CN116064265A - 一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用,该工程菌通过在酿酒酵母染色体上过表达白藜芦醇合成酶STS、对香豆酰基辅酶A连接酶4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶TAL、肉桂酸‑4‑羟化酶C4H、细胞色素P450酶还原酶CPR、DAHP合成酶突变体ARO4、分支酸变位酶突变体ARO7、分支酸合酶ARO2、莽草酸激酶AroL、乙酰辅酶A合成酶ACS和丙二酰辅酶A合成酶ACC1,同时敲除旁路基因CIT2、LPP1、DPP1、PDC6,实现以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇。本发明利用苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶同时以苯丙氨酸和酪氨酸作为底物反应生成白藜芦醇合成的关键前体,强化白藜芦醇合成所需要的前体,使产物白藜芦醇的产量得到了大幅度的提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
白藜芦醇(3,4',5-三羟基二苯乙烯)是一种天然活性物质,是植物体在恶劣环境下或遇到病原体侵害时自身分泌的一种抗毒素,广泛存在于花生、葡萄、虎杖和决明子等天然植物中。近年来的研究表明,白藜芦醇具有抗氧化、抗肿瘤、抗自由基、保护肝脏、保护心血管、调节免疫、抗病毒、抗细菌及真菌、抗变态反应、辐射保护、预防急性传染性非典型肺炎等功效,可广泛应用于医药、食品、化妆品和保健品等领域,是很有潜力的天然化合物。
目前白藜芦醇产品根据生产方式分为三种类型,包括植物提取、合成和发酵,每一种类型都有对应的应用行业,包括膳食补充剂、化妆品、食品和饮料等。目前白藜芦醇最主要的生产方法是植物提取法,国外主要是从葡萄皮和葡萄籽中提取,而我国主要从中药材虎杖的根部提取,在市场中占据主导地位。然而白藜芦醇在植物组织中的含量并不高,提取工艺复杂且提取效率低,需要消耗大量的原材料,虎杖的价格较为昂贵,生长周期较长、容易受到气候变化的影响,使得其生产成本和可控性都受到了一定影响。化学合成法合成的白藜芦醇与天然提取的白藜芦醇具有相同的生物活性,能快速大量生产白藜芦醇,满足市场需求,但化学合成法存在合成路线长、生产成本较高、环境污染严重等问题,需要探寻生产成本低且绿色环保的新方法。鉴于植物提取和化学合成各自的缺陷,寻找高产量、低能耗及减少牺牲环境为代价的生物合成方法,尤其是具有易于发酵生产,生产周期短,生产成本低,产物提纯简便,环境污染少等优势的微生物合成法受到了研究者的青睐。近年来,随着微生物代谢工程与合成生物学技术的进步,在微生物中设计与构建高效的异源合成途径,结合工程菌株的大规模发酵是实现白藜芦醇等植物源天然产物工业化生产的重要方法。
近年来基于微生物细胞工厂生产白藜芦醇的研究取得了诸多进展,如在大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、谷氨酸棒状杆菌等宿主菌中已实现白藜芦醇的异源发酵合成,但仍存在一些亟需解决的问题。值得注意的是,在解除了反馈抑制的前提下,增加解脂耶氏酵母中白藜芦醇异源合成途径的拷贝数,获得了较高的白藜芦醇产量(Sáez-Sáez J,Wang G, Marella E R, et al, Engineering the oleaginous yeast Yarrowialipolytica for high-level resveratrol production[J], Metabolic Engineering,2020, 62: 51-61。但是相比酿酒酵母等模式微生物,对解脂耶氏酵母的系统性研究仍较为有限,不利于进行系统性的代谢途径优化,将限制其对进一步提高白藜芦醇等化合物的发酵产量。
目前应用广泛的多种模式微生物中,酿酒酵母是第一个被全基因组测序的模式真核生物,属于一般公认安全(GRAS)的菌株,含有内质网、线粒体、液泡等细胞器,为植物源膜蛋白的定位和正确折叠提供了基础,在植物源天然产物的异源合成上具有独特的优势。此外,酿酒酵母具有很高的DNA重组效率,基因编辑技术成熟,重组酿酒酵母工程菌株的设计、构建和优化具有良好的基础。但目前报道的产白藜芦醇的酿酒酵母工程菌经分批补料发酵后,产量最高仅0.8 g/L(Li M, Schneider K, Kristensen M, et al, Engineeringyeast for high-level production of stilbenoid antioxidants[J], ScientificReports, 2016, 6(1)),阻碍了高效生物合成白藜芦醇的工业化进程。此外,其他报道的重组酿酒酵母工程菌株的构建或利用苯丙氨酸途径,或利用酪氨酸途径,或通过两个基因实现苯丙氨酸途径和酪氨酸途径的同时利用,尚未有发现利用双功能基因实现白藜芦醇的高效合成的报道。本申请在前人的研究基础上,以新的思路设计和构建了一系列酿酒酵母重组工程菌株,并应用于白藜芦醇的高效合成。
发明内容
本发明提供一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌,为白藜芦醇的高效合成提供新的路径,所述的基因工程菌含有白藜芦醇合成酶基因
STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因
4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因
TAL、肉桂酸-4-羟化酶基因
C4H、细胞色素P450酶还原酶
CPR1基因、丙二酰辅酶A合成酶
ACC1基因、DAHP合成酶突变体
ARO4基因、分支酸变位酶突变体
ARO7基因、分支酸合酶
ARO2基因、莽草酸激酶
AroL基因、乙酰辅酶A合成酶基因
ACS,同时敲除旁路基因CIT2、LPP1、DPP1、PDC6,实现以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇。
所述的白藜芦醇合成酶基因
STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因
4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因
TAL、肉桂酸-4-羟化酶基因
C4H、细胞色素P450酶还原酶
CPR1基因、丙二酰辅酶A合成酶
ACC1基因,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~6所示。
优选的,所述的白藜芦醇合成酶基因
STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因
4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因
TAL、肉桂酸-4-羟化酶基因
C4H、细胞色素P450酶还原酶基因
CPR、DAHP合成酶突变体
ARO4基因、分支酸变位酶突变体
ARO7基因、分支酸合酶
ARO2基因、莽草酸激酶
AroL基因、乙酰辅酶A合成酶基因
ACS和丙二酰辅酶A合成酶
ACC1基因全部置于酿酒酵母染色体上表达;其中白藜芦醇合成酶基因
STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因
4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因
TAL的表达拷贝数≥1个。
优选的,所述的白藜芦醇合成酶基因
STS来源于葡萄(
Vitis vinifera);所述的对香豆酰基辅酶A连接酶基因
4CL来源于欧芹(
Petroselinum crispum);所述的苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因
TAL来源于红球酵母(
Rhodotorula toruloides);所述的肉桂酸-4-羟化酶基因
C4H和细胞色素P450酶还原酶基因
CPR来源于拟南芥(
Arabidopsis thaliana);所述的乙酰辅酶A合成酶基因
ACS来源于沙门氏菌(Salmonella enterica);所述的DAHP合成酶突变体
ARO4基因、分支酸变位酶突变体
ARO7基因、分支酸合酶
ARO2基因、丙二酰辅酶A合成酶
ACC1基因来源于酿酒酵母;所述的莽草酸激酶
AroL基因来自大肠杆菌,分别以酿酒酵母、大肠杆菌的基因组为模板通过PCR扩增得到。
优选的,所述的白藜芦醇合成酶基因
STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因
4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因
TAL肉桂酸-4-羟化酶基因
C4H、细胞色素P450酶还原酶基因
CPR、乙酰辅酶A合成酶基因
ACS的核苷酸序列根据酿酒酵母密码子偏爱性进行密码子优化后进行合成得到。
同时,本发明提供所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法,通过引入白藜芦醇的异源合成途径,即利用苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶同时催化工程菌的酪氨酸、苯丙氨酸的氨解,生成关键中间体肉桂酸、对香豆酸;其中肉桂酸经过肉桂酸-4-羟化酶
C4H和细胞色素P450酶还原酶
CPR的作用生产对香豆酸,而对香豆酸经对香豆酰基辅酶A连接酶
4CL生成对香豆酰基辅酶A,然后在白藜芦醇合成酶
STS作用下生成白藜芦醇;同时,利用利用代谢工程手段强化重组菌芳香氨基酸合成途径及丙二酰辅酶A合成途径,敲除旁路基因减少乙酰辅酶A的消耗,强化白藜芦醇合成所需要的前体,使产物白藜芦醇的产量得到了大幅度的提高。其中基因
RgTAL具有双功能,能够同时以苯丙氨酸和酪氨酸作为底物反应生成白藜芦醇合成的关键前体,Se
ACS、
ACC1、
ARO2、
AROL、ARO4和ARO7基因与白藜芦醇合成的前体供应有关,包括强化丙二酰辅酶A的合成强化和芳香氨基酸的合成强化,PDC6、CIT2等基因则是代谢旁路基因,作为目标整合位点之一插入目标表达片段,同时敲除原有的基因。
具体包括以下步骤:
(1)利用重叠延伸PCR技术或载体构建方法获得各目的基因的表达框,即含启动子-目的基因-终止子序列,使得需要表达的基因带有酿酒酵母的组成型强启动子和终止子,并通过PCR技术或载体构建方法获得表达框的DNA片段;
(2)利用特异性引物扩增获得目标整合位点上下游300-1000 bp的同源臂序列,与需要表达的目的基因表达框通过重叠延伸PCR扩增技术连接,获得在酿酒酵母染色体上特定位点整合的基因表达框片段;
(3)将营养缺陷筛选标签基因
His3、
Ura3、
Leu2、
Lys2与目的基因表达框片段、上下游同源臂序列连接,并转化到酿酒酵母感受态细胞中,通过同源重组将基因整合到染色体上过表达,然后将酿酒酵母感受态细胞在缺少组氨酸、尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸的缺陷培养基中进行阳性克隆的筛选;
或,构建带有能够识别特异性位点的CRISPR-Cas9质粒,与相应的上下游同源臂序列、目的基因表达框序列共同转化到酿酒酵母感受态细胞中,进行酿酒酵母的基因敲除、整合,在含遗传霉素抗性的平板上进行阳性克隆的筛选;
(4)将平板上生长的单菌落接种到YPD液体培养基中,培养16-36小时,将基因组进行PCR扩增验证,获得高产白藜芦醇的酵母基因工程菌株。
作为高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法的进一步改进,所述的目的基因表达框是构建于G418质粒上,并通过PCR扩增得到,具体如下:
(1)以质粒G418为模板,分别在质粒G418上串联
PV基因、
TS基因、基因
C4H、
Aro47基因、
AroL2基因和
ACC1基因,构建得到质粒G418-PV、质粒G418-TS、质粒G418-
C4H、质粒G418-Aro47、质粒G418-
AroL2和质粒G418-
ACC1;
(2)在质粒G418-PV、质粒G418-TS、质粒G418-
C4H、质粒G418-Aro47、质粒G418-
AroL2和质粒G418-
ACC1上分别串联
Pc4CL-
VvSTS基因、
RgTAL-
VvSTS基因、
AtCPR1-At基因
C4H、
ARO4-ARO7基因、
AROL-
ARO2基因和
ACC1基因,构建得到目的基因表达框;
步骤(1)中的质粒构建方法如下:
通过PCR扩增获得质粒G418骨架片段和整合的基因片段,将片段混合后,加入In-fusion Cloning Mixture,50℃反应50分钟,所得的转化液转入大肠杆菌感受态细胞,并对单菌落进行验证,最终通过测序验证得到正确的质粒。
作为高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法的进一步改进,通过营养缺陷筛选标签基因构建重组菌株的方法如下:
以酿酒酵母为出发菌株,以营养缺陷基因
His3或
Ura3或
Leu2或
Lys2作为筛选标签,将目的基因表达框整合到酿酒酵母基因组的YORW∆17位点、或Ura3位点、或Leu2位点、或Lys2位点,构建得到重组菌株;具体构建方法如下:
所述的酿酒酵母为模式菌株BY4742(MATα,his3Δ1,leu2Δ0,lys2Δ0,Ura3Δ0),该该菌株在缺少组氨酸、亮氨酸、赖氨酸和尿嘧啶的CM培养基中不能生长;
所述的CM培养基含有以下含量组分:0.67 g/L无氨基酵母氮源(YNB)、葡萄糖20g/L,苏氨酸 0.15 g/L,酪氨酸 0.03 g/L,缬氨酸 0.15 g/L,谷氨酸 0.10 g/L,丝氨酸0.15 g/L,天冬氨酸 0.1 g/L,甲硫氨酸 0.02 g/L,苯丙氨酸 0.05 g/L,异亮氨酸 0.03g/L,精氨酸 0.02 g/L,腺嘌呤 0.05 g/L,色氨酸0.1 g/L,以及其他营养成分(赖氨酸0.03 g/L,尿嘧啶 0.05 g/L,组氨酸 0.1 g/L,亮氨酸 0.1 g/L),并利用氢氧化钠调pH至5.6-6.5;固体培养基加入2%的琼脂粉。
作为高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法的进一步改进,所述的能够识别特异性位点的CRISPR-Cas9质粒,用于进行CRISPR-Cas9基因操作,分别对酿酒酵母基因组上的CIT2、LPP1、PDC6和DPP1位点进行编码基因序列的敲除,同时对应整合
RgTAL-
VvSTS、
RgTAL-
VvSTS、
ACC1S659A/S1157A和
Pc4CL-
VvSTS的基因表达框,得到重组工程菌株;或者,对酿酒酵母基因组上的PHA2位点的编码序列进行敲除,构建得到重组工程菌株;或者,在酿酒酵母基因组上的1309a、511b、911b位点插入目的基因的表达框,构建得到重组工程菌。
所述的能够识别特异性位点的CRISPR-Cas9质粒,构建方法如下:
以带有特定的识别位点的识别序列的引物对原始的pCas质粒进行全质粒PCR扩增或无缝克隆,替换pCas质粒上特定的20 bp识别序列,获得特定位点的pCas质粒,然后将其转化到大肠杆菌感受态细胞中,挑取单菌落到培养基中培养,提取质粒并进行测序验证;
所述的特异性识别位点及其识别序列如下:
CIT2:GTTATGGTCATGCTGTGCTA;
LPP1:GCCATGACAGAGATCATCCT;
PHA2:TCAGCGACAAAAGTAAACAG;
1309a:CCTGTGGTGACTACGTATCC;
511b:CAGTGTATGCCAGTCAGCCA;
PDC6:GATGCGTGCGTAACCATCGG;
911b:GTAATATTGTCTTGTTTCCC;
DPP1:GATCGTTGCCAACCTGTTGA。
同时,本发明还提供所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的应用,利用重组工程菌株在不同发酵培养基中合成白藜芦醇。即从平板中挑取单菌落或从甘油保藏管中将重组工程菌接入到2-20 mL液体培养基中,培养16-36 h,得到种子液;将所述的种子液接入到含有底物葡萄糖的发酵培养基中,进行发酵培养并实现白藜芦醇的合成,培养的温度28-33℃,培养时间48-156 h,pH 4.5-6.5,发酵过程补加葡萄糖,合成的白藜芦醇产量根据重组工程菌株的特点及培养方式变化较大,最高产量为4.0 g/L。
与现有技术相比较,本发明的有益效果如下:
(1)本发明的基因工程菌整合了白藜芦醇合成酶
STS、对香豆酰基辅酶A连接酶
4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶
TAL、肉桂酸-4-羟化酶
C4H、细胞色素P450酶还原酶
CPR、DAHP合成酶突变体
ARO4、分支酸变位酶突变体
ARO7、分支酸合酶
ARO2、莽草酸激酶
AroL、乙酰辅酶A合成酶
ACS和丙二酰辅酶A合成酶
ACC1基因,回补了酿酒酵母BY4742的4种营养缺陷基因,同时敲除CIT2、LPP1、DPP1、PDC6旁路基因,最终获得的重组酿酒酵母基因工程菌株显著地提高了产物白藜芦醇的含量。
(2)本发明的基因工程菌合成白藜芦醇的途径利用苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶
TAL,能够同时利用苯丙氨酸和酪氨酸作为底物,生成白藜芦醇合成需要的前体,提高白藜芦醇的合成通量,最终提高产物白藜芦醇的含量。
(3)本发明的基因工程菌的异源基因表达稳定,发酵无需添加抗生素、诱导剂、营养缺陷氨基酸等,降低了生产成本;无需外源添加对香豆酸、肉桂酸、苯丙氨酸、酪氨酸等前体物质及浅蓝菌素等添加剂,避免了添加物对细胞的毒性,发酵工艺简单可控,为白藜芦醇的安全生物生产提供了简单有效的实施方法,具有良好的工业应用潜质。
(4)本发明的基因工程菌以模式酿酒酵母为底盘,工程菌的的构建过程中基因的表达框、整合位点、拷贝数等信息明确,菌株遗传背景清晰,有利于提高白藜芦醇的产量。
附图说明
图1为基因工程菌合成白藜芦醇的代谢路径图。
图2为白藜芦醇合成途径的基因表达框的质粒图谱。
图3为CRISPR-Cas9基因编辑技术所需的质粒pCas的图谱。
图4为实施例3中HPLC检测对香豆酸和白藜芦醇的图谱及标准曲线。
图5为实施例3中重组工程菌在合成培养基中的发酵产生白藜芦醇的过程。
图6实施例4中重组工程菌的批次-补料发酵过程。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
以下实施例中对重组菌的构建,仅列出典型的构建方法,没有对每一个工程菌的构建过程进行详细列举,但是在表1中已经把本发明涉及到的菌种及其基因型列出,均可根据基因型构建获得本发明中的重组菌株。
表1:
菌种 | 基因型 |
BR1 | <![CDATA[BY4742-<i>yorw∆17</i>::HIS3/<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>VvSTS</i>-<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i> P</i><sub><i>TEF1</i></sub>-<i>Pc4CL</i>-<i>T</i><sub><i>CYC1</i></sub>]]> |
BRT2 | <![CDATA[BR1-<i>ura3</i>::<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>RgTAL</i>-<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i>P</i><sub><i>TDH3</i></sub>-<i>VvSTS</i>-<i> T</i><sub><i>CYC1</i></sub>/ URA3]]> |
BRT3 | <![CDATA[BRT2<i>- cit2∆</i>::<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>RgTAL</i>-<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i>P</i><sub><i>TDH3</i></sub>-<i>VvSTS</i>-<i> T</i><sub><i>CYC1</i></sub>]]> |
BRT3-1 | BRT2 |
BRT4 | <![CDATA[BRT3-<i> leu2</i>::<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i> AtCPR1</i>-<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i>P</i><sub><i>TDH3</i></sub>-<i>AtC4H- T</i><sub><i>CYC1</i></sub>/ LEU2]]> |
BRT5 | <![CDATA[BRT4-<i> lpp1∆</i>::<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>RgTAL</i>-<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i>P</i><sub><i>TDH3</i></sub>-<i>VvSTS</i>-<i> T</i><sub><i>CYC1</i></sub>]]> |
BRT6 | <![CDATA[BRT5<i>-1309a</i>::<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>ARO4</i> -<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i>P</i><sub><i>TEF1</i></sub>-<i>ARO7</i>-<i> T</i><sub><i>CYC1</i></sub>]]> |
BRT7 | <![CDATA[BRT6<i>-511b</i>::<i>T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>EcAROL</i> -<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i>P</i><sub><i>TEF1</i></sub>-<i>ARO2</i> -<i> T</i><sub><i>CYC1</i></sub>]]> |
BRT8 | <![CDATA[BRT7<i>-pdc6∆</i>::<i> P</i><sub><i>TEF1</i></sub>-<i>ACC1</i><sup><i>S659A/S1157A</i></sup> -<i>T</i><sub><i>CYC1</i></sub>]]> |
BRT8-1 | <![CDATA[BRT7<i>-911b</i>::<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>SeACS</i><sup><i>L641P</i></sup> -<i>P</i><sub><i>TDH3</i></sub><!-- 5 -->]]> |
BRT9 | <![CDATA[BRT8-<i>dpp1∆</i>::<i> T</i><sub><i>ADH1</i></sub>-<i>VvSTS</i>-<i> P</i><sub><i>PGK1</i></sub>/<i> P</i><sub><i>TEF1</i></sub>-<i>Pc4CL</i>-<i> T</i><sub><i>CYC1</i></sub>]]> |
BRT10 | BRT9-::LYS2 |
实施例1:表达白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建
1、目的基因表达框的构建
以质粒G418为模板,分别在质粒G418上串联
PV基因、
TS基因、基因
C4H,以及酿酒酵母启动子基因
PGK1、
TEF1、
TDH3、酿酒酵母终止子基因
tADH1/
tCYC,经过测序验证,构建得到含有酿酒酵母启动子和终止子基因的G418-PV质粒、G418-TS质粒、G418-
C4H质粒;利用相同的方法构建质粒G418-Aro47、G418-
AroL2和G418-
ACC1,用于提高重组工程菌的前体供应,提高白藜芦醇的产量,具体的质粒图谱如图2所示。
上述的6个质粒构建完成后经过测序验证,基因表达框序列经扩增获得,再与目标整合位点的上游、下游同源臂序列、营养缺陷筛选标签通过重叠延伸PCR扩增,构建得到目的基因表达框。
其中,tADH1/tCYC为酿酒酵母终止子,PGK1、TEF1、TDH3为酿酒酵母启动子,均可从酿酒酵母基因组上扩增得到,也可通过基因合成获得。
白藜芦醇的途径基因
RgTAL、
Pc4CL和
STS均经过酿酒酵母的密码子偏好优化合成获得。相关质粒的构建方法是通用的分子生物学方法。
本实施例是利用无缝克隆(In-fusion)的方法进行质粒的构建,首先利用引物GJ-F和GJ-R扩增获得质粒G418的骨架,该骨架可用于本实施例涉及的6个质粒的构建,具体如下:
(1)分别用引物
G418-PV-F1/R1、
G418-PV-F2/R2、
G418-F3/R3扩增得到
Pc4CL、
PGK1-TEF1、
VvSTS片段,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,再将大小正确的条带切下,并进行基因的回收,纯化得到的基因片段用NanoDrop测定浓度,并按照骨架50 ng,片段100 ng的体系将片段混合,加入In-Fusion 2X Mixture,混合均匀后再50℃保温50 分钟,得到重组产物。将重组产物转化到大肠杆菌感受态细胞中,并通过菌落PCR初步验证后送公司测序验证正确后,得到质粒G418-PV。
(2)按照步骤(1)的方法,分别用引物
G418-TS-F0、
G418-TS-F1/R1、
G418-TS-F2/
R2、
G418-TS-F3/R3扩增获得
RgTAL、
PGK1-TDH3、
VvSTS片段,与骨架进行无缝克隆连接并验证,得到质粒G418-TS;
(3)按照步骤(1)的方法,分别用引物
G418-C4H-F1/R1、
G418-C4H-F2/R2、
G418-
C4H-F3/R3扩增获得
AtCPR1、
PGK1-TEF1、
AtC4H片段,与骨架进行无缝克隆连接并验证,得到质粒G418-
C4H;
(4)按照步骤(1)的方法,分别用引物
G418-AroL2-F1/R1、
G418-AroL2-F2/R2、
G418-AroL2-F3/R3扩增获得
AROL、
PGK1-TEF1、
ARO2片段,与骨架进行无缝克隆连接并验证,得到质粒G418-
AroL2。
(5)针对含有突变基因的质粒,利用引物
G418-Aro47-F1/R1/F2/R2分别扩增得到
ARO4的突变位点两侧的片段,利用引物
G418-Aro47-F4/R4/F5/R5分别扩增得到
ARO7的两个片段,通过
G418-Aro47-F1/R2、
G418-Aro47-F4/R5作为引物,相应的
ARO4和
ARO7两个片段为模板,扩增获得
ARO4和
ARO7的基因片段,最后进行无缝克隆连接并验证,得到质粒G418-Aro47。
(6)质粒G418-
ACC1的构建,是以G418-PV质粒为模板,
GJ-F和
G418-ACC1-R0为引物扩增得到G418-PV骨架(已含启动子序列),再分别以引物
G418-ACC1-F1/R1/F2/R2/F3/R3扩增获得
ACC1 S659A/S1157A 突变体的3个片段,3个片段直接与G418-PV骨架进行无缝克隆,最终转化大肠杆菌并测序验证,得到质粒G418-
ACC1。
上述使用的引物序列如表2所示。
表2:
GJ-F | tcatgtaattagttatgtcacgcttaca |
GJ-R | agttataaaaaaaataagtgtatacaaattttaaag |
G418-PV-F1 | cacttattttttttataactttactttggcaaatcaccagagg |
G418-PV-R1 | atgggtgattgtgttgctcca |
G418-PV-F2 | ggagcaacacaatcacccattgttttatatttgttgtaaaaagtagataattact |
G418-PV-R2 | cttcaacggaagccattttgtaattaaaacttagattagattgctatg |
G418-PV-F3 | caaaatggcttccgttgaagaattca |
G418-PV-R3 | tgacataactaattacatgatcaattggtaacggttggaaca |
G418-TS-F0 | atggcttccgttgaagaattca |
G418-TS-F1 | cacttattttttttataactttaagccaacattttcaataaaacatt |
G418-TS-R1 | acaatggctcctagaccaactagtcaaa |
G418-TS-F2 | gttggtctaggagccattgttttatatttgttgtaaaaagtagataattact |
G418-TS-R2 | caacgctagtatacgcacagatattataacatctgcac |
G418-TS-F3 | ctgtgcgtatactagcgttgaatgttagcgtca |
G418-TS-R3 | aattcttcaacggaagccattttgtttgtttatgtgtgtttattcga |
G418--F1 | cacttattttttttataacttcaccagacatctctgaggtatcttc |
G418--R1 | atgacttctgctttgtatgcttccg |
G418--F2 | gcatacaaagcagaagtcattgttttatatttgttgtaaaaagtagataattact |
G418--R2 | ccaacaacaacaagtccattttgtttgtttatgtgtgtttattcga |
G418--F3 | aatggacttgttgttgttggaaaag |
G418--R3 | tgacataactaattacatgatcaacagtttcttggcttcataacg |
G418-Aro47-F1 | cacttattttttttataactctatttcttgttaacttctcttctttgtctg |
G418-Aro47-R1 | gggtgttactctacatggtgttgctgctatcacc |
G418-Aro47-F2 | caccatgtagagtaacacccatgaaatggtgaga |
G418-Aro47-R2 | caatgagtgaatctccaatgttcgc |
G418-Aro47-F3 | cattggagattcactcattgttttatatttgttgtaaaaagtagataattact |
G418-Aro47-R3 | ctggttttgtgaaatccattttgtaattaaaacttagattagattgctatg |
G418-Aro47-F4 | aatggatttcacaaaaccagaaactg |
G418-Aro47-R4 | ctctagtggcaacagaactgaagttattcttatcatcaccatctcttt |
G418-Aro47-F5 | cagttctgttgccactagagatatagaatg |
G418-Aro47-R5 | tgacataactaattacatgattactcttccaaccttcttagcaagt |
G418-2-F1 | cacttattttttttataacttcaacaattgatcgtctgtgcc |
G418-2-R1 | taaaacaatgacacaacctctttttctgatcg |
G418-2-F2 | gaggttgtgtcattgttttatatttgttgtaaaaagtagataattact |
G418-2-R2 | cccaaacgttgacattttgtaattaaaacttagattagattgctatg |
G418-2-F3 | acaaaatgtcaacgtttgggaaactgtt |
G418-2-R3 | tgacataactaattacatgattaatgaaccacggatctggaga |
G418--R0 | tttgtaattaaaacttagattagattgctatg |
G418--F1 | atctaagttttaattacaaaatgagcgaagaaagcttattcga |
G418--R1 | accatcagctagttgacgcagtatgatatcacattta |
G418--F2 | tgcgtcaactagctgatggtggtcttttgattgc |
G418--R2 | tgaaacagcaacagccctgttcatacccatt |
G418--F3 | acagggctgttgctgtttcagatttgtcatatgttgc |
G418--R3 | tgacataactaattacatgattatttcaaagtcttcaacaatttttctt |
上述的基因表达框即tADH1-tCYC之间的序列可以在G418质粒上构建,也可以在任何质粒骨架上构建获得,或通过重叠延伸PCR扩增获得,主要目的是得到完整的基因表达框序列。
、通过营养缺陷筛选标签构建重组酿酒酵母工程菌
以表1中的重组工程菌BR1的构建为例,该菌株以His3作为筛选标签,将
Pc4CL-
VvSTS的表达框整合到酿酒酵母基因组YORW∆17位点,具体操作过程如下:
(1)用引物对YORW-Up-F/YORW-Up-R、YORW-Down-F/YORW-Down-R扩增获得整合位点上下游的同源臂序列;
(2)用引物对Y-His3-F/Y-His3-R扩增合成的His3筛选标签;
(3)用引物对Y-TADH1-F/Y-TADH1-R分别扩增G418-PV质粒获得
Pc4CL-
VvSTS的表达框,相关的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测,并进行切胶回收,获得YORW上游同源臂500bp、His3筛选标签1000bp、
Pc4CL和
VvSTS表达框和YORW下游同源臂4个片段。
扩增所需的引物序列如表3。
表3:
YORW-Up-F | tgtgcacaaaggccataatattatg |
YORW-Up-R | attaccgaggcataaaaaaatatagagtgtactaggatggcatgagttatggttg |
Y-His3-F | ttggtaactgtgcaaccataactcatgccatcctagtacactctatatttttttatg |
Y-His3-R | ctcttattgaccacacctctaccggcatgccgactacataagaacacctttggtg |
Y-TADH1-F | acgatgttccctccaccaaaggtgttcttatgtagtcggcatgccggtagaggtg |
Y-TCYC1-R | gaattttgagagcccacttttgttggggacgattgcaaattaaagccttcgagc |
YORW-Down-F | ggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaatcgtccccaacaaaagtg |
YORW-Down-R | aaagctggctccccttagac |
(4)将胶回收的片段转化到感受态酵母细胞中,具体如下:
1)将酿酒酵母甘油菌在无抗YPD平板上划线培养2-3天,挑取单菌落接入YPD液体培养基中,30℃摇床220 r/min,过夜活化培养。
2)将过夜培养的菌液转接到50 mL YPD培养基中使其初始OD600为0.2。
3)在30℃摇床220 r/min培养至OD600为0.8时,3600 r/min离心5 min收集菌体。加入灭菌后的ddH2O离心洗两遍,每次加入ddH2O 35 mL。
4)加入900 μL无菌ddH2O重悬,每管100 μL分装到1.5 mL离心管,离心弃上清。
5)向细胞沉淀中加入360 µL转化体系,用移液器混匀;转化体系如表4所示。
表4:
转化体系 | 体积 |
PEG3350(50%(w/v)过滤除菌) | 240 µL |
醋酸锂溶液(1.0 M) | 36 µL |
鲑鱼精DNA(10 mg/mL) | 10 µL |
筛选标签 | 每个片段400-1000 ng |
YORW上游同源臂500bp | 200-1000 ng |
表达框 | 200-1000 ng |
YORW下游同源臂500bp | 200-1000 ng |
总体积 | <![CDATA[加ddH<sub>2</sub>O补足360 µL]]> |
6)转化体系在30℃水浴20 min,随后42℃热激40 min,取180μL涂板,30℃培养2-3天,待长出单克隆后进行验证。
7)将单克隆涂布在CM-His(即缺少组氨酸)培养基上进行筛选培养,得到酵母基因工程菌BR1。
(5)按照步骤(1)-(4)的方法,以菌株BR1为出发菌株,Ura3为筛选标签,在Ura3位点整合
RgTAL-
VvSTS的基因表达框,重组菌株涂布在CM-His-Ura(即缺少组氨酸和尿嘧啶)培养基中进行筛选,得到酿酒酵母基因工程菌BRT2;该菌株可以直接以葡萄糖为碳源,合成白藜芦醇;
以菌株BRT3为出发菌株,Leu2为筛选标签,在Leu2位点整合
AtCPR1-At基因
C4H表达框,并利用CM_His-Ura-Leu即缺少组氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)培养基中进行筛选,得到酿酒酵母基因工程菌BRT4;
以菌株BRT9为出发菌株,Lys2为筛选标签,直接整合Lys2序列,并利用无氨基酸的培养基(仅含20 g/L葡萄糖、6.7 g/L无氨基酵母氮源、20 g/L琼脂粉)筛选得到酿酒酵母基因工程菌BRT10。
所述的CM培养组分含量如下:无氨基酵母氮源(YNB) 0.67 g/L、葡萄糖20 g/L,苏氨酸 0.15 g/L,酪氨酸 0.03 g/L,缬氨酸 0.15 g/L,谷氨酸 0.10 g/L,丝氨酸 0.15 g/L,天冬氨酸 0.1 g/L,甲硫氨酸 0.02 g/L,苯丙氨酸 0.05 g/L,异亮氨酸 0.03 g/L,精氨酸 0.02 g/L,腺嘌呤 0.05 g/L,色氨酸0.1 g/L以及其他营养成分(赖氨酸 0.03 g/L,尿嘧啶 0.05 g/L,组氨酸 0.1 g/L,亮氨酸 0.1 g/L),并利用氢氧化钠调pH至5.6-6.5。固体培养基加入2%的琼脂粉。当培养基中根据需要省去相应的氨基酸时,可以用于筛选重组酿酒酵母工程菌。
将平板上生长的单克隆挑取到相应的液体培养基中,30℃摇床220 r/min,活化培养16-36 小时,取其中2 mL菌液离心收集菌体,按照常规的酚氯仿基因组抽提方法,抽提转化子的基因组,并进行PCR扩增验证,通过扩增条带的大小判断是否整合成功。
本实施例中构建的基因工程菌合成白藜芦醇的代谢路径以及涉及的基因如图1所示。
实施例2:通过CRISPR-Cas9构建重组酿酒酵母工程菌
由于酿酒酵母BY4742中仅有4个营养缺陷筛选标签可以使用,当完成4次整合后,没有经过标签回收,会导致无筛选标签可用。因此,本实施例开发利用CRISPR-Cas9基因编辑方法构建重组菌株,以带有特定的识别位点的识别序列的引物对原始的pCas质粒进行全质粒PCR扩增,获得PCR扩增产物,向扩增产物中加入限制性内切酶Dpn I及其缓冲液,37℃保温10-90 分钟,得到的产物转化到大肠杆菌感受态细胞中,挑取单菌落到培养基中培养8-16 h,提取质粒并进行测序验证。
以实施例1构建的重组菌BRT3为例,具体如下:
将
RgTAL-
VvSTS表达框整合到位点CIT2中,在敲除酿酒酵母CIT2基因的同时,实现
RgTAL-
VvSTS的表达,操作过程如下:
(1)分别用引物对CIT2-Up-F/CIT2-Up-R、CIT2-Down-F/CIT2-Down-R扩增获得整合位点上下游的同源臂序列,引物对CIT2-tADH-F/CIT2-tCYC1-R扩增质粒G418-TS获得
RgTAL-
VvSTS的表达框,相关的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测,并进行切胶回收,获得整合CIT2位点的3个片段,或可进一步通过重叠延伸PCR扩增获得完整的整合片段。
(2)将CIT2-pCas质粒、CIT2位点的整合片段按上述的酿酒酵母转化方法进行转化,并涂布含G418的YPD平板,30℃培养2-3天。
所涉及的pCas质粒图谱如图3所示,所涉及的敲除或整合位点的特异性识别序列如表5所示,可以通过全质粒PCR扩增、无缝克隆等方法替换原始质粒上的特定的20 bp识别序列,获得特定位点的pCas质粒,并通过测序验证识别序列的正确。
表5:
识别位点 | 特异性识别序列 |
CIT2 | GTTATGGTCATGCTGTGCTA |
LPP1 | GCCATGACAGAGATCATCCT |
PHA2 | TCAGCGACAAAAGTAAACAG |
1309a | CCTGTGGTGACTACGTATCC |
511b | CAGTGTATGCCAGTCAGCCA |
PDC6 | GATGCGTGCGTAACCATCGG |
911b | GTAATATTGTCTTGTTTCCC |
DPP1 | GATCGTTGCCAACCTGTTGA |
平板培养获得的单菌落在含G418的YPD液体培养基中培养16-36小时后,与实施例1通过营养缺陷标签筛选获得的重组菌类似的方法进行筛选,最后获到阳性克隆。将阳性克隆子在无抗的YPD培养基中传代培养,直至丢失pCas质粒,即完成一次CRISPR-Cas9的基因编辑。
按照上述的方法,以表1中的其他重组工程菌株出发构建新的的重组工程菌,具体如下:
(1)以菌株BRT2为出发菌株,PHA2-pCas质粒为特异性识别质粒,构建得到敲除了PHA2基因的重组工程菌BRT3-1。
(2)以菌株BRT4为出发菌株,LPP1-pCas质粒为特异性识别质粒,在敲除LPP1编码序列的基础上整合
RgTAL-
VvSTS表达框,构建得到重组工程菌BRT5。
(3)以菌株BRT5为出发菌株,1309a-pCas质粒为特异性识别质粒,整合ARO4-ARO7表达框,构建得到重组工程菌BRT6。
(4)以菌株BRT6为出发菌株,511b-pCas质粒为特异性识别质粒,整合
AROL-
ARO2表达框,构建得到重组工程菌BRT7。
(5)以菌株BRT7为出发菌株,PDC6-pCas质粒为特异性识别质粒,整合
ACC1 S659A/S1157A表达框,构建得到重组工程菌BRT8。
(6)以菌株BRT7为出发菌株,911b-pCas质粒为特异性识别质粒,整合Se
ACSL641P表达框,构建得到重组工程菌BRT8-1。
实施例3:重组工程菌发酵生产白藜芦醇
1、白藜芦醇的检测方法
白藜芦醇的检测主要利用HPLC检测,检测条件:岛津LC-20ADXRHPLC系统;SPD-20A紫外可见光检测器;Kinetex 5µm C18 100 Å LC Column(250×4.6 mm);流动相A=乙腈,流动相B=水(含0.1%甲酸)。梯度洗脱条件:流速1 mL/min;柱温:30℃;进样量:20 µL;检测波长:303 nm。梯度洗脱条件:0 min,5% A,95% B;3 min:10% A,90% B;5 min:30% A,70% B;10 min:70% A,30% B;10.5 min:95% A,5% B;10.5-12.5 min:95% A,5% B;13 min:5% A,95% B;16 min,结束。
利用该方法对白藜芦醇和中间体对香豆酸的标准品混合溶液进行检测,检测结果如图4所示,其中白藜芦醇的出峰时间约为10.1 min,对香豆酸的出峰时间约为9.1 min。
样品处理方法:发酵结束后的发酵液(包括菌体和液体混匀)通过乙酸乙酯萃取、旋干、甲醇复溶后进行HPLC检测,或在发酵液中加入1-9倍体积的乙醇稀释,震荡提取,离心后将上清液进行HPLC检测,可以检测发酵液中白藜芦醇的含量。
、营养丰富培养基的摇瓶发酵
将实施例1构建的白藜芦醇重组工程菌在YPD平板上划线培养2-3天,挑取单克隆到2-10 mL的YPD液体培养基中,30℃,180-250 转/分钟的摇床培养16-36 h,获得种子;将种子按照0.5%-10%的接种量转接到新鲜的YPD液体培养基中,30℃,180-250 转/分钟培养60-156 h。发酵结束对样品进行检测,得到实施例1中的12株重组白藜芦醇工程菌的白藜芦醇产量,具体如表6所示。
所述的YPD液体培养基含10 g/L 酵母粉,20 g/L蛋白胨,20 g/L葡萄糖。
表1中的重组工程菌BR1需要在培养基中添加对香豆酸0.1-1 mmol/L,才可以通过发酵合成白藜芦醇。其他重组工程菌株均无需添加培养基成分外的任何前体物质,通过发酵即可从葡萄糖出发合成白藜芦醇。
表6:
菌种 | 产量1(mg/L) | 产量2(mg/L) |
BR1 | 3.69 | 4.82 |
BRT2 | 73.39 | 94.04 |
BRT3 | 95.12 | 105.39 |
BRT3-1 | 145.77 | 247.25 |
BRT4 | 310.12 | 592.01 |
BRT5 | 308.15 | 682.00 |
BRT6 | 470.66 | 1014.50 |
BRT7 | 475.84 | 1155.02 |
BRT8 | 478.46 | 1099.21 |
BRT8-1 | 447.88 | 826.91 |
BRT9 | 486.68 | 1139.94 |
BRT10 | 505.75 | 1078.81 |
注:产量1中YPD培养基中葡萄糖含量2%,产量2中葡萄糖含量4%,其中菌种BR1的发酵在培养基中加入了0.5 mmol/L的对香豆酸,其他菌种均为从头合成白藜芦醇。
本实施例的摇瓶发酵生产白藜芦醇的产量高,已经达到1 g/L的水平,比目前论文报道的最高的重组酿酒酵母发酵生产的白藜芦醇最高产量(批次补料发酵)0.8 g/L更高,表明本发明构建的重组菌株在白藜芦醇的产量和发酵工艺上具有明显的优势。
、完全合成培养基的摇瓶发酵
除了在营养丰富的培养基中发酵生产白藜芦醇,实施例1的重组工程菌也能在廉价的培养基中生长并合成白藜芦醇,这些廉价培养基主要包含碳源(如葡萄糖、糖蜜等)、无机氮源(如硫酸铵、氯化铵、氨水等)、无机磷源(如磷酸二氢钾、磷酸二氢钠等)、镁离子(如硫酸镁、氯化镁等),微量金属元素和维生素溶液和必需氨基酸,相比酵母粉、蛋白胨等营养丰富的培养基,该合成培养基价格低廉,能有效降低发酵生产白藜芦醇的成本。
本实施例中主要以实施例1中构建的菌种BRT8、BRT9和BRT10的发酵为例,种子的制备过程与营养丰富的培养基的摇瓶发酵一致,差别仅在于发酵培养基的成分,其发酵过程结果如图5所示。由图中可知,菌种BRT9和BRT10的白藜芦醇产量相当,其中BRT10不需要在培养基中添加额外的氨基酸(赖氨酸)即可实现高效发酵合成白藜芦醇,进一步降低了发酵成本。
进一步考虑到菌种BRT10的优势,以及甘蔗糖蜜的营养丰富特性,将菌种BRT10在仅含4%糖蜜、硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁的培养基中发酵72小时,HPLC检测发现白藜芦醇的产量达到473.5 mg/L,相比葡萄糖作为碳源的合成培养基,无需添加微量金属离子及维生素溶液,进一步降低发酵生产成本,并获得更高的白藜芦醇产量。
实施例4:3 L发酵罐的批次-补料发酵
将实施例1中的重组工程菌BRT10在3 L发酵罐中进行批次-补料的发酵生产,初始培养基为葡萄糖(2%)、硫酸铵(1.5%)、磷酸二氢钾(0.8%)和硫酸镁(0.5%),添加微量金属元素和维生素溶液,接种量为10%,发酵过程温度控制在30℃,通过补加氨水、磷酸将pH控制在5.0,通气量1 vvm,发酵开始16-24 小时左右开始补料,补料液为500-750 g/L的葡萄糖溶液,每小时补料速度控制在1-5 g/L之间,最终发酵过程菌体生长和白藜芦醇的产量结果如图6所示。由图可知,通过补料发酵,白藜芦醇的产量在发酵约80 小时即可达到3.0 g/L,发酵120小时,白藜芦醇的产量达到4.0 g/L,菌体生物量即OD600达到128。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例,不用于限制本发明,本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内,对本发明做出各种修改或等同替换,这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌,其特征在于:所述的工程菌含有白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸-4-羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR1、丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1、DAHP合成酶突变体基因ARO4、分支酸变位酶突变体基因ARO7、分支酸合酶基因ARO2、莽草酸激酶基因AroL、乙酰辅酶A合成酶基因ACS,同时敲除旁路基因CIT2、LPP1、DPP1、PDC6;
所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸-4-羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR1、丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~6所示。
2.根据权利要求1所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌,其特征在于:所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸-4-羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR、DAHP合成酶突变体基因ARO4、分支酸变位酶突变体基因ARO7、分支酸合酶ARO2基因、莽草酸激酶基因AroL、乙酰辅酶A合成酶基因ACS和丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1全部置于酿酒酵母染色体上表达;其中白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL的表达拷贝数≥1个。
3.根据权利要求1所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌,其特征在于:所述的白藜芦醇合成酶基因STS来源于葡萄(Vitis vinifera);
所述的对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL来源于欧芹(Petroselinum crispum);
所述的苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL来源于红球酵母(Rhodotorula toruloides);
所述的肉桂酸-4-羟化酶基因C4H和细胞色素P450酶还原酶基因CPR来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana);
所述的乙酰辅酶A合成酶基因ACS来源于沙门氏菌(Salmonella enterica);
所述的DAHP合成酶突变体ARO4基因、分支酸变位酶突变体基因ARO7、分支酸合酶基因ARO2、丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1来源于酿酒酵母;
所述的莽草酸激酶AroL基因来自大肠杆菌,分别以酿酒酵母、大肠杆菌的基因组为模板通过PCR扩增得到。
4.根据权利要求3所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌,其特征在于:所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL肉桂酸-4-羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR、乙酰辅酶A合成酶基因ACS的核苷酸序列根据酿酒酵母密码子偏爱性进行密码子优化后进行合成得到。
5.根据权利要求1-4任一所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)利用重叠延伸PCR技术或载体构建方法获得各目的基因的表达框,即含启动子-目的基因-终止子序列,使得需要表达的基因带有酿酒酵母的组成型强启动子和终止子,并通过PCR技术或载体构建方法获得表达框的DNA片段;
(2)利用特异性引物扩增获得目标整合位点上下游300-1000 bp的同源臂序列,与需要表达的目的基因表达框通过重叠延伸PCR扩增技术连接,获得在酿酒酵母染色体上特定位点整合的基因表达框片段;
(3)将营养缺陷筛选标签基因His3、Ura3、Leu2、Lys2与目的基因表达框片段、上下游同源臂序列连接,并转化到酿酒酵母感受态细胞中,通过同源重组将基因整合到染色体上过表达,然后将酿酒酵母感受态细胞在缺少组氨酸、尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸的缺陷培养基中进行阳性克隆的筛选;
或,构建带有能够识别特异性位点的CRISPR-Cas9质粒,与相应的上下游同源臂序列、目的基因表达框序列共同转化到酿酒酵母感受态细胞中,进行酿酒酵母的基因敲除、整合,在含遗传霉素抗性的平板上进行阳性克隆的筛选;
(4)将平板上生长的单菌落接种到YPD液体培养基中,培养16-36小时,将基因组进行PCR扩增验证,获得高产白藜芦醇的酵母基因工程菌株。
6.根据权利要求5所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述的目的基因表达框是构建于G418质粒上,并通过PCR扩增得到,具体如下:
(1)以质粒G418为模板,分别在质粒G418上串联PV基因、TS基因、基因C4H、Aro47基因、AroL2基因和ACC1基因,构建得到质粒G418-PV、质粒G418-TS、质粒G418-C4H、质粒G418-Aro47、质粒G418-AroL2和质粒G418-ACC1;
(2)在质粒G418-PV、质粒G418-TS、质粒G418-C4H、质粒G418-Aro47、质粒G418-AroL2和质粒G418-ACC1上分别串联Pc4CL-VvSTS基因、RgTAL-VvSTS基因、AtCPR1-At基因C4H、ARO4- ARO7基因、AROL-ARO2基因和ACC1基因,构建得到目的基因表达框;
步骤(1)中的质粒构建方法如下:
通过PCR扩增获得质粒G418骨架片段和整合的基因片段,将片段混合后,加入In-fusion Cloning Mixture,50℃反应50分钟,所得的转化液转入大肠杆菌感受态细胞,并对单菌落进行验证,最终通过测序验证得到正确的质粒。
7.根据权利要求5所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法,其特征在于:通过营养缺陷筛选标签基因构建重组菌株的方法如下:
以酿酒酵母BY4742为出发菌株,以营养缺陷基因His3或Ura3或Leu2或Lys2作为筛选标签,将目的基因表达框整合到酿酒酵母基因组的YORW∆17位点、或Ura3位点、或Leu2位点、或Lys2位点,构建得到重组菌株;
所述的酿酒酵母BY4742为模式菌株,在缺少组氨酸、亮氨酸、赖氨酸和尿嘧啶的CM培养基中不能生长。
8.根据权利要求5所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述的能够识别特异性位点的CRISPR-Cas9质粒,用于进行CRISPR-Cas9基因操作,分别对酿酒酵母基因组上的CIT2、LPP1、PDC6和DPP1位点进行编码基因序列的敲除,同时对应整合RgTAL-VvSTS、RgTAL-VvSTS、ACC1S659A/S1157A和Pc4CL-VvSTS的基因表达框,得到重组工程菌株;
或者,对酿酒酵母基因组上的PHA2位点的编码序列进行敲除,构建得到重组工程菌株;
或者,在酿酒酵母基因组上的1309a、511b、911b位点插入目的基因的表达框,构建得到重组工程菌。
9.根据权利要求8所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述的能够识别特异性位点的CRISPR-Cas9质粒,构建方法如下:
以带有特定的识别位点的识别序列的引物对原始的pCas质粒进行全质粒PCR扩增或无缝克隆,替换pCas质粒上特定的20 bp识别序列,获得特定位点的pCas质粒,然后将其转化到大肠杆菌感受态细胞中,挑取单菌落到培养基中培养,提取质粒并进行测序验证;
所述的识别位点及其识别序列如下:
CIT2:GTTATGGTCATGCTGTGCTA;
LPP1:GCCATGACAGAGATCATCCT;
PHA2:TCAGCGACAAAAGTAAACAG;
1309a:CCTGTGGTGACTACGTATCC;
511b:CAGTGTATGCCAGTCAGCCA;
PDC6:GATGCGTGCGTAACCATCGG;
911b:GTAATATTGTCTTGTTTCCC;
DPP1:GATCGTTGCCAACCTGTTGA。
10.如权利要求1-4任一所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的应用,其特征在于:用于发酵合成白藜芦醇,具体如下:
从平板中挑取单菌落或从甘油保藏管中将重组工程菌接入到2-20 mL液体培养基中,培养16-36 h,得到种子液;将所述的种子液接入到含有底物葡萄糖的发酵培养基中,进行发酵培养并实现白藜芦醇的合成,培养的温度28-33℃,培养时间48-156 h,pH 4.5-6.5,发酵过程补加葡萄糖。
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