CN113136348B - 高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用。该工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达ARO4K229L、ARO7G229S、ARO8、TYR1、BDH1E221S/I222R/A223S、4CL1、F3H、F3’H、CPR、CHI、TAL和CHS基因；其中，ARO4K229L为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；ARO7G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；BDH1E221S/I222R/A223S为BDH1基因的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸。该工程菌株可以经过发酵获得紫杉叶素。

Description

高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用
技术领域
本发明涉及代谢工程和发酵技术领域，特别涉及一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用。
背景技术
紫杉叶素(Taxifolin)是一种天然的二氢黄酮醇类化合物，又名花旗松素和二氢槲皮素。紫杉叶素具有抗癌、抗菌、清除自由基的能力。最近也有研究证明，紫杉叶素具有神经损伤保护的功能，特别是对阿尔茨海默病引起的淀粉样蛋白病变具有缓解作用。因此，紫杉叶素也被广泛的用于食品领域，并被开发成保健品。此外，紫杉叶素也可以作为前体原料，用于生产保肝药物水飞蓟素。因为其较高的市场需求，紫杉叶素的价格也高达1.5～2万元每公斤。
目前，紫杉叶素主要从花旗松的针叶中提取获得。但紫杉叶素在植物中含量较低，提取后的纯化过程较为复杂，需要使用大量的有机试剂。此外，花旗松的生长周期较长，容易受到气候和产地的制约。大量的野生植物开采也会对生态平衡产生不良影响。同时，因为紫杉叶素结构较为复杂，使用有机合成的方式副产物较多，且产率较低，并且有机合成得到的紫杉叶素也较难为消费者所接受。
基于植物提取和化学合成的弊端，寻找紫杉叶素的替代来源极为重要。通过现代生物技术，构建可以生产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌是一个最佳选择。将植物中紫杉叶素的生物合成相关酶的外源性基因高效多拷贝的组装到酵母的染色体上，以及对酵母中内源基因进行优化是核心技术。目前随着新的整合技术的发展，将外源性的基因多拷贝高效率的组装到酿酒酵母染色体上已经相对成熟，为实现构建该类酿酒酵母工程菌提供了技术支持。并且，而通过微生物工厂发酵的方法得到的紫杉叶素也可以作为一种绿色天然食品。
本发明中，公开了一种高产紫衫叶素的酿酒酵母YT1041的构建方法，将紫杉叶素的生物合成途径关键酶基因多拷贝的整合到了酿酒酵母的染色体上，并对代谢途径进行优化，提高紫杉叶素的生产效率。同时，通过补料发酵技术，该菌株可以生产高达331mg/L的紫杉叶素。发酵液通过大孔树脂进行纯化分离，紫杉叶素的提取效率和纯度都可以达到90％以上。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌。
本发明的另一目的在于提供所述高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的构建方法。
本发明的再一目的在于提供所述高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌，以酿酒酵母为出发菌株，过表达ARO4K229L、ARO7G229S、ARO8、TYR1、BDH1E221S/I222R/A223S、4CL1、F3H、F3’H、CPR、CHI、TAL和CHS基因；其中，
所述的ARO4K229L为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；
所述的ARO7G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；
所述的BDH1E221S/I222R/A223S为BDH1基因的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸。
所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。
所述的ARO4、ARO7、ARO8、TYR1和BDH1基因可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到；其中，ARO4的核苷酸序列如GenBank:NM_001178597.1所示；ARO7的核苷酸序列如GenBank:NM_001184157.1所示；ARO8的核苷酸序列如GenBank:NM_001181067.1所示；TYR1的核苷酸序列如GenBank:NM_001178514.1所示；BDH1的核苷酸序列如GenBank:NM_001178202.2所示。
所述的4CL1、F3H、F3’H和CPR基因可以以拟南芥cDNA为模板克隆得到，其中，4CL1的核苷酸序列如GenBank:AY376729所示；F3H的核苷酸序列如GenBank:NM_114983.3所示；F3’H的核苷酸序列如GenBank:NM_120881.3所示；CPR的核苷酸序列如GenBank:NM_118585.4所示。
所述的CHI的核苷酸序列如GenBank:XM_003592713.3所示。
所述的TAL的核苷酸序列如GenBank:KR095308.1所示。
所述的CHS的核苷酸序列如GenBank:AF233638.1所示。
所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用重叠PCR构建以下模块和基因片段
(a)将PTDH3、TAL和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-TAL-TTDH2；
(b)将PPGK1、ARO4K229L和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-ARO4K229L-TADH1；
(c)将PTEF1、ARO7G229S和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-ARO7G229S-TCYC1；
(d)将表达模块PTDH3-TAL-TTDH2、PPGK1-ARO4K229L-TADH1和PTEF1-ARO7G229S-TCYC1顺序连接，得到基因片段TAA；
(e)将PTDH3、4CL1和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-4CL-TTDH2；
(f)将PPGK1、CHS和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-CHS-TADH1；
(g)将PTEF1、CHI和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-CHI-TCYC1；
(h)将表达模块PTDH3-4CL-TTDH2、PPGK1-CHS-TADH1和PTEF1-CHI-TCYC1顺序连接，得到基因片段4CC；
(i)将PTDH3、F3H和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-F3H-TTDH2；
(j)将PPGK1、F3’H和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-F3’H-TADH1；
(k)将PTEF1、CPR和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-CPR-TCYC1；
(l)将表达模块PTDH3-F3H-TTDH2、PPGK1-F3’H-TADH1和PTEF1-CPR-TCYC1顺序连接，得到基因片段FFA；
(m)将PTDH3、BDH1E221S/I222R/A223S和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-BDH1E221S /I222R/A223S-TTDH2；
(n)将PPGK1、TYR1和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-TYR1-TADH1；
(o)将PTEF1、ARO8和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-ARO8-TCYC1；
(p)将表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2、PPGK1-TYR1-TADH1和PTEF1-ARO8-TCYC1顺序连接，得到基因片段BTA；
(2)构建载体
(I)利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切pCfB2797载体，得到线性化pCfB2797载体；然后将步骤(d)中得到的基因片段TAA连接到线性化pCfB2797载体上，得到质粒pCfB2797TAA；
(II)利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切载体pCfB2798，得到线性化pCfB2798载体；然后将步骤(h)中得到的基因片段4CC连接到线性化pCfB2798载体上，得到质粒pCfB27984CC；
(III)利用限制性内切酶Pst1切酶pCfB2989载体；得到线性化pCfB2798载体，然后将MET筛选标签基因片段连接到线性化pCfB2798载体上，得到质粒pCfB2798m；再利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切载体pCfB2989m，得到线性化pCfB2989m载体；然后将步骤(l)中得到的基因片段FFA连接到线性化pCfB2989m载体上，得到质粒pCfB2989mFFA；
(IV)将His筛选标签基因片段连接到pEASY-Blunt载体上，得到质粒p-YJZ-His；然后利用限制性内切酶AvaI酶切质粒p-YJZ-His，得到线性化p-YJZ-His载体；然后将步骤(p)中得到的基因片段BTA连接到线性化p-YJZ-His载体上，得到质粒p-HBTA；
(3)构建菌株YC1041
(A)将质粒pCfB2797TAA用限制性内切酶NotI线性化后转化酿酒酵母BY4741(将线性化的载体整合到酵母染色体的Ty2位点)，筛选得到酿酒酵母YT1003；
(B)将质粒pCfB27984CC用限制性内切酶NotI线性化后转化酿酒酵母YT1003(将线性化的载体整合到酵母染色体的Ty4位点)，筛选得到酿酒酵母YC1011；
(C)将质粒pCfB2798mFFA用限制性内切酶NotI线性化后转化酿酒酵母YC1011(将线性化的载体整合到酵母染色体的Ty1位点)，筛选得到酿酒酵母YC1021；
(D)质粒P-HBTA用引物p-HBTA-F和p-HBTA-R进行PCR扩增，得到基因整合片段HBTA；然后将基因整合片段HBTA转化酿酒酵母YC1031(将线性化的载体整合到酵母染色体的YKL211C位点)，筛选得到酿酒酵母YC1031，即所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌；其中，引物p-HBTA-F和p-HBTA-R的核苷酸序列如下所示：
p-HBTA-F：5’-TTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID NO.7)；
p-HBTA-R：5’-ATGTCTGTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGTCACGACGTTGTAAAACGACG-3’(SEQ ID NO.8)。
步骤(a)、(e)、(i)和(m)中所述的PTDH3可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤(a)所述的TAL的核苷酸序列如GenBank:KR095308.1所示。
步骤(a)、(e)、(i)和(m)中所述的TTDH2可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
步骤(b)、(f)、(j)和(n)中所述的PPGK1可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(b)中所述的ARO4K229L为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；其中，ARO4的核苷酸序列如GenBank:NM_001178597.1所示。
步骤(b)(f)、(j)和(n)中所述的TADH1可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
步骤(c)、(g)、(k)和(o)中所述的PTEF1可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤(c)中所述的ARO7G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；其中，ARO7的核苷酸序列如GenBank:NM_001184157.1所示。
步骤(c)、(g)、(k)和(o)中所述的TCYC1可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
步骤(e)中所述的4CL1可以以拟南芥cDNA为模板克隆得到，其核苷酸序列如GenBank:AY376729所示。
步骤(f)中所述的CHS的核苷酸序列如GenBank:AF233638.1所示。
步骤(g)中所述的CHI的核苷酸序列如GenBank:XM_003592713.3所示。
步骤(i)中所述的F3H可以以拟南芥cDNA为模板克隆得到，其核苷酸序列如GenBank:NM_114983.3所示。
步骤(j)中所述的F3’H可以以拟南芥cDNA为模板克隆得到，其核苷酸序列如GenBank:NM_120881.3所示。
步骤(k)中所述的CPR可以以拟南芥cDNA为模板克隆得到，其核苷酸序列如GenBank:NM_118585.4所示。
步骤(m)中所述的BDH1E221S/I222R/A223S为BDH1的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸；其中，BDH1的核苷酸序列如GenBank:NM_001178202.2所示。
步骤(n)中所述的TYR1可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如GenBank:NM_001178514.1所示。
步骤(o)中所述的ARO8可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如GenBank:NM_001181067.1所示。
步骤(A)、(B)和(C)中所述的转化为采用化学转化法或电转法进行转化，将整合片段整合到酿酒酵母的染色体上。
步骤(A)中所述的筛选为采用SD-URA培养基进行筛选。
所述的SD-URA培养基的组成如下：YNB培养基6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
步骤(B)中所述的筛选为采用SD-LEU培养基进行筛选。
所述的SD-MET培养基的组成如下：YNB培养基6.7g/L，MET(甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
步骤(C)中所述的筛选为采用SD-MET培养基进行筛选。
所述的SD-MET培养基的组成如下：YNB培养基6.7g/L，MET(甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
步骤(D)中所述的筛选为采用SD-MET和SD-HIS培养基进行筛选。
所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌在生产紫杉叶素中的应用。
一种生产紫杉叶素方法，为将所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到紫杉叶素；具体包括如下步骤：
将所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，待当溶氧值达到60％时补加补料培养基，使培养基内葡萄糖的含量维持在5g/L，得到紫杉叶素。
所述的活化为多级活化；其通过如下步骤实现：为将所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌接种到5mL的SD-ULMH培养基中，220～250rpm、30℃条件下培养至OD值2～3；然后将菌液接种到100mL摇瓶中，220～250rpm、30℃条件下培养至OD值2～3。
所述的SD-ULMH培养基的组成如下：YNB培养基6.7g/L；URA(尿嘧啶)、LEU(亮氨酸)、MET(甲硫氨酸)、HIS(组氨酸)、TRP(色氨酸)共缺陷氨基酸(100X)10mL/L；葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
所述的URA(尿嘧啶)、LEU(亮氨酸)、MET(甲硫氨酸)、HIS(组氨酸)、TRP(色氨酸)共缺陷氨基酸(100X)为缺陷氨基酸母液(100X)中不添加URA(尿嘧啶)、LEU(亮氨酸)、MET(甲硫氨酸)、HIS(组氨酸)和TRP(色氨酸)；具体组成成分为：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，用ddH2O定容到57mL。
所述的发酵培养基的组成如下：30g/L葡萄糖，(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4 3g/L，ZnSO4·7H2O 0.72g/L，维生素溶液12mL/L，以及微量金属盐溶液10mL/L；其中：
维生素溶液：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L。
微量金属盐溶液：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L。
所述的补料培养基组成如下：葡萄糖585g/L，KH2PO4 9g/L，MgSO4 2.5g/L，K2SO43.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，维生素溶液12mL/L，以及微量金属盐溶液10mL/L；其中：
维生素溶液：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L。
微量金属盐溶液：EDTA 15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO40.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L。
所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的接种量为0.1％～15％(v/v)；优选为10％(v/v)。
所述的发酵培养的条件为：温度25～35℃，pH值3～7，溶氧值30％以上，搅拌速度300～800rpm，通气量3～20L/min，发酵时间0～144h(不包括0)；优选为：温度30℃，转速300～800rpm，pH5.5(用氨水调节)，溶氧值30％，通气量3～20L/min，葡萄糖的起始浓度是30g/L，发酵时间12～144h。
所述的补加补料培养基的速度为5ml/h。
所述的发酵的时间优选为108h。
所述的生产紫杉叶素的方法，还包括将获得的紫杉叶素进一步提纯的步骤；具体为：将发酵后获得的发酵液离心分离，得到菌体和上清；然后将菌体用乙醇水溶液进行超声提取，提取后的乙醇溶剂与上清混合，并除去混合液中的乙醇，得到紫杉叶素粗提液；再将紫杉叶素粗提液用大孔吸附树脂进行吸附，洗脱，干燥，得到纯化后的紫杉叶素。
所述的菌体的转速优选为6000rpm。
所述的乙醇水溶液的浓度优选为体积百分比50％。
所述的超声提取的条件为：20KHz-40KHz超声提取1小时以上。
所述的大孔吸附树脂优选为大孔吸附树脂D101。
所述的洗脱为采用体积分数为30％乙醇-水溶液进行洗脱。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：紫杉叶素是一种高经济价值的天然产物，被开发成保健功能性食品，也可以被用来作为生产水飞蓟宾的原料。随着紫杉叶素的活性研究，其的药用和保健价值会进一步得到开发。本发明构建了重组酿酒酵母工程菌YT1031，它可以通过葡萄糖为碳源，以酪氨酸为底物，经过发酵获得紫杉叶素。发酵液经过简单的大孔树脂纯化，不如要使用毒性较大的有机试剂，可以制备纯度超过90％的紫杉叶素粗品。
附图说明
图1是在酿酒酵母中重建紫杉叶素的生物合成途径图。
图2是酵母菌株发酵产物的HPLC-MS总离子流图和质谱图；其中，a为发酵物乙酸乙酯提取物HPLC图；b为紫杉叶素UV图；c为紫杉叶素标准品HPLC图；d为紫杉叶素质子流图。
图3是YT1041在发酵罐中紫杉叶素产量变化和生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明所设计的紫杉叶素生物合成途径起始于葡萄糖，经酵母菌体内的莽草酸途径生成酪氨酸和丙二酸单酰辅酶A。随后，酪氨酸在TAL的催化下生成对香豆酸。一分子对香豆酸会和三分子丙二酸单酰辅酶A(即摩尔比为1:3)在CHS的作用下生成柚皮素型查尔酮并随后由查尔酮异构酶进行催化生成柚皮素。柚皮素分别经F3H、F3’H、CPR进行催化，最终得到紫杉叶素。TYR1和BDH1E221S/I222R/A223S可以提高和NADPH的提供，从而促进F3’H的表达；ARO8可以提高α-酮戊二酸的供给，从而可以促进F3H的表达。此外，ARO8和TYR1都是为酪氨酸生物合成中最后两个关键酶，过表达这两个基因也可以同时提高酪氨酸的产量，从而促进紫杉叶素的生物合成。同时，ARO7G229S和ARO4K229L可以解除高浓度酪氨酸的负反馈抑制，从而进一步促进酪氨酸的生成，进而提高紫杉叶素的产量。
本发明所使用的菌株为酿酒酵母BY4741，购买自ATCC。
本发明所使用的克隆载体(p-Blunt)、大肠杆菌DH5α感受态和大肠杆菌DH10B感受态均购买自北京全式金公司。本发明所使用的单拷贝整合型载体均有p-Blunt改造而来。本发明中使用的多拷贝整合型载体均购于Addgene(http://www.addgene.org)，p-PTDH3、p-TAL、p-PPGK1、p-ARO4K229L、p-TADH1、p-PTEF1、p-ARO7G229S、p-TCYC1、p-4CL1、p-TTDH2、p-CHS、p-CHI、p-F3H、p-PF3’H、p-CPR、p-BDH1E221S/I222R/A223S、p-TYR1、p-ARO8等均为p-Blunt改造而来，即将相应的基因片段插入到p-Blunt载体获得。
本发明中使用的YPD培养基成分为：20g/L的蛋白胨、10g/L的酵母提取物、20g/L的葡萄糖。
本发明中使用的SD-URA培养基：YNB培养基6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
本发明中使用的SD-MET培养基：YNB培养基6.7g/L，MET(甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
本发明中使用的SD-LEU培养基：YNB培养基6.7g/L，LEU(亮氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
本发明中使用的SD-HIS培养基：YNB培养基6.7g/L，HIS(组氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
本发明中使用的SD-ULMH培养基：YNB培养基6.7g/L；URA(尿嘧啶)、LEU(亮氨酸)、MET(甲硫氨酸)、HIS(组氨酸)、TRP(色氨酸)共缺陷氨基酸(100X)(为缺陷氨基酸母液(100X)中)不添加URA(尿嘧啶)、LEU(亮氨酸)、MET(甲硫氨酸)、HIS(组氨酸)、TRP(色氨酸))10mL/L；葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。
缺陷氨基酸母液(100X)：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用ddH2O定容到57mL，根据需要可不加任意一种氨基酸配置成缺陷氨基酸母液(100X)。上述原料均购买自Sigma-Aldrich。
本发明中使用的发酵培养基：30g/L葡萄糖，(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO43g/L，ZnSO4·7H2O 0.72g/L，维生素溶液12mL/L，以及微量金属盐溶液10mL/L。
本发明中使用的补料培养基：葡萄糖585g/L，KH2PO4 9g/L，MgSO4 2.5g/L，K2SO43.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，维生素溶液12mL/L，以及微量金属盐溶液10mL/L；其中，
维生素溶液：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L。
微量金属盐溶液：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L。
实施例1酵母内源性基因、启动子、终止子的克隆
1、酵母基因组的提取
(1)挑取酿酒酵母BY4741(购于ATCC)的单克隆于5mL YPD培养基中，30℃培养20～24h，而后4000rpm离心5min，集菌，并置于研钵中。
(2)液氮速冻，研磨，待液氮挥干后，加入1mL DNAiso Reagent(宝日医生物技术有限公司)，混匀。
(3)将裂解液转移至离心管中，于4℃或室温12,000rpm离心10min。
(4)将上清液转移到新的离心管内，加入1/2体积的无水乙醇，混匀，室温4000rpm离心，去上清。
(5)用75％(v/v)的乙醇清洗沉淀2次，并挥干残留乙醇，加入50μL ddH2O溶解，作为PCR克隆模板。
2、酵母内源性基因和表达元件的克隆
(1)以上述获得的酵母基因组为模板，分别克隆以下5个基因、3个启动子和3个终止子(扩增引物见表1)：
5个基因：ARO4(引物ARO4-F和ARO4-R)、ARO7(引物ARO7-F和ARO7-R)、ARO8(引物ARO8-F和ARO8-R)、TYR1(引物TYR1-F和TYR1-R)、BDH1(引物BDH1-F和BDH1-R)；其中，ARO4的核苷酸序列见GenBank:NM_001178597.1；ARO7的核苷酸序列见GenBank:NM_001184157.1；ARO8的核苷酸序列见GenBank:NM_001181067.1；TYR1的核苷酸序列见GenBank:NM_001178514.1；BDH1的核苷酸序列见GenBank:NM_001178202.2；
3个启动子：PPGK1(PPGK1-F和PPGK1-R)、PTEF1(PTEF1-F和PTEF1-R)、PTDH3(PTDH3-F和PTDH3-R)，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；
3个终止子：TCYC1(TCYC1-F和TCYC1-R)、TTDH2(TTDH2-F和TTDH2-R)、TADH1(TADH1-F和TADH1-R)，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示。
PCR反应体系：phanta max高保真酶(Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase)0.5μL，dNTP(10mM)0.5μL，2x Phanta Max Buffer 10μL，上下游特异性引物各0.5μL，ddH2O 7μl，模板1μL，总反应体系20μL。
PCR扩增反应条件为：95℃1min；95℃30s，50-60℃30s，72℃1-2min，30循环；72℃7min。
DNA片段纯化：PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测条带，并使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)进行胶回收，具体操作过程见说明书。
(2)DNA片段连接pEASY-Blunt载体
DNA片段连接平末端pEASY-Blunt(全式金生物技术有限公司)，转化DH5α菌株，具体操作见产品说明书。
(3)37℃培养14～16h后，挑选单菌落做菌落PCR。
PCR反应体系：Easy Taq聚合酶0.2μL，dNTPs(2.5mM)0.8μL，10x Easy Taq Buffer1μL，通用引物M13F和M13-R(表1)(10μM)0.3μL，M13R(表1)(10μM)0.3μL，DMSO 1μL，ddH2O6.4μL。
PCR扩增条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1-3min，30个循环；72℃7min。
反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测阳性转化子，送样测序。
3、ARO4、ARO7、BDH1基因点突变分别得到、ARO4K229L、ARO7G229S、BDH1E221S/I222R/A223S基因片段。
ARO4和ARO7分别为酪氨酸生物合成途径的限速酶，受到反应产物酪氨酸的负反馈抑制。将ARO4第229位的赖氨酸突变为亮氨酸，以及将ARO7第229位的甘氨酸突变为丝氨酸后可以解除这种负反馈抑制。BDH1本身以NAD+为底物生成NAPH，如果将其221位的谷氨酸突变为丝氨酸，222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸，可以使其将催化底物NAD+改为NADP+，并生成NADPH。NADPH可以为生成紫杉叶素的细胞色素P450氧化酶F3H提供还原力，从而提高紫杉叶素产量。即：
以p-Blunt-ARO4质粒(构建方法同上：将ARO4基因连接到pEASY-Blunt载体)为模板，引物ARO4K229L-F和ARO4K229L–R(表1)进行原位定点突变；
以p-Blunt-ARO7质粒(构建方法同上：将ARO7基因连接到pEASY-Blunt载体)位模板，引物ARO7G229S-F和ARO7G229S–R(表1)进行原位定点突变；
以p-Blunt-BDH1质粒(构建方法同上：将BDH1基因连接到pEASY-Blunt载体)为模板，BDH1E221S/I222R/A223S-F和BDH1E221S/I222R/A223S-R(表1)进行原位定点突变；
其具体步骤如下：
(1)PCR反应系：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，dNTP 0.5μL，2x Phanta Max buffer 10μL，正向、反向引物各1μL。模板1μL，总反应体系50μL。
(2)PCR反应条件：95℃3min；95℃30s，62℃30s，72℃2min，18个循环；72℃7min。
(3)向PCR产物中加入0.5μL限制性内切酶DpnΙ，37℃消化1h。
(4)将消化体系全部转化大肠杆菌DH5α，37℃倒置培养14～18h。
(5)菌落PCR挑选阳性转化子进行测序。
实施例2、植物来源的基因的克隆
1、植物组织RNA的提取
利用快速通用RNA提取试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司)提取拟南芥(拟南芥均可通过常规市售购买得到)叶片中的总RNA，具体操作过程见说明书。
2、mRNA反转录成cDNA
采用Hiscript II Reverse Transcriptase试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)将RNA反转录成cDNA，具体操作见试剂盒说明书。
3、目的基因的克隆
以拟南芥cDNA为模板克隆4CL1(引物4CL1-F和4CL1-R)、F3H(引物F3H-F和F3H-R)、F3’H(引物F3’H-F和F3’H-F)、CPR(引物CPR-F和CPR-F)基因，引物见表1，具体实施方法可参考实施例1。其中，4CL1的核苷酸序列见GenBank:AY376729；F3H的核苷酸序列见GenBank:NM_114983.3；F3’H的核苷酸序列见GenBank:NM_120881.3，CPR的核苷酸序列见GenBank:NM_118585.4。
4、基因CHI、TAL和CHS由鸿讯生物公司合成；其中，CHI的核苷酸序列见GenBank:XM_003592713.3；TAL的核苷酸序列见GenBank:KR095308.1；CHS的核苷酸序列见GenBank:AF233638.1。
表1.本发明涉及的克隆基因所用引物序列
Figure BDA0002375006040000091
Figure BDA0002375006040000101
实施例3、各表达模块的构建及相关质粒构建
1、利用重叠PCR构建基因表达模块
(1)各模块的构建都通过重叠PCR技术，模块中各连接的片段通过PCR克隆，加上40～50bp的重叠区域，重叠区域碱基退火温度在60～70℃之间。
(2)第一轮反应体系：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，dNTP(10mM)0.5μL，2x Phanta Max Buffer 10μL，DNA片段1～5μL，上下游引物各0.5μL(见表2)，加ddH2O至20μL；其中引物序列见表2。
第一轮PCR反应条件：95℃3min；95℃30s，60～70℃30s，72℃1～4min，15个循环；72℃7min。
(3)第二轮PCR：取第一轮PCR反应液1μL作为第二轮PCR模板，第二轮PCR体系：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，dNTP(10mM)0.5μL，2x Phanta MaxBuffer 10μL，上下游引物各0.5μL(引物为连接成完整DNA片段上下游引物，见表2)，ddH2O7μL，模板1μL，总反应体系20μL。
第二轮PCR反应条件：95℃3min；95℃30s，50～60℃30s，72℃1～4min，30个循环；72℃5min。
(4)胶回收并连接pEASY-Blunt载体(全式金生物技术有限公司)测序。
按上述步骤共构建如下模块和基因片段：
(a)利用重叠PCR将启动子PTDH3、基因TAL、终止子TTDH2连接起来，得到表达模块PTDH3-TAL-TTDH2；其中，第一轮以p-PTDH3为模板，APTDH3-F和PTDH3-TAL-R为引物，克隆得到基因片段1；以p-TAL为模板，PTDH3-TAL-TTDH2-F和PTDH3-TAL-TTDH2-R为引物，克隆得到基因片段2；以p-TTDH2为模板，TAL-TTDH2-F和ATTDH2-R为引物，克隆得到基因片段3；第二轮克隆引物为APTDH3-F和ATTDH2-R。
(b)利用重叠PCR将启动子PPGK1、基因ARO4K229L、终止子TADH1连接起来，得到表达模块PPGK1-ScARO4K229L-TADH1；其中，第一轮以p-PPGK1为模板，APPGK1-F和PPGK1-ARO4K229L-R为引物，克隆得到基因片段4；以p-ARO4K229L为模板，PPGK1-ARO4K229L-TADH1-F和PPGK1-ARO4K229L-TADH1-R为引物，克隆得到基因片段5；以p-TADH1为模板，ARO4K229L-TADH1-F和ATADH1-R为引物，克隆得到基因片段6；第二轮克隆引物为APPGK1-F和ATADH1-R。
(c)利用重叠PCR将启动子PTEF1、基因ARO7G229S、、终止子TCYC1连接起来，得到表达模块PTEF1-ARO7G229S-TCYC1；其中，第一轮以p-PTEF1为模板，APTEF1-F和PTEF1-ARO7G229S-R为引物，克隆得到基因片段7；以p-ARO7G229S为模板，PTEF1-ARO7G229S-TCYC1-F和PTEF1-ARO7G229S-TCYC1-R为引物，克隆得到基因片段8；以p-TCYC1为模板，ARO7G229S-TCYC1-F和ATCYC1-R为引物，克隆得到基因片段9；第二轮克隆引物为APTEF1-F和ATCYC1-R。
(d)利用重叠PCR将模块PTDH3-TAL-TTDH2、PPGK1-ARO4K229L-TADH1、PTEF1-ARO7G229S-TCYC1连接起来，使用的引物为APTDH3-F和ATCYC1-R，得到基因片段TAA(PTDH3-TAL-TTDH2→PPGK1-ARO4K229L-TADH1→PTEF1-ARO7G229S-TCYC1)。
(e)利用重叠PCR将启动子PTDH3、基因4CL1、终止子TTDH2连接起来，得到表达模块PTDH3-4CL-TTDH2；其中，第一轮以p-PTDH3为模板，BPTDH3-F和PTDH3-4CL-R为引物，克隆得到基因片段10；以p-4CL1为模板，PTDH3-4CL-TTDH2-F和PTDH3-4CL-TTDH2-R为引物，克隆得到基因片段11；以p-TTDH2为模板，4CL-TTDH2-F和ATTDH2-R为引物，克隆得到基因片段12；第二轮克隆引物为BPTDH3-F和ATTDH2-R。
(f)利用重叠PCR将启动子PPGK1、基因CHS、终止子TADH1连接起来，得到表达模块PPGK1-CHS-TADH1；其中，第一轮以p-PPGK1为模板，APPGK1-F和PPGK1-CHS-R为引物，克隆得到基因片段13；以p-CHS为模板，PPGK1-CHS-TADH1-F和PPGK1-CHS-TADH1-R为引物，克隆得到基因片段14；以p-TADH1为模板，CHS-TADH1-F和ATADH1R为引物，克隆得到基因片段15；第二轮克隆引物为APPGK1-F和ATADH1R。
(g)利用重叠PCR将启动子PTEF1、基因CHI、终止子TCYC1连接起来，得到表达模块PTEF1-CHI-TCYC1；其中，第一轮以p-PTEF1为模板，APTEF1-F和PTEF1-CHI-R为引物，克隆得到基因片段16；以p-CHI为模板，PTEF1-CHI-TCYC1-F和PTEF1-CHI-TCYC1-R为引物，克隆得到基因片段17；以p-TCYC1为模板，CHI-TCYC1-F和ATCYC1-R为引物，克隆得到基因片段18；第二轮克隆引物为APTEF1-F和ATCYC1-R。
(h)利用重叠PCR将模块PTDH3-4CL-TTDH2、PPGK1-CHS-TADH1、PTEF1-CHI-TCYC1连接起来，使用的引物为BPTDH3-F和ATCYC1-R，得到基因片段4CC(PTDH3-4CL-TTDH2→PPGK1-CHS-TADH1→PTEF1-CHI-TCYC1)。
(i)利用重叠PCR将启动子PTDH3、基因F3H、终止子TTDH2连接起来，得到表达模块PTDH3-F3H-TTDH2；其中，第一轮以p-PTDH3为模板，CPTDH3-F和PTDH3-F3H-R为引物，克隆得到基因片段19；以p-F3H为模板，PTDH3-F3H-TTDH2-F和PTDH3-F3H-TTDH2-R为引物，克隆得到基因片段20；以p-TTDH2为模板，F3H-TTDH2-F和ATTDH2-R为引物，克隆得到基因片段21；第二轮克隆引物为CPTDH3-F和ATTDH2-R。
(j)利用重叠PCR将启动子PPGK1、基因F3’H、终止子TADH1连接起来，得到表达模块PPGK1-F3’H-TADH1；其中，第一轮以p-PPGK1为模板，APPGK1-F和PPGK1-F3’H-R为引物，克隆得到基因片段22；以p-PF3’H为模板，PPGK1-F3’H-TADH1-F和PPGK1-F3’H-TADH1-R为引物，克隆得到基因片段23；以p-TADH1为模板，F3’H-TADH1-F和ATADH1-R为引物，克隆得到基因片段24；第二轮克隆引物为APPGK1-F和ATADH1-R。
(k)利用重叠PCR将启动子PTEF1、基因CPR、终止子TCYC1连接起来，得到表达模块PTEF1-CPR-TCYC1；其中，第一轮以p-PTEF1为模板，APTEF1-F和PTEF1-CPR-R为引物，克隆得到基因片段25；以p-CPR为模板，PTEF1-CPR-TCYC1-F和PTEF1-CPR-TCYC1-R为引物，克隆得到基因片段26；以p-TCYC1为模板，CPR-TCYC1-F和ATCYC1-R为引物，克隆得到基因片段27；第二轮克隆引物为APTEF1-F和ATCYC1-R。
(l)利用重叠PCR将模块PTDH3-F3H-TTDH2、PPGK1-F3’H-TADH1、PTEF1-CPR-TCYC1连接起来，使用的引物为CPTDH3-F和ATCYC1-R，得到基因片段FFA(PTDH3-F3H-TTDH2→PPGK1-F3’H-TADH1→PTEF1-CPR-TCYC1)。
(m)利用重叠PCR将启动子PTDH3、基因BDH1E221S/I222R/A223S、终止子TTDH2连接起来，得到表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2；其中，第一轮以p-PTDH3为模板，DPTDH3-F和PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-R为引物，克隆得到基因片段28；以p-BDH1E221S/I222R/A223S为模板，PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2-F和PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2-R为引物，克隆得到基因片段29；以p-TTDH2为模板，BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2-F和ATTDH2-R为引物，克隆得到基因片段30；第二轮克隆引物为DPTDH3-F和ATTDH2-R。
(n)利用重叠PCR将启动子PPGK1、基因TYR1、终止子TADH1连接起来，得到表达模块PPGK1-TYR1-TADH1；其中，第一轮以p-PPGK1为模板，APPGK1-F和PPGK1-TYR1-R为引物，克隆得到基因片段31；以p-TYR1为模板，PPGK1-TYR1-TADH1-F和PPGK1-TYR1-TADH1-R为引物，克隆得到基因片段32；以p-TADH1为模板，TYR1-TADH1-F和ATADH1-R为引物，克隆得到基因片段33；第二轮克隆引物为APPGK1-F和ATADH1-R。
(o)利用重叠PCR将启动子PTEF1、基因ARO8、终止子TCYC1连接起来，得到表达模块PTEF1-ARO8-TCYC1；其中，第一轮以p-PTEF1为模板，APTEF1-F和PTEF1-ARO8-R为引物，克隆得到基因片段34；以p-ARO8为模板，PTEF1-ARO8-TCYC1-F和PTEF1-ARO8-TCYC1-R为引物，克隆得到基因片段35；以p-TCYC1为模板，ARO8-TCYC1-F和BTCYC1R为引物，克隆得到基因片段36；第二轮克隆引物为APTEF1-F和BTCYC1R。
(p)利用重叠PCR将模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2、PPGK1-TYR1-TADH1、PTEF1-ARO8-TCYC1连接起来，使用的引物为DPTDH3-F和ATCYC1-R，得到基因片段BTA(PTDH3-BDH1E221S /I222R/A223S-TTDH2→PPGK1-TYR1-TADH1→PTEF1-ARO8-TCYC1)。
表2构建基因表达模块所用引物序列
Figure BDA0002375006040000121
Figure BDA0002375006040000131
2、将DNA片段与载体进行连接。
(a)构建载体pCfB2797TAA：利用限制性内切酶HindIII和NheI消化载体pCfB2797(Addgene)，并将上述方法中获得的基因片段TAA使用同源重组酶(ClonExpress II OneStep Cloning Kit，Vazyme)与其进行连接；连接体系为：线性化pCfB2797载体100ng、纯化后的基因片段TAA 120ng、Exnase II 2μl，5×CE Buffer 4μl；反应条件：37℃，30min。取连接后的载体用于转化大肠杆菌DH10B感受态，37℃培养14～16h，通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，获得连接好的载体pCfB2797TAA。
(b)构建载体pCfB27984CC：利用限制性内切酶HindIII和NheI消化载体pCfB2798(Addgene)，并将上述方法中获得的基因片段4CC使用同源重组酶(ClonExpress II OneStep Cloning Kit，Vazyme)与其进行连接；连接体系为：线性化pCfB2798载体100ng、纯化后的基因片段4CC 120ng、Exnase II 2μl、5×CE Buffer 4μl；反应条件：37℃，30min；取连接后的载体用于转化大肠杆菌DH10B感受态，37℃培养14～16h，通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，获得连接好的载体pCfB27984CC。
(c)构建载体pCfB2989m：以酿酒酵母BY4741基因组为模板，使用MET-F和MET-R为引物(表2)，克隆得到MET筛选标签基因片段(GenBank:CP006432.1)。取pCfB2989载体(Addgene)，使用限制性内切酶Pst1酶消化30min，并纯化线性化的载体；将上述方法中获得的MET筛选标签基因片段使用同源重组酶(ClonExpress II One Step Cloning Kit，Vazyme)与其进行连接；连接体系为：线性化pCfB2989载体100ng、纯化后的MET筛选标签基因片段120ng、Exnase II 2μl、5×CE Buffer 4μl；反应条件：37℃，30min；取连接后的载体用于转化大肠杆菌DH10B感受态，37℃培养14～16h，通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，得到载体pCfB2989m。
(c)构建载体pCfB2989mFFA：利用限制性内切酶HindIII和NheI消化载体pCfB2798m，并将上述方法中获得的基因片段FFA使用同源重组酶(ClonExpress II OneStep Cloning Kit，Vazyme)与其进行连接；连接体系为：线性化pCfB2989m载体100ng、纯化后的基因片段FFA 120ng、Exnase II 2μl、5×CE Buffer 4μl。反应条件：37℃，30min；取连接后的载体用于转化大肠杆菌DH10B感受态，37℃培养14～16h，通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，获得连接好的载体pCfB2798mFFA。
(d)构建单拷贝整合载体p-YJZ-His：以酿酒酵母BY4741基因组为模板，使用引物His-F和His-R进行克隆(引物见表2)，得到His筛选标签基因片段(GenBank:AAA67141.1)；将该基因片段纯化后，连接平末端pEASY-Blunt(全式金生物技术有限公司)，转化DH5α菌株，具体操作见产品说明书，得到单拷贝整合载体p-YJZ-His。
(g)构建单拷贝整合载体p-HBTA：取质粒p-YJZ-His使用限制性内切酶AvaI消化30min，并纯化线性化的载体；将上述方法中获得的基因片段BTA使用同源重组酶(ClonExpress II One Step Cloning Kit，Vazyme)与其进行连接；连接体系为：线性化P-YJZ-His载体100ng、纯化后的基因片段BTA 120ng、Exnase II 2μl、5×CE Buffer 4μl；反应条件：37℃，30min；取连接后的载体用于转化大肠杆菌DH10B感受态，37℃培养14～16h，通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，获得连接好的载体p-HBTA。
实施例4、酿酒酵母工程菌的构建。
1、酿酒酵母工程菌YT1003的构建。
(a)取质粒pCfB2797TAA，使用限制性内切酶NotI进行消化。酶切体系：载体pCfB2797TAA 3～5μg，NotΙ限制性内切酶1～2μL，10x Fast Digest Buffer 5μL，补水至50μL，37℃酶切1～2h。跑电泳检测酶切效果，并纯化。
(b)利用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM酵母转化试剂盒(上海懋康生物科技有限公司)进行酵母转化，将线性化载体pCfB2797TAA转化酿酒酵母BY4741，将线性化的载体整合到酵母染色体的Ty2位点，具体转化方法参照产品说明书，30℃培养4～5d(天)。
(c)利用营养缺陷型培养基SD-URA和菌落PCR筛选阳性转化子。
(d)将阳性转化子接种于4ml SD-URA培养基中，30℃、220rpm条件下培养2d，得到酿酒酵母YT1003菌液。
(e)取500μl上述YT1003菌液，加入500μl灭菌后的50％甘油(v/v)，放置于-80℃保存。
2、酿酒酵母工程菌YT1011的构建。
(a)取质粒pCfB27984CC，使用限制性内切酶NotI进行消化。酶切体系：载体pCfB27984CC 3～5μg，NotΙ限制性内切酶1～2μL，10x Fast Digest Buffer 5μL，补水至50μL，37℃酶切1～2h。跑电泳检测酶切效果，并纯化。
(b)利用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM酵母转化试剂盒(上海懋康生物科技有限公司)进行酵母转化，将线性化载体pCfB27984CC转化酿酒酵母YT1003，将线性化的载体整合到酵母染色体的Ty4位点，具体转化方法参照产品说明书，30℃培养4～5d(天)。
(c)利用营养缺陷型培养基SD-LEU和菌落PCR筛选阳性转化子。
(d)将阳性转化子接种于4ml SD-LEU培养基中，30℃、220rpm条件下培养2d，得到酿酒酵母YC1011菌液。
(e)取500μl上述YT1011菌液，加入500μl灭菌后的50％甘油(v/v)，放置于-80℃保存。
3、酿酒酵母工程菌YT1021的构建。
(a)取质粒pCfB2798mFFA，使用限制性内切酶NotI进行消化。酶切体系：载体pCfB2798FFA 3～5μg，NotΙ限制性内切酶1～2μL，10x Fast Digest Buffer 5μL，补水至50μL，37℃酶切1～2h。跑电泳检测酶切效果，并纯化。
(b)利用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM酵母转化试剂盒(上海懋康生物科技有限公司)进行酵母转化，将线性化载体pCfB2798mFFA转化酿酒酵母YT1011，将线性化的载体整合到酵母染色体的Ty1位点，具体转化方法参照产品说明书，30℃培养4～5d(天)。
(c)利用营养缺陷型培养基SD-MET和菌落PCR筛选阳性转化子。
(d)将阳性转化子接种于4ml SD-MET培养基中，30℃、220rpm条件下培养2d，得到酿酒酵母YC1021菌液。
(e)取500μl上述YT1021菌液，加入500μl灭菌后的50％甘油(v/v)，放置于-80℃保存。
4、酿酒酵母工程菌YT1031的构建。
(a)取质粒p-HBTA，使用引物p-HBTA-F和p-HBTA-R(引物见表2)进行PCR扩增，得到基因整合片段HBTA。
(b)利用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM酵母转化试剂盒(上海懋康生物科技有限公司)进行酵母转化，将基因整合片段HBTA转化酿酒酵母YT1021，将线性化的载体整合到酵母染色体的YKL211C位点，具体转化方法参照产品说明书，30℃培养4～5d(天)。
(c)利用营养缺陷型培养基SD-MET和菌落PCR筛选阳性转化子。
(d)将阳性转化子接种于4ml SD-HIS培养基中，30℃、220rpm条件下培养2d，得到酿酒酵母YC1031菌液。
(e)取500μl上述YT1031菌液，加入500μl灭菌后的50％甘油(v/v)，放置于-80℃保存。
实施例5、酿酒酵母工程菌的构建。
1、菌株YT1031发酵生成紫杉叶素：
(1)将菌株YT1031的单菌落接种到5mL的SD-ULMH培养基中，30℃220rpm培养OD值至2～3。
(2)将菌液接种到3瓶100mL的SD-ULMH培养基中，每瓶接种5mL，30℃220rpm培养OD值至2～3。
(3)将上述3瓶100mL菌液合并，都接种到含有3L发酵培养基的发酵罐(容积为5L)中进行发酵。发酵条件为：温度30℃，转速300～800rpm，pH5.5(用氨水调节)，溶氧值30％以上，通气量3～20L/min，，葡萄糖的起始浓度是30g/L；当溶氧值达到60％时，启动补料系统进行补料(加入补料培养基或补充500g/L的葡萄糖溶液)，补料的速率在5ml/h，使培养基中葡萄糖的含量维持在5g/L；发酵时间为144h，其中发酵108小时后，紫杉叶素产量可以达到最大。
3、发酵产物的萃取、检测及纯化
(1)取上述发酵液加入等体积的乙酸乙酯超声萃取60min，静置24h，取25mL有机层，减压浓缩至干，使用1mL甲醇溶解后过膜后，用安捷伦液质联用仪1260-6130进行LC-MS检测。检测方法：YMC-Pack Pro C18 RS色谱柱进行分析；进样量1μL；柱温28℃；检测波长为290nm。
流动相条件：A(乙腈)、B(0.1％三氟乙酸水溶液)
时间(min) A(％) B(％)
0 15 85
6 20 80
15 25 75
20 40 60
20.1 15 85
22.1 15 85
离子检测设为负离子选择模式并检测m/z 303离子。
(2)结果：酿酒酵母中重建紫杉叶素的生物合成途径如图1所示；酵母菌株发酵产物的LC-MS紫外吸收图和离子流图如图2所示；YT1041产量如图3所示。
实施例6、紫杉叶素的纯化
(1)取实施例5中培养的YC1041的发酵液3升，6000rpm离心，得到菌体和上清部分。
(2)菌体部分使用50％1041乙醇溶液超声(20KHZ-40KHZ)提取1小时，离心，并保留乙醇提取液。
(3)将菌体与步骤(1)中的上清混合，并使用旋转蒸发仪去除掉液体中的乙醇，并使用1M氢氧化钠调节pH至7，得到紫杉叶素粗提液。
(4)将步骤(3)中的紫杉叶素粗提液通过柱体积为3L的大孔吸附树脂D101(广州润皓生物科技有限公司)，让大孔树脂充分吸附粗提液中的紫杉叶素。随后依次使用水、15％(体积分数)乙醇-水、30％(体积分数)乙醇-水和100％乙醇进行梯度洗脱。
(5)富集步骤(4)中洗脱的30％乙醇-水部分，使用旋转蒸发仪蒸发掉水分和乙醇，得到紫杉叶素粗品，纯度超过90％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌及其构建和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 734
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catctgcata ataggcattt gcaagaatta ctcgtgagta aggaaagagt gaggaactat 60
cgcatacctg catttaaaga tgccgatttg ggcgcgaatc ctttattttg gcttcaccct 120
catactatta tcagggccag aaaaaggaag tgtttccctc cttcttgaat tgatgttacc 180
ctcataaagc acgtggcctc ttatcgagaa agaaattacc gtcgctcgtg atttgtttgc 240
aaaaagaaca aaactgaaaa aacccagaca cgctcgactt cctgtcttcc tattgattgc 300
agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt tgtaacaagc 360
aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga tgcccactgt 420
gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca aacagaattg 480
tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta accaaggggg 540
tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa cttgcataaa 600
ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt caagttctta 660
gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta ctttttacaa 720
caaatataaa acaa 734
<210> 2
<211> 419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTEF1
<400> 2
cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac 60
tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt 120
tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc 180
gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc 240
ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt 300
aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt 360
ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taattacaa 419
<210> 3
<211> 676
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTDH3
<400> 3
tcgagtttat cattatcaat actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg 60
attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat 120
gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag 180
tttattcctg gcatccacta aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa 240
aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat 300
tctcttagcg caactacaga gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca 360
atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt 420
atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct 480
gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat 540
aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta 600
cttttatagt tagtcttttt tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca 660
cacataaaca aacaaa 676
<210> 4
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TCYC1
<400> 4
atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 60
ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 120
gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 180
acgctcgaag 190
<210> 5
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TTDH2
<400> 5
atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg 60
acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120
gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg 180
aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240
cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300
gaactctgtg aataattagg ccactgaaat ttgatgcctg aaggaccggc atcacggatt 360
ttcgataaag cacttagtat cacactaatt ggcttttcgc 400
<210> 6
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TADH1
<400> 6
gtagatacgt tgttgacact tctaaataag cgaatttctt atgatttatg atttttatta 60
ttaaataagt tataaaaaaa ataagtgtat acaaatttta aagtgactct taggttttaa 120
aacgaaaatt cttattcttg agtaactctt tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtat 180
agcatgaggt cgctc 195
<210> 7
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> p-HBTA-F
<400> 7
tttcttagca tttttgacga aatttgctat tttgttagag tcttttacac ataacaattt 60
cacacaggaa acagctatga c 81
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> p-HBTA-R
<400> 8
atgtctgtta ttaatttcac aggtagttct ggtccattgg tgaaagtttg tcacgacgtt 60
gtaaaacgac g 71

Claims (10)

1.一种高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌，其特征在于：以酿酒酵母为出发菌株，过表达ARO4 K229L 、ARO7G229S、ARO8、TYR1、BDH1 E221S/I222R/A223S 、4CL1、F3H、F3’H、CPR、CHI、TAL和CHS基因；其中，
所述的ARO4 K229L 为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；
所述的ARO7G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；
所述的BDH1 E221S/I222R/A223S 为BDH1基因的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸；
所述的ARO4的核苷酸序列如GenBank: NM_001178597.1所示；
所述的ARO7的核苷酸序列如GenBank: NM_001184157.1所示；
所述的ARO8的核苷酸序列如GenBank: NM_001181067.1所示；
所述的TYR1的核苷酸序列如GenBank: NM_001178514.1所示；
所述的BDH1的核苷酸序列如GenBank: NM_001178202.2所示；
所述的4CL1的核苷酸序列如GenBank: AY376729所示；
所述的F3H的核苷酸序列如GenBank: NM_114983.3所示；
所述的F3’H的核苷酸序列如GenBank: NM_120881.3所示；
所述的CPR的核苷酸序列如GenBank: NM_118585.4所示；
所述的CHI的核苷酸序列如GenBank: XM_003592713.3所示；
所述的TAL的核苷酸序列如GenBank: KR095308.1所示；
所述的CHS的核苷酸序列如GenBank: AF233638.1所示。
2.根据权利要求1所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。
3.权利要求1所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用重叠PCR构建以下模块和基因片段
（a）将PTDH3、TAL和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-TAL-TTDH2；
（b）将PPGK1、ARO4K229L和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-ARO4K229L-TADH1；
（c）将PTEF1、ARO7G229S和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-ARO7G229S-TCYC1；
（d）将表达模块PTDH3-TAL-TTDH2、PPGK1-ARO4K229L-TADH1和PTEF1-ARO7G229S-TCYC1顺序连接，得到基因片段TAA；
（e）将PTDH3、4CL1和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-4CL-TTDH2；
（f）将PPGK1、CHS和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-CHS-TADH1；
（g）将PTEF1、CHI和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1-CHI-TCYC1；
（h）将表达模块PTDH3-4CL-TTDH2、PPGK1-CHS-TADH1和PTEF1-CHI-TCYC1顺序连接，得到基因片段4CC；
（i）将PTDH3、F3H和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-F3H-TTDH2；
（j）将PPGK1、F3’H和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1-F3’H-TADH1；
（k）将PTEF1、CPR和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1- CPR-TCYC1；
（l）将表达模块PTDH3-F3H-TTDH2、PPGK1-F3’H-TADH1和PTEF1- CPR-TCYC1顺序连接，得到基因片段FFA；
（m）将PTDH3、BDH1E221S/I222R/A223S和TTDH2顺序连接，得到表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2；
（n）将PPGK1、TYR1和TADH1顺序连接，得到表达模块PPGK1- TYR1-TADH1；
（o）将PTEF1、ARO8和TCYC1顺序连接，得到表达模块PTEF1- ARO8-TCYC1；
（p）将表达模块PTDH3-BDH1E221S/I222R/A223S-TTDH2、PPGK1- TYR1-TADH1和PTEF1- ARO8-TCYC1顺序连接，得到基因片段BTA；
（2）构建载体
（I）利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切pCfB2797载体，得到线性化pCfB2797载体；然后将步骤（d）中得到的基因片段TAA连接到线性化pCfB2797 载体上，得到质粒pCfB2797TAA；
（II）利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切载体pCfB2798，得到线性化pCfB2798载体；然后将步骤（h）中得到的基因片段4CC连接到线性化pCfB2798载体上，得到质粒pCfB27984CC；
（III）利用限制性内切酶Pst1切酶pCfB2989载体；得到线性化pCfB2798载体，然后将MET筛选标签基因片段连接到线性化pCfB2798 载体上，得到质粒pCfB2798m；再利用限制性内切酶HindIII和NheI酶切载体pCfB2989m，得到线性化pCfB2989m载体；然后将步骤（l）中得到的基因片段FFA连接到线性化pCfB2989 m载体上，得到质粒pCfB2989mFFA；
（IV）将His筛选标签基因片段连接到pEASY-Blunt载体上，得到质粒p-YJZ-His；然后利用限制性内切酶AvaI酶切质粒p-YJZ-His，得到线性化p-YJZ-His载体；然后将步骤（p）中得到的基因片段BTA连接到线性化p-YJZ-His载体上，得到质粒p-HBTA；
（3）构建菌株YC1041
（A）将质粒pCfB2797TAA用限制性内切酶NotI线性化后转化酿酒酵母BY4741，筛选得到酿酒酵母YT1003；
（B）将质粒pCfB27984CC用限制性内切酶NotI线性化后转化酿酒酵母YT1003，筛选得到酿酒酵母YC1011；
（C）将质粒pCfB2798mFFA用限制性内切酶NotI线性化后转化酿酒酵母YC1011，筛选得到酿酒酵母YC1021；
（D）质粒P-HBTA用引物p-HBTA-F和p-HBTA-R进行PCR扩增，得到基因整合片段HBTA；然后将基因整合片段HBTA转化酿酒酵母YC1031，筛选得到酿酒酵母YC1031，即所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌；其中，引物p-HBTA-F和p-HBTA-R的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.7～8所示。
4.根据权利要求3所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤（a）、（e）、（i）和（m）中所述的PTDH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤（a）、（e）、（i）和（m）中所述的TTDH2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；
步骤（b）、（f）、（j）和（n）中所述的PPGK1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
步骤（b）中所述的ARO4K229L为ARO4基因的第229位的赖氨酸突变为亮氨酸；
步骤（b）（f）、（j）和（n）中所述的TADH1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
步骤（c）、（g）、（k）和（o）中所述的PTEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
步骤（c）中所述的ARO7G229S为ARO7基因的第229位的甘氨酸突变为丝氨酸；
步骤（c）、（g）、（k）和（o）中所述的TCYC1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
步骤（m）中所述的BDH1E221S/I222R/A223S为BDH1的第221位的谷氨酸突变为丝氨酸，第222位的异亮氨酸突变为精氨酸，第223位的丙氨酸突变为丝氨酸。
5.权利要求1或2所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌在生产紫杉叶素中的应用。
6.一种生产紫杉叶素方法，其特征在于：为将权利要求1或2将所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到紫杉叶素。
7.根据权利要求6所述的生产紫杉叶素方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，待当溶氧值达到60%时补加补料培养基，使培养基内葡萄糖的含量维持在5 g/L，得到紫杉叶素。
8.根据权利要求7所述的生产紫杉叶素方法，其特征在于：
所述的发酵培养基的组成如下：30 g/L葡萄糖，(NH4)2SO4 15 g/L，KH2PO4 8 g/L，MgSO43 g/L，ZnSO4•7H2O 0.72 g/L，维生素溶液12 mL/L，以及微量金属盐溶液10 mL/L；
所述的补料培养基组成如下：葡萄糖585 g/L，KH2PO4 9 g/L，MgSO4 2.5 g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28 g/L，维生素溶液12 mL/L，以及微量金属盐溶液10 mL/L；
所述的维生素溶液组成如下：：维生素H 0.05 g/L，泛酸钙1 g/L，烟酸1 g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1 g/L，盐酸吡哆醇1 g/L和对氨基苯甲酸0.2 g/L；
所述的微量金属盐溶液组成如下：EDTA 15 g/L，ZnSO4•7H2O 10.2 g/L，MnCl2•4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5 g/L，CoCl2•6H2O 0.86 g/L，Na2MoO4•2H2O 0.56 g/L，CaCl2•2H2O 3.84 g/L和FeSO4•7H2O 5.12 g/L。
9.根据权利要求7所述的生产紫杉叶素方法，其特征在于：
所述的高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌的接种量为体积百分比0.1%～15%；
所述的发酵培养的条件为：温度25～35℃，pH值3～7，溶氧值30%以上，搅拌速度300～800 rpm，通气量3～20 L/min，发酵时间0～144 h，不包括0。
10.根据权利要求7所述的生产紫杉叶素方法，其特征在于：
所述的活化为多级活化，其通过如下步骤实现：将高产紫杉叶素的酿酒酵母工程菌接种到5mL 的SD-ULMH培养基中，220～250 rpm、30℃条件下培养至OD值2～3；然后将菌液接种到100 mL摇瓶中，220～250 rpm、30℃条件下培养至OD值2～3；
所述的SD-ULMHT培养基的组成如下：YNB 培养基6.7 g/L；URA、LEU、MET、HIS、TRP共缺陷氨基酸100 X 10 mL/L；葡萄糖20 g/L；
所述的URA、LEU、MET、HIS、TRP共缺陷氨基酸100 X的组成成分为：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12 g，天冬氨酸 0.6 g，谷氨酸0.6 g，赖氨酸0.18 g，苯丙氨酸0.3 g，丝氨酸2.25 g，苏氨酸1.2 g，酪氨酸0.18 g，缬氨酸0.9 g，用ddH2O定容到57 mL。
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