CN109988722A

CN109988722A - 一种重组酿酒酵母菌株及其应用和生产酪醇和/或红景天苷的方法

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Publication number: CN109988722A
Application number: CN201711479443.3A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 江晶洁; 殷华; 庄以彬; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN109988722B

Abstract

本发明提供了一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株及其应用，属于基因工程技术领域。一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株，外源基因包括AROL基因、PcAAS基因、AtUgt85A1基因、ARO4*基因和ARO7*基因。本发明中将酪醇和/或红景天苷的生物合成途径中五个关键酶编码基因导入酿酒酵母中，使这些基因在酿酒酵母中进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇和红景天苷的生物合成，从而实现酿酒酵母由葡萄糖从头合成酪醇和红景天苷的途径构建。

Description

一种重组酿酒酵母菌株及其应用和生产酪醇和/或红景天苷的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组酿酒酵母菌株及其应用和生产酪醇和/或红景天苷的方法。

背景技术

红景天为多年生草本植物，生长环境非常恶劣，主要生长在高寒、干燥、强紫外线照射、昼夜温差大的地区，具有极强的环境适应能力和生命力，属于珍贵的中药和藏药。红景天苷是植物红景天的主要活性成分，具有抗疲劳、抗缺氧、抗辐射、提高人体机能等多种功效。除此之外，红景天苷还具有保护肾脏功能、保护心血管系统、保护中枢神经系统、改善认知功能障碍等药理作用。

红景天苷(Salidroside)具有以下特征：化学名称为2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C₁₄H₂₀O₇，分子量为300.304，CAS号为10338-51-9，结构式为：

红景天苷元酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为

4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为C₈H₁₀O₂，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式为：

红景天苷及苷元酪醇具有抗疲劳、抗衰老作用，能明显减少自由基产生，降低其氧化能力。红景天苷通过提高肝组织胶原酶mRNA表达而促进I、III型胶原的降解来抵抗肝纤维化，同时红景天苷对人肝癌细胞有一定的诱导分化作用。此外，红景天苷及苷元酪醇对活性氧致心肌细胞损伤的保护作用。基于红景天苷及苷元酪醇具有多方面的药理作用，市场对红景天苷的需求量越来越大。

红景天属各种植物中红景天苷的含量各不相同，红景天地上部分和地下部分在植物生长的不同周期，红景天苷含量不同。天然红景天苷多是用甲醇提取，但是由于环境恶化和人为过度采挖，野生红景天的数量迅速减少，其化学合成、微生物转化、愈伤组织培养，生物合成均成为研究的热点。明海泉等人报道以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖为原料，以Ag₂CO₃为催化剂，成功合成了红景天甙(明海泉,红景天甙合成及药理作用,药学通报,1986,21(6):373)。但是化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化。王梦亮等人以D-葡萄糖和酪醇为底物，探索出了一种借助于微生物合成红景天甙的方法(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D-葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天甙的初步研究，催化学报，2006,27(3):233-236)。微生物转化效率较低，需要添加外源底物。用致密愈伤组织体系研究红景天苷高产率的培养条件。从高山红景天的根、茎、叶、子叶等分离体得到的相应的几种愈伤组织，并对其生长速度、红景天苷量和培养繁殖条件进行筛选，确定了生成高产出率红景天苷的最佳条件，红景天苷最高收获率可达到干重57.72mg/g，为野生植株的5～10倍(Wu S,ZuY,WuM Highyieldproductionofsalidroside inthe suspension cultureofRhodiolasachalinensis[J]JBiotechnol,2003,106(1):331)。但是植物组织培养反应周期长，效价较低。白艳芬等人在大肠杆菌表达菌株中生物合成酪醇和/或红景天苷的方法，酪醇的产量可达600mg/L，红景天苷的产量可达50mg/L(Bai,Y.etal.Productionofsalidroside inmetabolically engineeredEscherichiacoli.Sci.Rep.4,6640)。虽然利用大肠杆菌表达菌株能够生物合成得到酪醇和/或红景天苷，但是其产量较低。就安全性而言，大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应，使得开发有利于人体健康的酪醇、红景天苷一类产品及其衍生物平台具有一定的挑战性。红景天苷在食品、化妆品、医药保健品等行业具有广泛的应用前景，具有安全保障的红景天苷的高产是人们一直以来的诉求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组酿酒酵母菌株及其应用和酪醇和/或红景天苷的生产方法，所述重组酿酒酵母菌株在生产酪醇和/或红景天苷方面有极高的产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母菌株中外源基因包括AROL基因、PcAAS基因、AtUgt85A1基因、ARO4*基因和ARO7*基因。

优选的，所述ARO4*基因具有如序列表中SEQ ID No：1所示核苷酸序列；所述ARO7*基因具有如序列表中SEQ ID No：2所示核苷酸序列。

优选的，所述外源基因整合在酿酒酵母菌株基因组上。

优选的，所述外源基因以TEF1-AROL-CYC1t，TDH3-ARO7*-TEF1t，PGK1-ARO4*-ADH1t和TDH3-PcAAS-TEF1t-PGK1-AtUGT85A1-ADH1t为整合片段的形式整合在酿酒酵母菌株基因组上。

优选的，所述外源基因以重组质粒的形式转入酿酒酵母菌种；其中第一重组质粒包含有ARO4*、ARO7*和AROL基因；第二重组质粒包含有PcAAS和AtUgt85A1。

优选的，所述第一重组质粒为pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*；所述第二重组质粒为pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1。

本申请提供了所述重组酿酒酵母菌株在生产酪醇和/或红景天苷中的应用。

本发明提供了基于所述重组酿酒酵母菌株生产酪醇和/或红景天苷的方法，包括以下步骤：

1)将所述的重组酿酒酵母菌株接种至培养基中，在30～32℃下培养10～16小时，得到重组酿酒酵母种子液；

2)将步骤1)中得到的重组酿酒酵母种子液接种至新的培养基中，并在30～32℃下进行发酵培养72～216h，得到酪醇和/或红景天苷。

优选的，所述步骤1)和步骤2)中培养基为筛选培养基；所述筛选培养基为以尿嘧啶及亮氨酸营养缺陷作为筛选标记的SC液体培养基。

优选的，所述步骤1)和步骤2)中接种量为1％～2％。

优选的，所述步骤2)中发酵培养的时间为96～200h。

本发明提供了一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株，包括AROL基因、PcAAS基因和AtUgt85A1基因、ARO4*基因和ARO7*基因。本发明中将酪醇和/或红景天苷的生物合成途径中五个关键酶基因导入酿酒酵母中，使这些基因在重组酿酒酵母中进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇和红景天苷的生物合成，从而实现酿酒酵母由葡萄糖从头合成酪醇和红景天苷的途径构建。得到高产红景天苷及苷元酪醇的酿酒酵母，将红景天苷与酪醇的生物合成途径有机地结合在一起，能够显著提高红景天苷的产量，最终红景天苷产量达到227mg/L，酪醇产量达到970mg/L。

同时，酿酒酵母既具有类似原核生物的生长特性(易培养、繁殖快、便于遗传操作等)，又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。作为人类利用最早的微生物，和人类的生活极其密切，是酿造、食品、饲料等领域应用最广泛的工业微生物，为开发有利于人体健康的酪醇、红景天苷一类产品及其衍生物提供了重要的平台。

附图说明

图1为本发明的在重组酿酒酵母菌株中生物合成酪醇和红景天苷的途径示意图；

图2为实施例4中菌株BY4742-M5，BY4742-IM5的发酵产物的HPLC结果，图2-1是BY4742-M5的发酵产物，图2-2是BY4742-IM5的发酵产物，其中峰I为酪醇峰，峰II为红景天苷峰；

图3为实施例4中菌株BY4742-M5，BY4742-IM5的发酵产物的红景天苷峰(峰II)的MS图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株，重组酿酒酵母菌株中外源基因包括PcAAS基因、AtUgt85A1基因、AROL基因、ARO4*基因和ARO7*基因。

本发明中，所述ARO4*基因和ARO7*基因是在ARO4基因和ARO7基因的基础上参考文献《Establishment of a yeast platform strain for production of p-coumaric acidthrough metabolic engineering of aromatic amino acid biosynthesis》中公开的方法得到的突变基因。ARO4*(K229L)定点突变的方法如下：以BY4742酿酒酵母基因组为模板，以ARO4*-UP-F、ARO4*-UP-R引物扩增ARO4*-UP片段，以ARO4*-DOWN-F、ARO4*-DOWN-R为引物扩增ARO4*-DOWN片段，以ARO4*-UP，ARO4*-DOWN两个片段为模板，通过融合PCR的方法扩增得到ARO4*片段。所述ARO4*基因具有如序列表中SEQ ID No：1所示核苷酸序列；所述ARO7*基因具有如序列表中SEQ ID No：2所示核苷酸序列。

ARO7*(G141S)定点突变：以BY4742酿酒酵母基因组为模板，以ARO7*-UP-F、ARO7*-UP-R引物扩增ARO7*-UP片段，以ARO7*-DOWN-F、ARO7*-DOWN-R为引物扩增ARO7*-DOWN片段，以ARO7*-UP，ARO7*-DOWN两个片段为模板，通过融合PCR的方法扩增得到ARO7*片段。

在本发明中，上述引物序列见表1。

表1 ARO4*和ARO7*定点突变中涉及的引物序列

PCR反应体系：5×Q5缓冲液10μl，2mM dNTP 5μl，10μM正向引物2.5μl，10μM反向引物2.5μl，模板各1μl，Q5高保真DNA聚合酶0.5μl，水27.5μl。反应程序为：96～98℃预变性30秒；96-98℃变性10～20秒，55～60℃退火30～60秒，72℃延伸30-120秒，28～32个循环；72℃延伸2-10分钟。优选为：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸2分钟，得到DNA目的片段。

所述ARO4基因来源于酿酒酵母BY4742的3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP)合酶(Chromosome II，721682..717994)；所述ARO7基因为分支酸变位酶(Chromosome XVI，674861..675631)。所述AROL基因来自大肠杆菌MG1655的莽草酸激酶(406405..406929)。所述AROL基因具有如序列表中SEQ ID No：3所示核苷酸序列。所述基因ARO4，ARO7，AROL为酪氨酸代谢途径的相关基因。

本发明中，所述基因PcAAS是由酪氨酸合成酪醇过程中的相关基因，优选来自植物欧芹中的芳香醛合酶。基因AtUGT85A1为由酪醇合成红景天苷过程中的相关基因，优选来自植物拟南芥中的UDP-葡萄糖基转移酶。为了提高PcAAS和AtUGT85A1的表达量，还对PcAAS和AtUGT85A1进行酿酒酵母密码子偏好性优化。优化后的PcAAS基因具有如序列表中SEQ IDNo：4所示核苷酸序列；优化后的AtUgt85A1基因具有如序列表中SEQ ID No：5所示核苷酸序列。

本发明提供了的重组酿酒酵母菌株优选包括两种菌株。一种菌株为所述外源基因以重组质粒的形式转入酿酒酵母菌种，即为重组酒酵母菌株-M5；另一种菌株为所述外源基因整合在酿酒酵母基因组上的菌株，记为重组酒酵母菌株-IM5。

在本发明中，所述重组酒酵母菌株-IM5中，外源基因以TEF1-AROL-CYC1t，TDH3-ARO7*-TEF1t，PGK1-ARO4*-ADH1t和TDH3-PcAAS-TEF1t-PGK1-AtUGT85A1-ADH1t为整合片段的形式整合在酿酒酵母菌株基因组上。

在本发明中，所述重组酒酵母菌株M5中第一重组质粒优选包含有ARO4*、ARO7*和AROL基因；第二重组质粒优选包含有PcAAS和AtUgt85A1。第一重组质粒优选为pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*。所述第二重组质粒优选pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1。本发明中，酿酒酵母菌株优选为BY4742或BY4741。本发明对所述酿酒酵母菌株的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的所述酿酒酵母菌株的来源即可。

本发明中，所述酿酒酵母菌株M5的制备方法，优选包括：重组质粒pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*的构建方法和重组质粒pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1的构建方法；

制备的重组质粒pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*和重组质粒pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1按照常规方法转化入酿酒酵母中，形成酿酒酵母菌株-M5。

在本发明中，所述重组质粒pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*的构建方法包括以下步骤：

I.以酵母基因组DNA为模板，用引物ScTEF1-AvrII和ScTEF1-AtaII，PCR扩增TEF1启动子，得到的TEF1启动子PCR产物和pESC-URA3用AvrII和AtaII酶切，连接，得pESC-URA3-TEF1；

以酵母基因组DNA为模板，用引物TDH3-EcoRI和TDH3-BamHI进行PCR扩增TDH3启动子，将得到的TDH3启动子PCR产物用EcoRI和BamHI酶切，得到TDH3启动子酶切片段；

以酵母基因组DNA为模板，用引物PGK1-EcoRI和PGK1-SpeI进行PCR扩增PGK1启动子，得到的PGK1启动子用EcoRI和SpeI酶切，得到PGK1启动子酶切片段；

以BamHI和SpeI酶切所述pESC-URA3-TEF1，回收质粒片段；将酶切后的pESC-URA3-TEF1片段与所述TDH3启动子酶切片段和PGK1启动子酶切片段连接，得质粒pESC-URA3-TEF1-TDH3-PGK1；

II.在所述质粒pESC-URA3-TEF1-TDH3-PGK1的多克隆位点SpeI/BglII插入基因ARO4*，在多克隆位点SalI/HindIII插入基因ARO7*，在多克隆位点AatII/NheI插入基因AROL，得重组质粒pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*。

本发明中，所述重组质粒pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1的构建方法，包括以下步骤：

(1)将上述方案中得到的质粒pESC-URA3-TEF1-TDH3-PGK1和pESC-LEU2分别用PacI和NheI双酶切，用连接酶连接相应切口，得到重组质粒pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PGK1；

(2)在所述重组质粒pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PGK1的多克隆位点SpeI/BglII处插入基因AtUGT85A1，在多克隆位点SalI/HindIII处插入基因PcAAS，得到重组质粒pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1。

本发明中，所述酿酒酵母载体pESC-URA3，pESC-LEU2的来源没有限制，采用本领域技术人员所熟知的来源即可。本发明实施例中，所述酿酒酵母载体pESC-URA3，pESC-LEU2购自Addgene。

本发明中，所述酿酒酵母菌株-IM5的制备方法，优选包括以下步骤：

①以上述方案得到的质粒pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*为模板，用引物Chr-URA3-F，Chr-URA3-R，ARO4*-F,ARO4*-R，ARO7*-F,ARO7*-R，AROL-F，AROL-R进行PCR扩增，得到URA3模块，TEF1-AROL-CYC1t，TDH3-ARO7*-TEF1t，PGK1-ARO4*-ADH1t，整合到酵母基因组中，得到酿酒酵母菌株-IM3；

②以模块形式实现多基因整合，以引物Delta-LEU2-F，Delta-LEU2-R，PcAAS-AtUGT85A1-F，PcAAS-AtUGT85A1-R，以质粒pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1为模板，PCR扩增URA3模块，TDH3-PcAAS-TEF1t-PGK1-AtUGT85A1-ADH1t，PGK1-ARO4*-ADH1t，整合到基因组中，得到酿酒酵母菌株-IM5。

本发明中，所述PCR扩增反应体系，优选为：5×Q5缓冲液10μl，2mM dNTP 5μl，10μM正向引物2.5μl，10μM反向引物2.5μl，模板1μl，Q5DNA聚合酶0.5μl，水28.5μl。扩增程序如下：96～98℃预变性30秒；96～98℃变性10～20秒，55～60℃退火30-60秒，72℃延伸30～120秒，28～32个循环；72℃延伸2～10分钟，优选为：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸2分钟。

本发明中，所述引物见表2。

表2引物序列一览表

在本发明中，所述引物均委托深圳华大基因科技有限公司合成。

本发明对所述酶切的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酶切方法即可。

本申请提供了所述的重组酿酒酵母菌株在生产酪醇和/或红景天苷中的应用。

本发明中，所述酪醇和/或红景天苷的生产方法，优选包括以下步骤：

本发明中，所述培养基为筛选培养基。所述筛选培养基优选为以尿嘧啶及亮氨酸营养缺陷作为筛选标记的SC液体培养基。

本发明中，所述步骤1)和步骤2)中的接种量优选为1％～2％。

本发明中，所述步骤2)中发酵培养的时间优选为96～200h，更优选为180h。

从发酵产物中通过HPLC-MS分析检测方法得到纯净的目标产物。

下面结合实施例对本发明提供的一种生产酪醇和/或红景天苷的酿酒酵母菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

酿酒酵母表达菌株BY4742-M5的构建

将质粒pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*，pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1用化学转化的方法转入酿酒酵母BY4742菌株中。

所述转化方法具体为：取100μl酿酒酵母感受态，离心去上清，加入240μl 50％的PEG3350，36μl的1M LiAc，100μg的鲑鱼精，pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*，pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1质粒各10μl，最后用水补齐至360μl体系，轻轻混匀后，30℃培养箱培养30分钟后，42℃热激40分钟，取出后，离心去上清，加水混匀涂布在含有尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷的SC平板上。利用尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型筛选同时携带两种表达载体的转化菌株，命名为BY4742-M5，并通过菌落PCR扩增进行质粒验证，得到酪醇及红景天苷生物合成途径的酿酒酵母表达载体菌株BY4742-M5。

实施例2

本实施例用于说明酿酒酵母表达菌株BY4742-IM5的构建

(1)以Chr-URA3-F，Chr-URA3-R，ARO4*-F,ARO4*-R，ARO7*-F，ARO7*-R，AROL-F，AROL-R为引物扩增基因整合片段URA3，TEF1-AROL-CYC1t，TDH3-ARO7*-TEF1tPGK1-ARO4*-ADH1t。PCR反应体系：5×Q5缓冲液10μl，2mM dNTP 5μl，10μM正向引物2.5μl，10μM反向引物2.5μl，模板1μl，Q5高保真DNA聚合酶0.5μl，水28.5μl。反应程序为：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸2分钟，得到DNA目的片段。

(2)将PCR扩增条带用化学转化的方法转入酿酒酵母BY4742菌株中，所述转化方法具体为：取100μl感受态酿酒酵母，离心去上清，加入240μl 50％的PEG3350，36μl的1MLiAc，100μg的鲑鱼精，基因整合片段TEF1-AROL-CYC1t，TDH3-ARO7*-TEF1t，PGK1-ARO4*-ADH1t各100ng，最后用水补齐至360μl体系，轻轻混匀后，30℃培养箱培养30分钟后，42℃热激40分钟，取出后，离心去上清，加水混匀涂布在含有尿嘧啶缺陷的SC平板上，筛选阳性克隆，命名为BY4742-IM3。

(3)以引物Delta-LEU2-F，Delta-LEU2-R，PcAAS-AtUGT85A1-F，PcAAS-AtUGT85A1-R为引物扩增基因整合片段LEU2，TDH3-PcAAS-TEF1t-PGK1-AtUGT85A1-ADH1t。PCR反应体系：5×Q5缓冲液10μl，2mM dNTP 5μl，10μM正向引物2.5μl，10μM反向引物2.5μl，模板1μl，Q5高保真DNA聚合酶0.5μl，水28.5μl。反应程序为98℃预变性30秒；98℃变性10秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸2分钟，得到DNA目的片段。

(4)将PCR扩增条带用化学转化的方法转入酿酒酵母BY4742-IM3菌株中，所述转化方法具体为：取100μl感受态酿酒酵母，离心去上清，加入240μl 50％的PEG3350，36μl的1MLiAc，100μg的鲑鱼精，基因整合片段LEU2，TDH3-PcAAS-TEF1t-PGK1-AtUGT85A1-ADH1t各100ng，最后用水补齐至360μl体系，轻轻混匀后，30℃培养箱培养30分钟后，42℃热激40分钟，取出后，离心去上清，加水混匀涂布在含有尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷的SC平板上，筛选阳性克隆，命名为BY4742-IM5。通过菌落PCR扩增验证基因整合菌株，最终获得高产红景天苷及酪醇的酿酒酵母重组菌株。

实施例3

酿酒酵母表达菌株的发酵培养过程

将菌株BY4742-M5，BY4742-IM5分别在3mL的尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型液体培养基中，30℃培养16h，得到种子液。然后将种子液按照1:50的转接量(1mL)分别转接入50mL的液体培养基中，30℃培养，连续培养96h，得到产酪醇和红景天苷的发酵液1和2。

实施例4

酪醇和红景天苷的检测方法

产物HPLC-MS检测与分析：取实施例3中的发酵液1和2，各离心12000rpm离心5min后，取上清，进行HPLC-MS分析检测。分析条件如下：LC-MS检测系统配有紫外检测器的安捷伦1260系统和配有ESI例子源探microQ-TOF II质谱仪。液相色谱柱为Agela InnovalMPC18柱(4.6×250mm)；UV检测波长为224nm；流动相A＝H₂O(含0.1％甲酸)，B＝100％甲醇；流速＝1mL/min，检测条件为：0-25min 20％B，26-45min 20％B到100％B(26-45min内B的浓度均匀增加)；进样量20μl；ESI负离子源，分子量扫描范围50-800。

发酵液1和发酵液2的结果见图2。发酵液1(BY4742-M5)和发酵液2(BY4742-IM5)中均出现了两个峰I和II，峰I与标品酪醇出峰时间一致，峰II与标品红景天苷出峰时间一致。红景天苷的MS结果见图3。

经测定发酵液1中红景天苷的产量是75mg/L，酪醇的产量是412mg/L。发酵液2中红景天苷的产量是227mg/L，酪醇的产量是970mg/L。因此，本发明提供了高产酪醇及红景天苷的生物合成途径的酿酒酵母重组菌株，为酪醇及红景天苷的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种重组酿酒酵母菌株及其应用和生产酪醇和/或红景天苷的方法

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtgaat ctccaatgtt cgctgccaac ggcatgccaa aggtaaatca aggtgctgaa 60

gaagatgtca gaattttagg ttacgaccca ttagcttctc cagctctcct tcaagtgcaa 120

atcccagcca caccaacttc tttggaaact gccaagagag gtagaagaga agctatagat 180

attattaccg gtaaagacga cagagttctt gtcattgtcg gtccttgttc catccatgat 240

ctagaagccg ctcaagaata cgctttgaga ttaaagaaat tgtcagatga attaaaaggt 300

gatttatcca tcattatgag agcatacttg gagaagccaa gaacaaccgt cggctggaaa 360

ggtctaatta atgaccctga tgttaacaac actttcaaca tcaacaaggg tttgcaatcc 420

gctagacaat tgtttgtcaa cttgacaaat atcggtttgc caattggttc tgaaatgctt 480

gataccattt ctcctcaata cttggctgat ttggtctcct tcggtgccat tggtgccaga 540

accaccgaat ctcaactgca cagagaattg gcctccggtt tgtctttccc agttggtttc 600

aagaacggta ccgatggtac cttaaatgtt gctgtggatg cttgtcaagc cgctgctcat 660

tctcaccatt tcatgggtgt tactttgcat ggtgttgctg ctatcaccac tactaagggt 720

aacgaacact gcttcgttat tctaagaggt ggtaaaaagg gtaccaacta cgacgctaag 780

tccgttgcag aagctaaggc tcaattgcct gccggttcca acggtctaat gattgactac 840

tctcacggta actccaataa ggatttcaga aaccaaccaa aggtcaatga cgttgtttgt 900

gagcaaatcg ctaacggtga aaacgccatt accggtgtca tgattgaatc aaacatcaac 960

gaaggtaacc aaggcatccc agccgaaggt aaagccggct tgaaatatgg tgtttccatc 1020

actgatgctt gtataggttg ggaaactact gaagacgtct tgaggaaatt ggctgctgct 1080

gtcagacaaa gaagagaagt taacaagaaa taa 1113

<210> 2

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggatttca caaaaccaga aactgtttta aatctacaaa atattagaga tgaattagtt 60

agaatggagg attcgatcat cttcaaattt attgagaggt cgcatttcgc cacatgtcct 120

tcagtttatg aggcaaacca tccaggttta gaaattccga attttaaagg atctttcttg 180

gattgggctc tttcaaatct tgaaattgcg cattctcgca tcagaagatt cgaatcacct 240

gatgaaactc ccttctttcc tgacaagatt cagaaatcat tcttaccgag cattaactac 300

ccacaaattt tggcgcctta tgccccagaa gttaattaca atgataaaat aaaaaaagtt 360

tatattgaaa agattatacc attaatttcg aaaagagatg gtgatgataa gaataacttc 420

agttctgttg ccactagaga tatagaatgt ttgcaaagct tgagtaggag aatccacttt 480

ggcaagtttg ttgctgaagc caagttccaa tcggatatcc cgctatacac aaagctgatc 540

aaaagtaaag atgtcgaggg gataatgaag aatatcacca attctgccgt tgaagaaaag 600

attctagaaa gattaactaa gaaggctgaa gtctatggtg tggaccctac caacgagtca 660

ggtgaaagaa ggattactcc agaatatttg gtaaaaattt ataaggaaat tgttatacct 720

atcactaagg aagttgaggt ggaatacttg ctaagaaggt tggaagagta a 771

<210> 3

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac ggtcggaatg 60

gcccttgccg attcgcttaa ccgtcggttt gtcgataccg atcagtggtt gcaatcacag 120

ctcaatatga cggtcgcgga gatcgtcgaa agggaagagt gggcgggatt tcgcgccaga 180

gaaacggcgg cgctggaagc ggtaactgcg ccatccaccg ttatcgctac aggcggcggc 240

attattctga cggaatttaa tcgtcacttc atgcaaaata acgggatcgt ggtttatttg 300

tgtgcgccag tatcagtcct ggttaaccga ctgcaagctg caccggaaga agatttacgg 360

ccaaccttaa cgggaaaacc gctgagcgaa gaagttcagg aagtgctgga agaacgcgat 420

gcgctatatc gcgaagttgc gcatattatc atcgacgcaa caaacgaacc cagccaggtg 480

atttctgaaa ttcgcagcgc cctggcacag acgatcaatt gttga 525

<210> 4

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggttcta ttgataactt gactgaaaaa ttggcttctc aatttccaat gaatactttg 60

gaaccagaag aatttcgtag acaaggtcac atgatgattg attttctagc tgattattac 120

aggaaggttg aaaattatcc agttagatca caagtttctc caggttattt gagagaaatt 180

ttgccagaat ctgctccata taatccagaa tctttggaaa caattctgca agatgttcaa 240

actaaaatca tcccaggtat tacacattgg caatctccaa atttctttgc ttattttcca 300

tcttctggtt ctactgctgg ttttctaggt gaaatgttgt ctactggttt taatgttgtt 360

ggttttaact ggatggtttc tccagctgct acagaattgg aaaatgttgt tactgattgg 420

tttggtaaaa tgttgcaatt gccaaaatct tttctgtttt ctggtggtgg tggtggagtt 480

ttgcaaggta caacttgtga agctattttg tgtactttgg ttgctgctag agataaaaat 540

ttgagacaac atggtatgga taacattggt aaattggttg tttactgttc tgatcaaact 600

cattctgctt tacaaaaagc tgctaaaatt gctggtattg atccaaaaaa tttcagagct 660

attgagacaa ctaagtcttc taattttcag ttgtgtccaa aaagattgga atctgctatt 720

ttacatgact tacaaaacgg tttgatccca ttgtatttgt gtgctactgt tggtacaaca 780

tcttctacaa ctgttgatcc attgccagct ttaactgaag ttgctaaaaa atatgacctg 840

tgggttcatg ttgatgctgc ttatgctggt tctgcttgta tttgtccaga atttcgtcaa 900

tatttggatg gtgttgaaaa tgctgattct ttttctttga acgctcataa atggtttttg 960

acaacattag attgctgttg tttgtgggtt agaaatccat ctgctttgat taagtctttg 1020

tctacatatc cagaattttt gaagaacaac gcttctgaaa ctaataaggt tgttgattat 1080

aaggactggc aaattatgtt atctaggaga tttcgtgctt taaaattgtg gtttgttttg 1140

agatcatacg gtgttggtca attaagagag tttattagag gtcatgttgg tatggctaaa 1200

tattttgaag gtttggttaa catggacaaa agatttgaag ttgttgctcc aagattgttt 1260

tctatggttt gttttagaat caagccatct gctatgattg gtaaaaatga tgaagatgaa 1320

gtcaacgaaa tcaatagaaa attgttggaa tccgttaacg attctggtag aatatatgtt 1380

tctcatactg ttttgggtgg tatatatgtt attagattcg ctattggtgg tacattaact 1440

gatattaatc acgtttctgc tgcttggaaa gttttacaag atcatgctgg tgctttgttg 1500

gatgatactt ttacttctaa taagctggtt gaagttttgt cttaa 1545

<210> 5

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggttctc aaattatcca taactctcaa aaaccacatg ttgtttgtgt tccatatcca 60

gctcaaggtc atattaatcc aatgatgaga gttgctaaat tgttgcatgc tagaggtttt 120

tatgttacat ttgttaacac cgtttacaac cataatagat ttttgagatc cagaggttct 180

aatgctttgg atggtttgcc atcttttaga tttgaatcta ttgctgatgg tttgcctgaa 240

actgatatgg atgctactca agatattact gctttgtgtg aatctacaat gaaaaattgt 300

ctggctccat ttcgtgaatt gttacaaaga attaacgctg gtgacaatgt tccaccagtt 360

tcttgtattg tttctgatgg ttgtatgtct tttactttag atgttgctga agaattgggt 420

gttccagaag ttttgttttg gactacttct ggttgtgctt ttctagctta tttgcatttt 480

tacttgttca tcgaaaaggg tttatgtcca ttgaaagatg aatcttatct gacaaaagag 540

tacttagaag atacagttat cgattttatc ccaactatga aaaacgttaa gttgaaagat 600

atcccatctt ttatcagaac tactaatcca gatgatgtta tgatttcttt cgctttgaga 660

gaaactgaaa gagctaaaag agcttctgct attattttaa acacctttga tgacttggag 720

catgatgttg ttcatgctat gcaatctatt ttaccaccag tttattctgt tggtccattg 780

catttgttag ctaatagaga aattgaggaa ggttctgaaa ttggtatgat gtcttctaat 840

ttgtggaaag aagaaatgga atgtttggat tggttggata ctaaaactca aaattctgtt 900

atctacatca acttcggttc tattactgtt ttgtctgtta aacaactggt tgaatttgct 960

tggggtttag ctggttctgg taaagaattt ttatgggtta ttaggccaga tttggttgct 1020

ggtgaagaag ctatggttcc accagatttt ctaatggaaa ctaaagatag atccatgttg 1080

gcttcttggt gtccacaaga aaaagtttta tctcatccag ctattggtgg ttttctaact 1140

cattgtggtt ggaatagtat tttggaatct ttgtcttgtg gtgttccaat ggtttgttgg 1200

ccatttttcg ctgatcaaca aatgaattgt aagttttgtt gcgatgaatg ggatgttggt 1260

attgaaattg gtggtgacgt taaaagagaa gaagttgaag ctgttgttag agaattgatg 1320

gatggtgaaa aaggtaaaaa gatgagagaa aaagctgttg aatggcaaag attagctgaa 1380

aaagctactg aacataaatt gggttcttct gttatgaatt tcgaaactgt tgtttctaag 1440

ttcttgttag gtcaaaaatc tcaagattaa 1470

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaacctagg cacacaccat agcttcaaaa tg 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaagacgtc ttgtaattaa aacttagatt ag 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaagaattc cagttcgagt ttatcattat c 31

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaaggatcc tttgtttgtt tatgtgtg 28

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaagaattc acgcacagat attataacat c 31

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaaactagt ttgttttata tttgttg 27

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aatggaaggt cgggatgagc atatacaagc actaagaaga cggcatcaga gcagattgta 60

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ataatgataa actcgaactg gcctgatgcg gtattttctc 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagaaaatac cgcatcaggc cagttcgagt ttatcattat 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ataatatctg tgcgtgaatt cagtatagcg accagcattc 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaatgctggt cgctatactg aattcacgca cagatattat 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttttgaagct atggtgtgtg agcgacctca tgctatacct 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggtatagca tgaggtcgct cacacaccat agcttcaaaa 40

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctgaaatgc aaagatcgat aatgtaatag gaatgaaaca cttcgagcgt cccaaaacct 60

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tagaatccca ccaattatct caaaattcac cagtatctta actgtgggaa tactcaggt 59

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttgctttctc aggtatagca tgaggtcgct tcgactacgt cgtaaggccg tttctgacag 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

attatagcct taatcacaat ggaatcccaa caattacatc cagtatagcg accagcattc 60

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctgtcagaaa cggccttacg acgtagtcga agcgacctca tgctatacct gagaaagcaa 60

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcggtcgaca tgagtgaatc tccaatgttc 30

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gatagcagca acaccatgca aagtaacacc catgaaatg 39

<210> 26

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

catttcatgg gtgttacttt gcatggtgtt gctgctatc 39

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctgaagcttt tatttcttgt taacttctc 29

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgcactagta tggatttcac aaaaccagaa actgtttta 39

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctagtggcaa cagaactgaa gttattctta tc 32

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gataagaata acttcagttc tgttgccact ag 32

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctcagatctt tactcttcca accttcttag caagtatt 38

Claims

1.一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，重组酿酒酵母菌株中外源基因包括AROL基因、PcAAS基因、AtUgt85A1基因、ARO4*基因和ARO7*基因。

2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述ARO4*基因具有如序列表中SEQ ID No：1所示核苷酸序列；所述ARO7*基因具有如序列表中SEQ ID No：2所示核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述外源基因整合在酿酒酵母菌株基因组上。

4.根据权利要求3所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述外源基因以TEF1-AROL-CYC1t，TDH3-ARO7*-TEF1t，PGK1-ARO4*-ADH1t和TDH3-PcAAS-TEF1t-PGK1-AtUGT85A1-ADH1t为整合片段的形式整合在酿酒酵母菌株基因组上。

5.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述PcAAS、AtUgt85A1、ARO4*、ARO7*和AROL基因以重组质粒的形式在酿酒酵母中表达。

6.根据权利要求5所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述外源基因以重组质粒的形式转入酿酒酵母菌种，所述外源基因包含在两个重组质粒中；其中第一重组质粒包含有ARO4*、ARO7*和AROL基因；第二重组质粒包含有PcAAS和AtUgt85A1。

7.根据权利要求6所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述第一重组质粒为pESC-URA3-TEF1-AROL-TDH3-ARO7*-PGK1-ARO4*；所述第二重组质粒为pESC-LEU2-TEF1-TDH3-PcAAS-PGK1-AtUGT85A1。

8.权利要求1～7任意一项所述的重组酿酒酵母菌株在生产酪醇和/或红景天苷中的应用。

9.基于权利要求1～7任意一项所述重组酿酒酵母菌株生产酪醇和/或红景天苷的方法，包括以下步骤：

1)将所述的重组酿酒酵母菌株接种至培养基中，在30～32℃下培养10～16h，得到重组酿酒酵母种子液；

2)将步骤1)中得到的重组酿酒酵母种子液接种至新的培养基中，在30～32℃下进行发酵培养72～216h，得到酪醇和/或红景天苷。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤2)中培养基为筛选培养基；所述筛选培养基以尿嘧啶及亮氨酸营养缺陷作为筛选标记的SC液体培养基；所述步骤1)和步骤2)中接种量为1％～2％；所述步骤2)中发酵培养的时间为96～200h。