CN114075524B - 阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用 - Google Patents

阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用。本发明通过基因重组技术在宿主细胞中表达一系列异源的酶，获得了可高效生产阿魏酸类化合物的工程菌。本发明建立的表达体系代谢背景低、异源表达能力强、成本低，可通过相对简单的步骤合成终产物，为工业化生产阿魏酸、其中间体或其衍生物提供了新的途径。

Description

阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用
技术领域
本发明属于合成生物学及工业生物学技术领域；更具体地，本发明涉及一种高效合成阿魏酸的重组细胞及其制法和应用。
背景技术
植物次生代谢物由于其潜在的优势，几个世纪以来一直受到人们的关注，但其面临生产难度大、成本高的问题。
阿魏酸是天然存在于植物细胞壁中的抗氧化剂，具有抗炎活性，并且能够充当自由基清除剂，是中药当归、川芎的药效成分，在医药、食品、化妆品等领域都有广泛的应用。现有技术中，从富含阿魏酸的植物原料如当归、阿魏、川芎等中药材和麦麸、米糠中提取阿魏酸是主要的药用或商品阿魏酸的来源，但是存在工业三废处理成本较高的问题。以香兰素和丙二酸为原料通过化学合成方法，得到的产物是顺式阿魏酸和反式阿魏酸的混合物，需要进一步分离得到顺式阿魏酸，分离难度较大。此外，基于生物技术方法，利用一些微生物或酶，利用可再生资源，将阿魏酸前体物质比如丁香酚、木质素、酚类进行转化，得到阿魏酸，高效、清洁，但是工艺尚不成熟，仍需要进一步的研究。
尽管微生物和微生物基因组序列数据的丰富多样性为开发高效的微生物人工途径提供了一些潜在有用基因资源，但是如何有效地加以选择和利用，仍然是本领域中亟待研究的。
申请号为201510234157.5的一种阿魏酸生产工程菌株构建方法及生物转化的方法，公开日为2015年9月23日，公开的阿魏酸的生产主要通过以丁香酚为前体，利用强启动子使酶偶联系统包括香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、和松柏醛脱氢酶基因在大肠杆菌中共表达，同时偶联木糖还原酶，在生产中还原木糖并再生氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，维持阿魏酸生物转化系统的辅酶平衡，经过全细胞催化丁香酚生成阿魏酸。
综上，本领域还需要进行阿魏酸的生物合成研究，改进生物合成工艺，以解决现有技术中关于阿魏酸生产方面的技术问题，提高阿魏酸的生产效率，降低阿魏酸的生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用。
本发明的目的还在于提供一种高产阿魏酸的发酵生产方法。
在本发明的第一方面，提供用于生产阿魏酸的重组细胞，其中表达外源的下组酶：酪氨酸解氨酶(TAL)，4-香豆酸-3-羟基化酶(SAM5)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)。
在一个优选例中，所述重组细胞中，不含有外源的下组酶或蛋白：PEPS，DAHPS，CM/PDH，ECH。
在另一优选例中，所述的重组细胞中还表达外源的以下酶：嘧啶核苷酸转氢酶(pntAB)。
在另一优选例中，所述酪氨酸解氨酶来自于类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，白色链霉菌(Streptomyces albus)，荚膜红杆菌(Rhodobactercapsulatus)，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinofusca)。
在另一优选例中，所述4-香豆酸-3-羟基化酶来自于西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)，新月链霉菌(Streptomyces lunaelactis)，法诺卡菌(Nocardia farcinica)，红球菌(Rhodococcus ruber)。
在另一优选例中，所述咖啡酸-O-甲基转移酶来自于小麦(Triticum aestivum)，大麦(Hordeum vulgare)，高羊茅(Festuca arundinacea)，黑麦草(Lolium perenne)。
在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶来自于大肠杆菌(Escherichia coliMG1655)。
在另一优选例中，所述重组细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌或链霉菌，或所述真核细胞包括真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；更佳地，所述重组细胞为大肠杆菌；更佳地，所述大肠杆菌为JM109(DE3)。
在另一优选例中，所述酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶，咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子，trc启动子；优选地包括T7启动子。
在另一优选例中，所述复制子包括选自：pBR322，p15a，pSC101；优选地包括pBR322。
在另一优选例中，所述重组细胞中，不同时包含以p15a作为复制子以及以T5作为启动子的酶表达盒。
在另一优选例中，所述酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶，咖啡酸-O-甲基转移酶被串联于同一表达盒中，或被分别连接于不同表达盒中；优选地为串联于同一表达盒中。
在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子；优选地包括T7启动子。
在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，操纵子包括选自：T7操纵子，T5操纵子。
在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，复制子包括：SC101。
在本发明的另一方面，提供所述的重组细胞的用途，用于生产阿魏酸；较佳地，用于将L-酪氨酸转化为阿魏酸。
在本发明的另一方面，提供一种生产阿魏酸的方法，所述方法包括：(1)提供重组细胞，其为前面任一所述的重组细胞；和(2)培养(1)的重组细胞，从而生产阿魏酸。
在一个优选例中，所述的重组细胞为原核细胞，其以甘油作为碳源进行表达，生产阿魏酸；较佳地，所述细胞的培养基中，甘油按照体积0.5～8％，较佳地1～6％，更佳地1.5～4％，如1.8％，2％，2.5％，3％，3.5％等。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述培养(1)的重组细胞，为在含有L-酪氨酸的培养体系中培养。
在另一优选例中，所述重组细胞为原核细胞，以选自(但不限于)M9Y培养基、TB培养基、或LB培养基为基础培养基的培养基进行培养。
在另一优选例中，所述重组细胞的培养温度为25～38℃，如26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、37℃。
在另一优选例中，所述重组细胞培养时的转速100～400rpm，较佳地150～350rpm，更佳地200～300rpm，如250rpm。
在另一优选例中，所述重组细胞为原核细胞，优选大肠杆菌，以IPTG诱导表达。
在另一优选例中，所述重组细胞的发酵时间为1～20天，较佳地2～15天，更佳地2.5～10天(如3、4、5、6、7、8、9天)。
在另一优选例中，所述L-酪氨酸在培养体系中的浓度为：0.1～50g/L，较佳地0.2～40g/L，更佳地0.4～20g/L。所述培养体系中的浓度例如0.3g/L，0.5g/L，0.8g/L，1g/L，1.2g/L，1.5g/L，2g/L，3g/L，5g/L，10g/L，15g/L，30g/L等。
在另一优选例中，所述的L-酪氨酸经所述酪氨酸解氨酶催化形成p-香豆酸；所述p-香豆酸经所述4-香豆酸-3-羟基化酶催化形成咖啡酸；所述咖啡酸经所述咖啡酸-O-甲基转移酶催化形成阿魏酸。
在本发明的另一方面，提供一种表达盒或重组构建物(如表达载体)，其中包括一组酶的编码核酸，该组酶包括：酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶；较佳地，该组酶还包括嘧啶核苷酸转氢酶。
在一个优选例中，所述酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶，咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子，trc启动子；优选地包括T7启动子；或复制子包括选自：pBR322，p15a，pSC101；优选地包括pBR322。
在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子，trc启动子；优选地包括T7启动子；复制子包括选自：SC101，p15a,pBR322。
在本发明的另一方面，提供所述的表达盒或重组构建物的用途，用于制备生产阿魏酸的重组细胞。
在本发明的另一方面，提供一组酶或该组酶的编码核酸或表达盒的用途，用于在重组细胞表达、生产阿魏酸；或用于制备生产阿魏酸的重组细胞；该组酶包括：酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶；较佳地，该组酶还包括嘧啶核苷酸转氢酶。
在本发明的另一方面，提供用于生产阿魏酸的试剂盒，其中包括：所述的重组细胞。
在本发明的另一方面，提供用于生产阿魏酸的试剂盒，其中包括：所述的表达盒或重组构建物；较佳地，还包括宿主细胞。
在一个优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌或链霉菌，或所述真核细胞包括真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；更佳地，所述宿主细胞为大肠杆菌；更佳地，所述大肠杆菌为JM109(DE3)。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：L-酪氨酸和/或基础培养基。
在另一优选例中，所述L-酪氨酸包含于所述基础培养基中，较佳地，所述L-酪氨酸在培养基中的浓度为：0.1～50g/L，较佳地0.2～40g/L，更佳地0.4～20g/L。所述培养体系中的浓度例如0.3g/L，0.5g/L，0.8g/L，1g/L，1.2g/L，1.5g/L，2g/L，3g/L，5g/L，10g/L，15g/L，30g/L等。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：表达诱导剂，例如IPTG。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明中阿魏酸的生物合成途径。
TAL：酪氨酸解氨酶(Ammonia-lyase)，来源于Rhodobacter sphaeroides；
SAM5：4-香豆酸3-羟化酶(β-Coumaric acid 3-hydroxylase)，来源于Saccharothrix espanaensis；
COMT：咖啡酸o-甲基转移酶(Caffeic acid O-methytransferase)，来源于Triticum aestivum。
图2、不同复制子、启动子组合的阿魏酸合成途径质粒示意图。其中T7/T5表示T7启动子或T5启动子择一存在，所述pBR322/p15Aori表示pBR322或p15A复制子。
图3、使用不同的碳源用量测试生产阿魏酸(FA)的产量；该测试中，实验菌株使用T7启动子，TB培养基(含1g/L L-酪氨酸)。3D表示第3天，5D表示第5天。
图4、分别以大肠杆菌JM109(DE3)或BL21(DE3)为宿主，质粒pHJ697(pBR322-T7-tal-sam5-comt)，TB-2％甘油-1g/L L-酪氨酸培养基。
图5、以大肠杆菌JM109(DE3)为宿主细胞，分别以不同的复制子或启动子进行表达时阿魏酸的产量；运用TB培养基(含2％甘油、1g/L L-酪氨酸)。
图6、在大肠杆菌JM109(DE3)中进一步表达其它酶(zwf，icd，gnd，pntAB或gapN)后，发酵产生的阿魏酸的产量，以未表达所述其它酶的空载体表达体系为对照。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，通过基因重组技术在宿主细胞(优选地为原核宿主细胞)中重组表达一系列外源的酶，获得可高效生产阿魏酸类化合物的工程菌，本发明还优化了该工程菌的表达工艺。本发明建立的表达体系代谢背景低、异源表达能力强、成本低，可通过相对简单的步骤合成终产物且终产物易分离，为工业化生产阿魏酸、其中间体或其衍生物提供了新的途径。
术语
如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(如本发明中感兴趣的酶)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的“表达构建物”或“表达构建体”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。
如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质(多肽)序列之间的关系，或者来自不同来源的核酸或蛋白质与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸/蛋白质与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，所述的阿魏酸也包括阿魏酸类化合物。所述的“阿魏酸类化合物”也可以是在本发明披露的化合物阿魏酸基础上的变化形式，例如，化合物的母核结构保持不变，但在个别(如1-3个，1-2个)位置上发生基团(如含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团)的取代。
酶组合及其表达系统
本发明中，通过在工程细胞(工程菌)中转化入一组酶来实现阿魏酸类化合物在工程菌中的高效生产。该组酶包括酪氨酸解氨酶(TAL)，4-香豆酸-3-羟基化酶(SAM5)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)。在本发明的优选方式中，该组酶中还包括嘧啶核苷酸转氢酶(pntAB)。本发明人意外地发现，pntAB的运用可以大大促进阿魏酸的表达效率，使得其产量有很大的提高。
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种生产阿魏酸类化合物的基因工程菌，其中表达外源的下组酶：酪氨酸解氨酶(TAL)，4-香豆酸-3-羟基化酶(SAM5)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)，实现了在工程菌中合成阿魏酸。进一步地，在该菌株中进一步表达外源的嘧啶核苷酸转氢酶(pntAB)。本发明的工程菌中，阿魏酸的合成途径如图1所示。
编码本发明所述的酶的基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来获得所述的基因，或者通过人工合成的方法来获得所述的基因。
本发明所述的酶或其编码核酸的序列信息可以是与本发明实施例表2中所提供的相同，也可以是它们的变异体或简并序列。“简并的序列”在本发明中是指编码具有同功能的蛋白质，但与发明实施例表2中所提供的序列信息有差别的核酸序列。本发明中可以运用编码所述酶的天然序列，也可以运用进行密码子优化后的序列。所述酶的编码核酸可以包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及所述酶的变体，与其相应的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的单位点或多位点变体、片段、类似物或衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
应理解的是，利用一些本领域公知的密码子优化方法、蛋白变体筛选方法、酶活性促进方法等进行优化、并建立优化的工程菌，还可以进一步地提高阿魏酸类化合物的产量。这些在本发明的方案基础上的进一步优化技术，也应被涵盖在本发明的技术方案中。
在本发明的优选方式中，TAL来源于Rhodobacter sphaeroides，SAM5来源于Saccharothrix espanaensis，COMT来源于Triticum aestivum。本发明也可包括运用来自其它微生物或植物的此类酶，只要它们与本发明实施例列举的酶高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。
本发明的各酶的编码核酸的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明也涉及包含所述的编码核酸的载体，以及用所述的载体经基因工程产生的宿主细胞。
本发明中，各酶的编码核酸的序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
各酶的编码核酸的序列可以分别插入到重组表达载体中，多个重组表达载体共转宿主细胞；多个基因的表达盒也可以以串联的方式插入到同一重组表达载体中，转入宿主细胞。所述的重组表达载体还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。应理解，在本领域人员了解了本发明的技术内容后，可以方便地构建重组表达载体。获得的重组表达载体也包含在本发明中。
表达调控序列或表达盒中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。
作为本发明的优选方式，提供了一种表达盒或重组构建物(如表达载体)，其中包括一组酶的编码核酸，该组酶包括：酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶。在更优选的方式中，该组酶还包括嘧啶核苷酸转氢酶。
表达载体(表达构建物)的建立可以采用本领域技术人员熟悉的技术。在得知了所需选择的酶以及所需表达的细胞体系之后，本领域技术人员可以进行表达构建物的建立。基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达构建物中，只要在转入到细胞后其编码的多肽能够被有效地表达和发挥活性即可。
包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明中，所述的宿主细胞可包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌或链霉菌，或所述真核细胞包括真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在更为优选的方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌，最优选的是大肠杆菌JM109(DE3)。
在本发明的优选方式中，所述酪氨酸解氨酶、4-香豆酸-3-羟基化酶、咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子等；优选地包括T7启动子；或复制子包括选自：pBR322，p15a等；优选地包括pBR322。本发明人意外地发现，以pBR322配合T7启动子来进行构建体的建立，最终获得的工程菌的表达效率最高，阿魏酸产量最高。
在本发明的优选方式中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子等；优选地包括T7启动子；或复制子包括选自：SC101等。本发明人意外地发现，以SC101复制子配合T7启动子来进行构建体的建立，最终获得的工程菌的表达效率最高，阿魏酸产量最高。应理解，本发明中，所述的启动子或复制子还包括它们的保留功能的变体、活性片段等。本发明还包括与本发明的任一种启动子或复制子序列具有80％或以上(优选85％以上，更优选90％以上，最优选95％以上，如98％、99％)相同性的核酸，所述核酸也具有相应的启动子或复制子的增效功能。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，培养中所用的培养基可以是本领域熟知的培养基，在适于细胞生长的条件下进行培养。在优选的方式中，所述的细胞的培养基中含有反应前体L-酪氨酸。
本发明也提供了用于生物合成阿魏酸类化合物的试剂盒，其中包括：本发明所构建的重组细胞(工程菌)。或者，其中包括：本发明所构建的表达盒或重组构建物，这种情况情况下，较佳地还在试剂盒中包含宿主细胞，从而便于本领域技术人员进行操作。
在更优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书。
本发明通过基因重组技术获得的重组细胞具有代谢背景低、异源表达能力强、成本低，可通过相对简单的步骤合成终产物且终产物易分离等特征，将在很大程度上解决传统生物、化学方法合成存在的问题，为工业化生产阿魏酸类药物提供新途径。
本发明中构建的重组工程菌，其与各个被外源引入的酶具有良好的适配性，无需针对酶结构进行改造即获得良好表达并发挥催化活性，具有开发应用潜力。应理解，在本发明的基础上对酶结构或功能进行进一步改进后获得的技术方案，也应被包含在本发明中。
合成阿魏酸的方法
基于本发明人的新发现，本发明公开一种利用微生物异源合成阿魏酸的方法。所述方法包括：培养本发明前述构建的重组细胞，使之生产阿魏酸。本发明的技术方案中，阿魏酸类化合物的合成途径可参考图1所示。
本发明所述的合成途径中，以L-酪氨酸作为反应前体，所述L-酪氨酸在培养体系中的浓度为：0.1～50g/L，较佳地0.2～40g/L，更佳地0.4～20g/L。根据发酵规模的不同，以及发酵条件的不同，本领域技术人员还可对该前体的用量进行适当的调整，这也被包含在本发明中。
在建立菌株以及进行表达的基础上，本发明人还系统研究了提高产量的一系列因素，包括基因的效率和适宜性、基因剂量和培养基。在此基础上，本发明人进一步优化了阿魏酸类化合物的生产工艺。
在本发明的一种优选方式中，在进行重组表达时，以大肠杆菌作为工程菌，更优选地以JM109(DE3)为工程菌。
在本发明的另一种优选方式中，以甘油作为碳源；更优选地以按照体积1.5～4％、更特别地约2％的甘油浓度进行工程菌的培养。发酵所用的基础培养基可以是商用的培养基，例如但不限于：M9Y培养基、M9培养基、TB培养基、或LB培养基等。
在获得了发酵产物后，从发酵产物中提取阿魏酸可以采用本发明已知的技术。可以采用一些公知技术如高效液相色谱来对产物进行分析鉴定，以确定获得了所需的化合物。
本发明的主要优点在于：
本发明运用原核细胞、特别是大肠杆菌生产阿魏酸类化合物，不仅解决了植物提取阿魏酸类化合物消耗大量植物原材料、受季节地域因素限制以及提取效率低等问题；也避免了化学合成法中副产物多、目标产物活性低、环境污染大等不利因素。尽管本发明运用了原核细胞，但避免了酶异源表达于原核细胞时活性不高的问题，特别适合于阿魏酸类化合物的高效合成，为工业生产此类化合物开辟了新途径。
本发明的结果表明，代谢途径可以从低成本的底物中生产阿魏酸类化合物，这表明模仿自然途径是设计人工途径的一个好策略。
本发明克服了现有技术中成本高，污染环境，产物不单一的缺点，提供了一种低成本、环保、产物单一的阿魏酸生产方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
PCR产物回收纯化试剂盒，质粒抽提试剂盒，限制性内切酶，核酸和蛋白质分子量标准品，T4连接酶及相关的酶反应缓冲液，购自New England Biolab(NEB)公司。
高保真DNA聚合酶HS DNA Polymerase和/>Max DNAPolymerase试剂盒，购自Takara公司。
细菌培养使用的LB培养基配制组分，购自Sigma公司。
引物合成，TB培养基，抗生素和诱导剂异丙基-β-D异硫代半乳糖苷(IPTG)，购自生工生物上海股份有限公司。
无缝克隆试剂盒为ClonExpress II One Step Cloning Kit，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
阿魏酸合成途径的三个基因tal、sam5以及comt基因，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
后续实施例所用的引物如表1。
表1
引物 序列 SEQ ID NO:
T7 operatorF cgggaattcgcgcaaaaaacccctcaag 1
T7 operatorR ctttactaagctgacgatagtcatgccccg 2
pCL1920VF gactatcgtcagcttagtaaagccctcgctag 3
pCL1920VR gttttttgcgcgaattcccg 4
pro-VF agatctcgatcctctacgc 5
pro-VR tctagaaataattttgtttaactttaag 6
pro-T5-in-F caaaattatttctagaatagttaatttctcctc 7
pro-T5-in-R gtagaggatcgagatctaaatcataaaaaatttatttg 8
ori-p15a-inF caaaagcaccgccggacatcagcgctagcggagtgtatactg 9
ori-p15a-inR catgactaacatgagaattacaacttatatcgtatg 10
ori-VF catacgatataagttgtaattctcatgttagtcatg 11
ori-VR cagtatacactccgctagcgctgatgtccggcggtgcttttg 12
ECicd F ccaagcttactagtttacatgttttcgatg 13
ECicd R catgccatggaaagtaaagtagttg 14
ECgnd F ccaagcttactagtttaatccagccattcg 15
ECgnd R ggaattccatatgtccaagcaacagatc 16
ECzwfF cccaagcttactagtttactcaaactcattccag 17
ECzwfR catgccatggcggtaacgcaaacag 18
pntABHindF cccaagcttactagtttacagagctttcaggattg 19
pntABNcoR catgccatggaagggaatatcatg 20
gapNF ctttaagaaggagatatacatgtttgaaaatatatcatcaaatggag 21
gapNR gtgcggccgcaagcttgtcgattataggtttaaaactattgatttatg 22
GapN-V F cataaatcaatagttttaaacctataatcgacaagcttgcggccgcac 23
GapN-VR ctccatttgatgatatattttcaaacatgtatatctccttcttaaag 24
实施例1、工程菌的构建及优化
本实施例中，构建一种阿魏酸生产工程菌，所使用的宿主是大肠杆菌JM109(DE3)或BL21(DE3)，转化有质粒携带有以酪氨酸为底物合成阿魏酸的生物合成途径的基因。
用于构建阿魏酸合成途径基因表达盒的酶/基因见表2。
表2
质粒构建方法包括以下步骤：
1.1阿魏酸合成途径基因串连成为一个操纵子
(1).用Nco I和Hind III双酶切合成的酪氨酸解氨酶基因(TAL，1575bp)，克隆至用Nco I和Hind III酶切过的pET21d载体上，得重组载体pET21d-TAL。类似地用Nde I和Hind III分别双酶切合成的4-香豆酸3-羟化酶基因(SAM5，1542bp)C3H酶基因(SAM5，768bp)、咖啡酸o-甲基转移酶基因(COMT，1074bp)，克隆至用Nde I和Hind III酶切过的pET21a载体上，得重组载体pET21a-SAM5和pET21a-COMT；
(2).将重组载体pET21d-TAL用Spe I和Hind III双酶切，回收作为载体，pET21a-SAM5用Xba I和Hind III酶切，回收大小为1587bp片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET21d-TAL-SAM5；
(3).将重组载体pET21d-TAL-SAM5用Spe I和Hind III双酶切，回收作为载体，pET21a-COMT用Xba I和Hind III酶切，回收大小为1119bp片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET21d-TAL-SAM5-COMT；
(4).将载体pET21d的复制子pBR322通过无缝拼接方法替换为p15a，以及T7替换为T5启动子。
以质粒pBR322-T7-tal-sam5-comt为模板，用引物pro-VF/pro-VR扩增载体片段，以质粒pQE30为模板，用引物pro-T5-in-F/pro-T5-in-R扩增插入片段，将T7启动子替换为T5启动子，构建pBR322-T5-tal-sam5-comt。
同样，将复制子替换为p15a，构建p15a-T7-tal-sam5-comt和p15a-T5-tal-sam5-comt。以质粒pBR322-T7-tal-sam5-comt为模板，用引物ori-VF/ori-VR扩增载体片段，以质粒Pacyc184为模板，用引物ori-p15a-in-F/ori-p15a-in-R扩增插入片段，将pBR322复制子替换为p15a复制子，构建质粒p15a-T7-tal-sam5-comt。以质粒pBR322-T5-tal-sam5-comt为模板，用引物ori-VF/ori-VR扩增载体片段，以质粒Pacyc184为模板，用引物ori-p15a-in-F/ori-p15a-in-R扩增插入片段，将pBR322复制子替换为p15a复制子，构建质粒p15a-T5-tal-sam5-comt。
得到一组重组载体：pBR322-T7-tal-sam5-comt；pBR322-T5-tal-sam5-comt；p15a-T7-tal-sam5-comt；p15a-T5-tal-sam5-comt。不同复制子、启动子组合的质粒示意图如图2所示。
将重组载体转入JM109(DE3)，得工程菌，进行发酵。发酵条件和方法：培养基为TB培养基，加入甘油2％，1g/L L-酪氨酸，一级种子为过夜培养12小时，5％接种量转接，0.1mMIPTG初始诱导，28℃250rpm条件，发酵5天取样测定。
发酵后，分析发酵产物，初步确定，质粒pBR322-T5-tal-sam5-comt转化子为较高产的菌株。
实施例2、质粒的进一步优化构建
(1).载体质粒pCL1920-T7 operator(T7操纵子)的构建方法
以pCL1920(Biovector)(壮观霉素抗性，SC101复制子)为模板，引物pCL1920VF/pCL1920VR扩增得到载体片段，以pET28a(卡那霉素抗性，pBR322复制子)为模板，引物T7operatorF/T7 operatorR扩增得到插入片段，infusion方法构建质粒pCL1920-T7operator。
(2).质粒优化构建方法
以E.coli MG1655(简称Ec)基因组为模板扩增Zwf(NcoI-HindIII)，gnd(NdeI-HindIII)，icd(NcoI-HindIII)，用对应的限制性内切酶酶切，T4连接酶连接构建在pET28a载体上。
随后用XbaI-HindIII双酶切，得插入片段，XbaI-HindIII双酶切pCL1920-T7operator得到载体片段，T4连接酶连接构建质粒pCL1920-T7-Ecicd；pCL1920-T7-Ecgnd；pCL1920-T7-Eczwf。
pntAB(NcoI-HindIII)，以E.coli MG1655(简称Ec)为模板扩增pntAB(NcoI-HindIII)，用对应的限制性内切酶酶切，T4连接酶连接构建在pCL1920-T7 operator载体上，得到质粒pCL1920-T7-EcpntAB。
gapN(GenBank登录号AE001437.1)来自Clostridium.acetobutylicum ATCC824(ATCC824丙酮丁醇梭菌)，无缝拼接的方法构建在pCL1920-T7 operator上得到质粒pCL1920-T7 operator-CagapN。
实施例3、碳源用量测试实验
本实施例中，以甘油作为碳源，研究不同碳源用量对于阿魏酸产量的用量，
设置2％(v/v)、4％(v/v)、6％(v/v)甘油三个处理组。使用菌株转入了pBR322-T7-tal-sam5-comt的JM109(DE3)菌株进行试验。
挑单克隆，接种到2mL的含抗生素的LB(10mL小试管)中，过夜培养(12h)，然后5％转接入加有抗生素，0.1mM IPTG以及1g/L L-酪氨酸的TB培养基中，28℃，250rpm发酵3天和5天取样(取1mL)，1V乙酸乙酯萃取2次，甲醇重悬，HPLC在310nm检测FA。
结果如图3，出乎意料的是，碳源用量并非越高越为理想，当甘油用量2％时产量显著最高。
实施例4、宿主测试实验
本实施例中，比较使用大肠杆菌宿主JM109(DE3)和BL21(DE3)对产量的影响。
宿主菌JM109(DE3)和BL21(DE3)分别转化质粒pBR322-T7-tal-sam5-comt，培养基为甘油2％的TB，1g/L L-酪氨酸，发酵条件同前，发酵5天取样测定。
结果如图4，使用宿主JM109(DE3)发酵阿魏酸产量78mg/L，高于使用宿主BL21(DE3)发酵产阿魏酸的量40mg/L。
实施例5、复制子、启动子测试
本实施例中，以大肠杆菌JM109(DE3)为宿主细胞，使用复制子pBR322、p15A，启动子T7、T5，两两组合，考察各个元件运用于本发明的表达系统时的效果，从而对菌株产物合成的能力进行优化。
本实施例中，运用的宿主为JM109(DE3)，质粒为pBR322-T7-tal-sam5-comt；pBR322-T5-tal-sam5-comt；p15a-T7-tal-sam5-comt；p15a-T5-tal-sam5-comt。
培养基为TB培养基，加入甘油2％，1g/L L-酪氨酸，发酵条件同前，发酵5天取样测定。
结果如图5，复制子、启动子组合为pBR322-T5的菌株JM109(DE3)/pBR322-T5-tal-sam5-comt产量极为显著地高于其它几组，104mg/L。
实施例6、优化构建的菌株的技术效果测定
本实施例中，利用低拷贝载体共表达一系列基因，得到如下菌株：
T5FA+pSC101-T7：
JM109(DE3)/pBR322-T5-tal-sam5-comt+pCL1920-T7 operator；
T5FA+pSC101-T7-icd：
JM109(DE3)/pBR322-T5-tal-sam5-comt+pCL1920-T7-Ecicd
T5FA+pSC101-T7-gnd：
JM109(DE3)/pBR322-T5-tal-sam5-comt+pCL1920-T7-Ecgnd
T5FA+pSC101-T7-zwf：
JM109(DE3)/pBR322-T5-tal-sam5-comt+pCL1920-T7-Eczwf
T5FA+pSC101-T7-pntAB：
JM109(DE3)/pBR322-T5-tal-sam5-comt+pCL1920-T7-EcpntAB
T5FA+pSC101-T7-gapN：
JM109(DE3)/pBR322-T5-tal-sam5-comt+pCL1920-T7-CagapN
使用较为简单的培养基M9Y(配制(g/L)：NH4Cl 4，Na2HPO4 6，KH2PO4 3，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 2mM，CaCl2 0.1mM，微量元素10mL，酵母提取物0.5，甘油20，L-酪氨酸1。其中，微量元素溶液(g/L)：H3BO3 0.03，Thiamine 1，ZnCl2 0.94，CoCl2 0.5，CuCl2 0.38，MnCl21.6，FeCl2 3.6。
结果如图6，可见共表达zwf，icd，gnd或gapN均没有显著意义上提高基因工程菌株的阿魏酸产量。但是，共表达pntAB则呈现了非常显著的提高，其产量出乎意料地达到约192mg/L。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用
<130> 202951
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
cgggaattcg cgcaaaaaac ccctcaag 28
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ctttactaag ctgacgatag tcatgccccg 30
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 3
gactatcgtc agcttagtaa agccctcgct ag 32
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
gttttttgcg cgaattcccg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
agatctcgat cctctacgc 19
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 6
tctagaaata attttgttta actttaag 28
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 7
caaaattatt tctagaatag ttaatttctc ctc 33
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 8
gtagaggatc gagatctaaa tcataaaaaa tttatttg 38
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 9
caaaagcacc gccggacatc agcgctagcg gagtgtatac tg 42
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 10
catgactaac atgagaatta caacttatat cgtatg 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 11
catacgatat aagttgtaat tctcatgtta gtcatg 36
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 12
cagtatacac tccgctagcg ctgatgtccg gcggtgcttt tg 42
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 13
ccaagcttac tagtttacat gttttcgatg 30
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 14
catgccatgg aaagtaaagt agttg 25
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 15
ccaagcttac tagtttaatc cagccattcg 30
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 16
ggaattccat atgtccaagc aacagatc 28
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 17
cccaagctta ctagtttact caaactcatt ccag 34
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 18
catgccatgg cggtaacgca aacag 25
<210> 19
<211> 35
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Claims (22)

1. 用于生产阿魏酸的重组细胞，其为大肠杆菌(Escherichia coli)，其中含有外源的酪氨酸解氨酶、4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒且表达酪氨酸解氨酶、4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶；所述酪氨酸解氨酶为GenBank_CP033447.1的酶；所述4-香豆酸-3-羟基化酶为GenBank_HE804045.1的酶；所述咖啡酸-O-甲基转移酶为GenBank_EF413031.1的酶；
所述大肠杆菌中还含有外源的嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒且表达嘧啶核苷酸转氢酶；所述嘧啶核苷酸转氢酶来自于大肠杆菌MG1655菌株。
2. 如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶来自于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
3. 如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述4-香豆酸-3-羟基化酶来自于西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)。
4. 如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述咖啡酸-O-甲基转移酶来自于小麦(Triticum aestivum)。
5.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，用于生产阿魏酸的大肠杆菌为JM109(DE3)。
6.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶、4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中，启动子选自：T7启动子，T5启动子或trc启动子。
7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述启动子为T7启动子。
8.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶、4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中，复制子选自：pBR322，p15a或pSC101。
9.如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述复制子为pBR322。
10.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，启动子选自：T7启动子或T5启动子。
11.如权利要求10所述的重组细胞，其特征在于，所述启动子为T7启动子。
12.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，复制子为pSC101。
13.权利要求1～12任一所述的重组细胞的用途，用于生产阿魏酸；其将L-酪氨酸转化为阿魏酸。
14. 一种生产阿魏酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 提供重组细胞，其为权利要求1～12任一所述的重组细胞；和
(2) 培养(1)的重组细胞，从而生产阿魏酸。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，(2)中，以甘油作为碳源进行表达，生产阿魏酸。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞的培养基中，甘油按照体积0.5～8%。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养(1)的重组细胞，为在含有L-酪氨酸的培养体系中培养。
18.一种重组构建物的组合在制备生产阿魏酸的重组细胞中的用途，所述重组构建物的组合包括重组构建物(1)和重组构建物(2)，所述重组构建物(1)包括酪氨酸解氨酶、4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒，所述重组构建物(2)包括嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒；所述生产阿魏酸的重组细胞为大肠杆菌；所述酪氨酸解氨酶为GenBank_CP033447.1的酶；所述4-香豆酸-3-羟基化酶为GenBank_HE804045.1的酶；所述咖啡酸-O-甲基转移酶为GenBank_EF413031.1的酶；所述嘧啶核苷酸转氢酶来自于大肠杆菌MG1655菌株。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶、4-香豆酸-3-羟基化酶和啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中：启动子选自T7启动子，T5启动子或trc启动子；复制子选自pBR322，p15a或pSC101。
20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，启动子选自T7启动子，T5启动子或trc启动子；复制子选自pSC101，p15a或pBR322。
21.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述重组构建物被包含在试剂盒中，所述试剂盒用于生产阿魏酸。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中还包括：L-酪氨酸和/或基础培养基。
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