600为0.2，30℃，200rpm条件下培养12h后，转接到100mL酵母选择营养缺陷型培养中，初始接种OD600为0.2，进行发酵实验。采用文献(Satoh,Tajima et al.2012)报道的HPLC法检测发酵液中羟基酪醇的浓度，发酵72小时后获得羟基酪醇的产量为978mg/L。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东恒鲁生物科技有限公司

<120> 一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Gly Ser Ile Asp Asn Leu Thr Glu Lys Leu Ala Ser Gln Phe Pro

1 5 10 15

Met Asn Thr Leu Glu Pro Glu Glu Phe Arg Arg Gln Gly His Met Met

20 25 30

Ile Asp Phe Leu Ala Asp Tyr Tyr Arg Lys Val Glu Asn Tyr Pro Val

35 40 45

Arg Ser Gln Val Ser Pro Gly Tyr Leu Arg Glu Ile Leu Pro Glu Ser

50 55 60

Ala Pro Tyr Asn Pro Glu Ser Leu Glu Thr Ile Leu Gln Asp Val Gln

65 70 75 80

Thr Lys Ile Ile Pro Gly Ile Thr His Trp Gln Ser Pro Asn Phe Phe

85 90 95

Ala Tyr Phe Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ala Gly Phe Leu Gly Glu Met

100 105 110

Leu Ser Thr Gly Phe Asn Val Val Gly Phe Asn Trp Met Val Ser Pro

115 120 125

Ala Ala Thr Glu Leu Glu Asn Val Val Thr Asp Trp Phe Gly Lys Met

130 135 140

Leu Gln Leu Pro Lys Ser Phe Leu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Gly Val

145 150 155 160

Leu Gln Gly Thr Thr Cys Glu Ala Ile Leu Cys Thr Leu Val Ala Ala

165 170 175

Arg Asp Lys Asn Leu Arg Gln His Gly Met Asp Asn Ile Gly Lys Leu

180 185 190

Val Val Tyr Cys Ser Asp Gln Thr His Ser Ala Leu Gln Lys Ala Ala

195 200 205

Lys Ile Ala Gly Ile Asp Pro Lys Asn Phe Arg Ala Ile Glu Thr Thr

210 215 220

Lys Ser Ser Asn Phe Gln Leu Cys Pro Lys Arg Leu Glu Ser Ala Ile

225 230 235 240

Leu His Asp Leu Gln Asn Gly Leu Ile Pro Leu Tyr Leu Cys Ala Thr

245 250 255

Val Gly Thr Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Pro Leu Pro Ala Leu Thr

260 265 270

Glu Val Ala Lys Lys Tyr Asp Leu Trp Val His Val Asp Ala Ala Tyr

275 280 285

Ala Gly Ser Ala Cys Ile Cys Pro Glu Phe Arg Gln Tyr Leu Asp Gly

290 295 300

Val Glu Asn Ala Asp Ser Phe Ser Leu Asn Ala His Lys Trp Phe Leu

305 310 315 320

Thr Thr Leu Asp Cys Cys Cys Leu Trp Val Arg Asn Pro Ser Ala Leu

325 330 335

Ile Lys Ser Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Phe Leu Lys Asn Asn Ala Ser

340 345 350

Glu Thr Asn Lys Val Val Asp Tyr Lys Asp Trp Gln Ile Met Leu Ser

355 360 365

Arg Arg Phe Arg Ala Leu Lys Leu Trp Phe Val Leu Arg Ser Tyr Gly

370 375 380

Val Gly Gln Leu Arg Glu Phe Ile Arg Gly His Val Gly Met Ala Lys

385 390 395 400

Tyr Phe Glu Gly Leu Val Asn Met Asp Lys Arg Phe Glu Val Val Ala

405 410 415

Pro Arg Leu Phe Ser Met Val Cys Phe Arg Ile Lys Pro Ser Ala Met

420 425 430

Ile Gly Lys Asn Asp Glu Asp Glu Val Asn Glu Ile Asn Arg Lys Leu

435 440 445

Leu Glu Ser Val Asn Asp Ser Gly Arg Ile Tyr Val Ser His Thr Val

450 455 460

Leu Gly Gly Ile Tyr Val Ile Arg Phe Ala Ile Gly Gly Thr Leu Thr

465 470 475 480

Asp Ile Asn His Val Ser Ala Ala Trp Lys Val Leu Gln Asp His Ala

485 490 495

Gly Ala Leu Leu Asp Asp Thr Phe Thr Ser Asn Lys Leu Val Glu Val

500 505 510

Leu Ser

<210> 2

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgggttcca ttgataactt gaccgaaaag ttggcttctc agtttccaat gaataccttg 60

gaaccagaag aattcagacg tcaaggtcat atgatgattg atttcttggc cgactactac 120

agaaaggttg aaaattaccc agtcaggtca caagtttctc caggttattt gagagaaatc 180

ttgccagaat ctgctccata caatccagaa tctttggaaa ctatcttgca ggacgttcag 240

accaagatta ttccaggtat tactcattgg cagtccccaa atttctttgc ttactttcca 300

tcttcaggtt ctactgctgg ttttttgggt gaaatgttgt ctactggttt caacgttgtt 360

ggctttaact ggatggtttc accagctgct actgaattgg aaaacgttgt tactgattgg 420

ttcggtaaga tgttgcaatt gccaaagtct ttcttgtttt caggtggtgg tggcggtgtt 480

ttacaaggta ctacttgtga agctattttg tgcactttgg ttgctgctag agataagaac 540

ttgagacaac atggtatgga caacatcggt aagttggttg tttactgttc tgatcaaact 600

cactctgcct tgcaaaaagc tgctaaaatt gctggtattg acccaaagaa cttcagagct 660

attgaaacca ccaagtcctc taactttcaa ttgtgtccaa agagattgga gtctgcaatc 720

ttgcatgact tgcaaaatgg tttgattccc ttgtacttgt gtgctactgt tggtactaca 780

tcttctacta ctgttgatcc attgccagct ttgactgaag ttgctaaaaa gtacgatttg 840

tgggttcatg ttgatgctgc ttatgctggt tctgcttgta tttgtccaga gttcagacaa 900

tacttggatg gtgttgaaaa cgccgattct ttttctttga atgcccataa gtggttcttg 960

actactttgg actgttgttg cttgtgggtt agaaatccat ctgccttgat taagtccttg 1020

tctacttacc cagaattctt gaagaacaac gcctctgaaa ctaacaaggt tgttgattac 1080

aaggactggc agatcatgtt gtcaagaaga ttcagagctt taaagttgtg gttcgtcttg 1140

agatcttatg gtgttggtca attgagagaa ttcatcagag gtcatgttgg tatggctaag 1200

tactttgaag gtttggttaa catggacaag agattcgaag ttgttgctcc taggttgttc 1260

tctatggttt gttttagaat caagccctcc gctatgattg gtaagaatga tgaagatgaa 1320

gtcaacgaga tcaaccgtaa gctattggaa tccgttaatg actctggtag gatctacgtt 1380

tctcatacag ttttaggtgg tatctacgtt atcagattcg ctattggtgg tactttgacc 1440

gatatcaatc atgtttctgc tgcttggaag gtattacaag atcatgctgg tgctttgttg 1500

gatgatactt tcacttctaa caagttggtc gaggtcttgt cttaa 1545

<210> 3

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Gln Val Lys Ala Ala Val Thr Leu Gly Tyr Gln Gln Pro Phe Val

1 5 10 15

Ile Lys Asp Val Glu Val Ala Pro Pro Gly Lys Asp Glu Ile Leu Val

20 25 30

Lys Ile Val Ala Thr Gly Val Cys His Thr Asp Ala Val Met Arg Asp

35 40 45

Asn Pro Gly Val Val Pro Met Pro Ala Ile Leu Gly His Glu Gly Ala

50 55 60

Gly Ile Val Ala Ser Val Gly Glu Ala Val Ser Gly Ile Arg Val Gly

65 70 75 80

Asp His Val Val Leu Ser Tyr Ala Ala Cys His His Cys Glu Asn Cys

85 90 95

Leu Ser Asn His Pro Ser Ala Cys Glu Asp Phe Asn Thr Leu Asn Phe

100 105 110

Gly Gly Arg Arg Glu Asp Gly Thr Thr Pro Tyr Arg Leu Glu Asp Gln

115 120 125

Asp Leu Ser Leu Phe Phe Gly Gln Ser Ser Phe Ser Gln Tyr Val Val

130 135 140

Thr Arg Ala Ser Asn Ala Val Val Val Asp Pro Glu Val Asp Leu Thr

145 150 155 160

Leu Leu Gly Pro Leu Gly Cys Gly Ile Gln Thr Gly Ser Gly Thr Val

165 170 175

Leu Asn Arg Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Ser Leu Val Val Phe Gly

180 185 190

Cys Gly Ala Val Gly Leu Ser Ala Ile Met Ala Ala Lys Leu Thr Gly

195 200 205

Cys Ser Gln Ile Ile Ala Val Asp Ile His Ala Ser Arg Leu Ala Leu

210 215 220

Ala Gly Glu Leu Gly Ala Thr His Gln Ile Asn Gly Lys Glu Gln Asp

225 230 235 240

Ala Val Ala Val Ile Lys Gln Ile Thr Gly Lys Gly Ala His Tyr Ala

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gly Val Ser Ala Ile Val Leu Gln Ala Val His Ala

260 265 270

Val Lys Pro Leu Gly Thr Val Ala Ile Val Gly Phe Thr Gly Asp Ile

275 280 285

Thr Leu Asn Val Gln Asn Asp Leu Met Ala Glu Gly Lys Ser Leu Val

290 295 300

Gly Val Ile Glu Gly Asp Ala Val Pro Ala Leu Phe Ile Pro Leu Leu

305 310 315 320

Val Gln Leu Tyr Lys Gln Gly Lys Phe Pro Ile Asp Lys Leu Ile Ala

325 330 335

Arg Tyr Pro Leu Ala Asp Ile Asn Gln Ala Phe Ala Asp Ser Ala Ser

340 345 350

Gly Lys Val Ile Lys Pro Val Val Val Met

355 360

<210> 4

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgcaagtta aggctgctgt tactttgggt taccaacaac cattcgttat caaggatgtt 60

gaagttgctc caccaggtaa agacgaaatt ttggttaaga tagttgctac cggtgtttgt 120

catactgatg ctgttatgag agataaccca ggtgttgttc caatgccagc tattttgggt 180

catgaaggtg ctggtatagt tgcttctgtt ggtgaagctg tttctggtat tagagttggt 240

gatcacgttg ttttgtctta cgctgcttgt catcattgtg aaaactgctt gtctaatcat 300

ccatctgctt gcgaagattt caacactttg aatttcggtg gtagaagaga agatggtact 360

actccatata gattggaaga tcaggacctg tctttgttct ttggtcaatc ttctttctcc 420

caatacgttg ttactagagc ttctaacgct gttgttgttg atccagaagt tgatttgact 480

ttgttgggtc cattaggttg tggtattcaa actggttctg gtactgtttt gaacagattg 540

aaaccagttg tcggtgaatc cttggttgtt tttggttgtg gtgctgttgg tttgtctgct 600

attatggctg ctaaattgac tggttgctcc caaattattg ccgttgatat tcatgcttcc 660

agattggctt tggctggtga attgggtgct actcatcaaa tcaatggtaa agaacaagat 720

gccgttgccg tcattaagca aattactggt aaaggtgctc attacgctgt tgaaactact 780

ggtgtttctg ctatcgtttt acaagctgtt catgctgtta agccattggg tactgttgct 840

atagttggtt tcactggtga tattaccttg aacgtccaaa acgatttgat ggccgaaggt 900

aaatctttgg ttggtgttat tgaaggtgat gcagttccag ctttgttcat tccattattg 960

gttcagttgt acaagcaagg caagttccca attgataagt tgattgctag atacccattg 1020

gccgatatca atcaagcttt tgctgattct gcttccggta aggttattaa gccagttgtt 1080

gttatgtaa 1089

<210> 5

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Met Lys Pro Glu Asp Phe Arg Ala Ser Thr Gln Arg Pro Phe Thr Gly

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Asp Gly Arg Glu Ile Tyr Ile Tyr

20 25 30

Gly Glu Arg Val Lys Asp Val Thr Thr His Pro Ala Phe Arg Asn Ala

35 40 45

Ala Ala Ser Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Leu His Lys Pro Glu Met

50 55 60

Gln Asp Ser Leu Cys Trp Asn Thr Asp Thr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr

65 70 75 80

His Lys Phe Phe Arg Val Ala Lys Ser Ala Asp Asp Leu Arg His Glu

85 90 95

Arg Asp Ala Ile Ala Glu Trp Ser Arg Leu Ser Tyr Gly Trp Met Gly

100 105 110

Arg Thr Pro Asp Tyr Lys Ala Ala Phe Gly Cys Ala Leu Gly Gly Thr

115 120 125

Pro Gly Phe Tyr Gly Gln Phe Glu Gln Asn Ala Arg Asn Trp Tyr Thr

130 135 140

Arg Ile Gln Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Asn His Ala Ile Val Asn Pro

145 150 155 160

Pro Ile Asp Arg His Leu Pro Thr Asp Lys Val Lys Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Lys Leu Glu Lys Glu Thr Asp Ala Gly Ile Ile Val Ser Gly Ala Lys

180 185 190

Val Val Ala Thr Asn Ser Ala Leu Thr His Tyr Asn Met Ile Gly Phe

195 200 205

Gly Ser Ala Gln Val Met Gly Glu Asn Pro Asp Phe Ala Leu Met Phe

210 215 220

Val Ala Pro Met Asp Ala Asp Gly Val Lys Leu Ile Ser Arg Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Glu Met Val Ala Gly Ala Thr Gly Ser Pro Tyr Asp Tyr Pro Leu

245 250 255

Ser Ser Arg Phe Asp Glu Asn Asp Ala Ile Leu Val Met Asp Asn Val

260 265 270

Leu Ile Pro Trp Glu Asn Val Leu Leu Tyr Arg Asp Phe Asp Arg Cys

275 280 285

Arg Arg Trp Thr Met Glu Gly Gly Phe Ala Arg Met Tyr Pro Leu Gln

290 295 300

Ala Cys Val Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Phe Ile Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Gly Thr Leu Glu Phe Arg Gly Val Gln

325 330 335

Ala Asp Leu Gly Glu Val Val Ala Trp Arg Asn Thr Phe Trp Ala Leu

340 345 350

Ser Asp Ser Met Cys Ser Glu Ala Thr Pro Trp Val Asn Gly Ala Tyr

355 360 365

Leu Pro Asp His Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Val Leu Ala Pro Met

370 375 380

Ala Tyr Ala Lys Ile Lys Asn Ile Ile Glu Arg Asn Val Thr Ser Gly

385 390 395 400

Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Ser Ala Arg Asp Leu Asn Asn Pro Gln Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Leu Ala Lys Tyr Val Arg Gly Ser Asn Gly Met Asp His

420 425 430

Val Gln Arg Ile Lys Ile Leu Lys Leu Met Trp Asp Ala Ile Gly Ser

435 440 445

Glu Phe Gly Gly Arg His Glu Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Ser Gly Ser

450 455 460

Gln Asp Glu Ile Arg Leu Gln Cys Leu Arg Gln Ala Gln Ser Ser Gly

465 470 475 480

Asn Met Asp Lys Met Met Ala Met Val Asp Arg Cys Leu Ser Glu Tyr

485 490 495

Asp Gln Asn Gly Trp Thr Val Pro His Leu His Asn Asn Asp Asp Ile

500 505 510

Asn Met Leu Asp Lys Leu Leu Lys

515 520

<210> 6

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgaaaccag aagatttccg cgccagtacc caacgtccgt tcaccgggga agagtatctg 60

aaaagcctgc aggatggtcg cgagatctat atctatggcg agcgagtgaa agacgtcact 120

actcatccgg catttcgtaa tgcggctgcg tctgttgccc aactgtacga cgcgctacac 180

aaaccggaga tgcaggactc tctgtgctgg aacaccgaca ccggcagcgg cggctatacc 240

cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccacgaacg cgatgccatc 300

gctgagtggt cacgcctgag ctatggctgg atgggccgta ccccagacta caaagctgct 360

ttcggttgcg cactgggcgg aactccgggc ttttacggtc agttcgagca gaacgcccgt 420

aactggtaca cccgtattca ggaaactggc ctctacttta accacgcgat tgttaaccca 480

ccgatcgatc gtcatttgcc gaccgataaa gtaaaagacg tttacatcaa gctggaaaaa 540

gagactgacg ccgggattat cgtcagcggt gcgaaagtgg ttgccaccaa ctcggcgctg 600

actcactaca acatgattgg cttcggctcg gcacaagtaa tgggcgaaaa cccggacttc 660

gcactgatgt tcgttgcgcc aatggatgcc gatggcgtca aattaatctc ccgcgcctct 720

tatgagatgg tcgcgggtgc taccggctca ccgtatgact acccgctctc cagccgcttc 780

gatgagaacg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga tcccatggga aaacgtgctg 840

ctctaccgcg attttgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt cgcccgtatg 900

tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaactcg acttcattac ggcactgctg 960

aaaaaatcac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 1020

gaagtggtgg cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttctgaagcg 1080

acgccgtggg tcaacggggc ttatttaccg gatcatgccg cactgcaaac ctatcgcgta 1140

ctggcaccaa tggcctacgc gaagatcaaa aacattatcg aacgcaacgt taccagtggc 1200

ctgatctatc tcccttccag tgcccgtgac ctgaacaatc cgcagatcga ccagtatctg 1260

gcgaagtatg tgcgcggttc gaacggtatg gatcacgtcc agcgcatcaa gatcctcaaa 1320

ctgatgtggg atgccattgg cagcgagttt ggtggtcgtc acgaactgta tgaaatcaac 1380

tactccggta gccaggatga gattcgcctg cagtgtctgc gccaggcaca aagctccggc 1440

aatatggaca agatgatggc gatggttgat cgctgcctgt cggaatacga ccagaacggc 1500

tggactgtgc cgcacctgca caacaacgac gatatcaaca tgctggataa gctgctgaaa 1560

taa 1563

<210> 7

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Met Gln Leu Asp Glu Gln Arg Leu Arg Phe Arg Asp Ala Met Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ala Val Asn Ile Ile Thr Thr Glu Gly Asp Ala Gly Gln

20 25 30

Cys Gly Ile Thr Ala Thr Ala Val Cys Ser Val Thr Asp Thr Pro Pro

35 40 45

Ser Leu Met Val Cys Ile Asn Ala Asn Ser Ala Met Asn Pro Val Phe

50 55 60

Gln Gly Asn Gly Lys Leu Cys Val Asn Val Leu Asn His Glu Gln Glu

65 70 75 80

Leu Met Ala Arg His Phe Ala Gly Met Thr Gly Met Ala Met Glu Glu

85 90 95

Arg Phe Ser Leu Ser Cys Trp Gln Lys Gly Pro Leu Ala Gln Pro Val

100 105 110

Leu Lys Gly Ser Leu Ala Ser Leu Glu Gly Glu Ile Arg Asp Val Gln

115 120 125

Ala Ile Gly Thr His Leu Val Tyr Leu Val Glu Ile Lys Asn Ile Ile

130 135 140

Leu Ser Ala Glu Gly His Gly Leu Ile Tyr Phe Lys Arg Arg Phe His

145 150 155 160

Pro Val Met Leu Glu Met Glu Ala Ala Ile

165 170

<210> 8

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgcaattag atgaacaacg cctgcgcttt cgtgacgcaa tggccagcct gtcggcagcg 60

gtaaatatta tcaccaccga gggcgacgcc ggacaatgcg ggattacggc aacggccgtc 120

tgctcggtca cggatacacc accatcgctg atggtgtgca ttaacgccaa cagtgcgatg 180

aacccggttt ttcagggcaa cggtaagttg tgcgtcaacg tcctcaacca tgagcaggaa 240

ctgatggcac gccacttcgc gggcatgaca ggcatggcga tggaagagcg ttttagcctc 300

tcatgctggc aaaaaggtcc gctggcgcag ccggtgctaa aaggttcgct ggccagtctt 360

gaaggtgaga tccgcgatgt gcaggcaatt ggcacacatc tggtgtatct ggtggagatt 420

aaaaacatca tcctcagtgc agaaggtcac ggacttatct actttaaacg ccgtttccat 480

ccggtgatgc tggaaatgga agctgcgatt taa 513

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aagcgtgaca taactaatta catgattaag acaagacctc gaccaacttg 50

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gaataaacac acataaacaa acaaaatggg ttccattgat aacttgaccg 50

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttttaattac aaaggatcct ctagaatgca agttaaggct gctgttactt 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tctatcgatt tcaattcaat tcaatttaca taacaacaac tggcttaata 50

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ttatgtatgc tcttctgact tttcg 25

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gggacgaggc aagctaaaca gatcttttga ttgatttgac tgtgttattt 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

aaataacaca gtcaaatcaa tcaaaagatc tgtttagctt gcctcgtccc 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

tataaaactt taactaataa ttagagagag ctcgttttcg acactggatg 50

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

catccagtgt cgaaaacgag ctctctctaa ttattagtta aagttttata 50

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tttcaatcat tggagcaatc att 23

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ttatgtatgc tcttctgact tttcg 25

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

aatgcggtca attcagcaac cattttgatt gatttgactg tgttatt 47

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aataacacag tcaaatcaat caaaatggtt gctgaattga ccgcatt 47

<210> 22

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

acataactaa ttacatgatt aattaattac tggcgattgt cattcgc 47

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gcgaatgaca atcgccagta attaattaat catgtaatta gttatgt 47

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tttcaatcat tggagcaatc atttt 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

cggtcttcaa tttctcaagt ttcag 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

gcaattaatg tgagttagct cactc 25

Claims

1.一种生产酪醇的酵母，其特征在于：具体步骤为：将来源于香芹的酪氨酸脱羧酶和来源于肠杆菌属的醇脱氢酶的DNA序列导入酵母BY4741，得到PcAAS-ADH重组酵母。

2.根据权利要求1所述生产酪醇的酵母，其特征在于：酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；酪氨酸脱羧酶的DNA序列为SEQ ID NO.2，能够表达SEQ ID NO.1所示氨基酸序列；醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；醇脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO.4，能够表达SEQ ID NO.3所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述生产酪醇的酵母，其特征在于：在权利要求1所述PcAAS-ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒，得到PcAAS-ADH-pdc1重组酵母；所述pdc1基因敲除盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物分别扩增pdc1片段的上下游500bp同源臂，利用引物扩增G418抗性基因片段，将所述上下游500bp同源臂和G418抗性基因片段融合得到pdc1敲除盒。

4.根据权利要求3所述的生产酪醇的酵母，其特征在于：在权利要求3所述PcAAS-ADH-Δpdc1重组酵母中导入tyrA表达盒，得到PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母；所述tyrA表达盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物扩增上游500bp的同源臂，以权利要求4所述pdc1敲除盒为模板，利用引物扩增tyrA片段，将上游500bp的同源臂和tyrA片段融合构建tyrA表达盒。

5.一种生产羟基酪醇的酵母，其特征在于：将来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸羟化酶的DNA序列基因簇导入权利要求5所述PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母中，得到生产羟基酪醇的PcAAS-ADH-HpaBC-Δpdc1-tyrA重组酵母。

6.根据权利要求7所述的生产羟基酪醇的酵母，其特征在于：所述4-羟基苯乙酸羟化酶的氨基酸序列基因簇包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7；4-羟基苯乙酸羟化酶的DNA序列基因簇为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8，分别能够表达SEQ ID NO.5所示氨基酸序列和SEQ IDNO.7所示氨基酸序列。

7.一种生产酪醇的酵母的构建方法，其特征在于：具体步骤为：

2)构建权利要求4所述pdc1敲除盒；

3)构建权利要求6所述tyrA表达盒；

优选的，步骤1)中的表达载体为pJFE3、pUC19、pδBLE2.0、pGK系列载体、pXP318；

进一步优选的，载体为pJFE3。

8.一种生产羟基酪醇的酵母的构建方法，其特征在于：具体步骤为：

1)将HpaB和HpaC基因合成构建HpaBC表达盒；

9.权利要求1-4所述生产酪醇的酵母和权利要求7所述的生产酪醇的酵母的构建方法在生产酪醇中的应用；

所述应用的具体方式为将所述生产酪醇的酵母进行发酵培养得到酪醇；所述发酵培养的培养液为葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖和酪氨酸混合物中的一种或者它们的混合物。

10.权利要求5-6所述生产酪醇的酵母和权利要求8所述的生产羟基酪醇的酵母的构建方法在生产羟基酪醇中的应用；