CN111705031A - 生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法，属于生物学应用技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种生产阿魏酸的基因工程菌，该基因工程菌能够以酪氨酸和甲硫氨酸为原料生产阿魏酸。本发明根据阿魏酸在植物中的生物合成途径，通过基因工程方法获得重组的基因工程菌，该基因工程菌可以异源表达酪氨酸解氨酶、香豆酸‑3‑羟化酶和咖啡酸‑3‑O‑甲基转移酶，从而促进酪氨酸生物转化，一锅法发酵生产阿魏酸，转化率高，且得到的阿魏酸纯度较高，其工艺简单清洁，成本较低，能够用于大规模工业化生产。

Description

生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法
技术领域
本发明涉及生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法，属于生物学应用技术领域。
背景技术
阿魏酸(Ferulic Acid)，化学名为3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，属于桂皮酸的衍生物，在植物体内普遍存在，尤其在阿魏、川芎、当归等中药材中含量较高，也是这些中药材的有效成分之一。在食品原料如咖啡、谷壳、香兰豆、麦麸、米糠中阿魏酸含量也较高。
阿魏酸分为顺式和反式两种构型，顺式为黄色油状物，反式为正方形结晶或纤维结晶。其中反式阿魏酸能清除自由基，促进清除自由基的酶的产生，增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，来调节人体生理机能。广泛应用于医药、农药、保健品、化妆品原料及食品添加剂中，具有较高的经济价值。
目前较成熟的阿魏酸生产工艺主要有植物提取法和化学合成法。植物提取法主要包括碱提取法和酶提取法。碱提取法以米糠油来源的谷维素为原料，在高浓度的强碱条件下将谷维素进行水解，再通过酸化沉淀的方法进行收集。此法工艺相对简单，但使用大量的有机溶剂和强酸强碱，对环境污染较大。酶提取法通过真菌、细菌或酵母菌生产阿魏酸酯酶，用液体或固体发酵的方式，将麸皮等原料中的阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸等化合物进行酶解，产生游离的阿魏酸进行收集。但微生物体内的阿魏酸酯酶种类繁多，其酶活、底物特异性等都还有待提高。
化学合成法以香兰素为基本原料，主要通过Wittig-Horner反应或者Kneoevenagel反应生产阿魏酸。前者由于强碱的存在，生成酚钠离子会抑制羰基和碳负离子之间的反应，还易发生副反应生成杂质。后者反应时间长达三周，而且获得是反式和顺式阿魏酸混合物，难以进行拆分，从而影响阿魏酸的工业应用。
目前，生物合成法由于其高效、清洁，成为阿魏酸合成工艺的研究热点。生物合成法是指利用一些微生物，将阿魏酸前体物质进行转化，得到阿魏酸。比如，将丁香油中提取得到的丁子香酚肉桂酸酯转化为阿魏酸。
申请号为201510075678.0的中国发明专利公开了一种酶法合成阿魏酸的方法，将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基转移至咖啡酸上，最终形成产物阿魏酸，包括以下步骤：a)通过大肠杆菌的发酵高效表达川芎COMT，通过离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声裂解菌体，获得含有川芎COMT酶的混合酶液；b)由a)所获川芎COMT将SAM提供的甲基转移至咖啡酸，最后转化成阿魏酸。采用该方法，需要先超声破碎菌体，再分离得到含有川芎COMT的混合酶液，其工艺步骤复杂，且以咖啡酸为原料，价格较贵，生产成本高。
申请号为201911078868.2的中国发明专利公开了了一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进，包括以下步骤：步骤1：将含有质粒LCCOMT-pET28a的大肠杆菌BL21菌株进行活化；步骤2：对步骤1得到的菌液进行扩大培养后，同时加入IPTG、咖啡酸或咖啡酸甲酯进行共发酵；步骤3：将共发酵后的发酵液离心，用乙酸乙酯萃取后即可得到阿魏酸或阿魏酸甲酯。该方法采用基因工程酶体内转化方法，省去了酶的提取过程，但是，依然以价格较为昂贵的咖啡酸为原料，生产成本高。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种生产阿魏酸的基因工程菌，该基因工程菌能够以酪氨酸和甲硫氨酸为原料生产阿魏酸。
本发明生产阿魏酸的基因工程菌，可以同时表达酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶。
具体的，该基因工程菌采用如下方法构建得到：将酪氨酸解氨酶基因、S-腺苷甲硫氨酸合成酶5基因和咖啡酸-3-O-甲基转移酶基因连接至载体，并转化至宿主细胞，筛选阳性克隆，得到基因工程菌。
作为一种实施方式，所述载体为pBR322或pET21c。
优选的，所述感受态细胞为大肠杆菌。作为具体实施方式，所述感受态细胞为JM109、BL21(DE3)或Rosetta。
本发明解决的第二个技术问题是提供一种阿魏酸的生物合成方法。
本发明阿魏酸的生物合成方法，包括如下步骤：将上述的生产阿魏酸的基因工程菌接种培养基中，振荡培养，得到含有阿魏酸的发酵液，分离纯化，得到阿魏酸；其中，所述培养基中含有酪氨酸、甲硫氨酸和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
作为其中一种实施方式，所述培养基中含有0.5～10g/L酪氨酸、0.5～10g/L甲硫氨酸和0.05～0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。作为具体的实施方式，所述培养基中含有1g/L酪氨酸、1g/L甲硫氨酸和0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
作为其中一种实施方式，所述振荡培养的温度为22～37℃，时间为3～10天。
菌体发酵后，可以得到含有阿魏酸的发酵液，可以采用本领域的常规方法从该发酵液中分离纯化得到阿魏酸，优选的，采用有机溶剂萃取法或树脂吸附分离法进行分离纯化。
作为其中一种实施方式，采用有机溶剂萃取法进行分离纯化。所述有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液进行浓缩后，有机溶剂萃取，萃取液用氢氧化钠溶液萃取，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。作为优选方案，有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液旋蒸浓缩后，用等体积的有机溶剂萃取3次，合并萃取液，浓缩后再用等体积的氢氧化钠溶液萃取3次，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。
其中，作为其中一种实施方式，其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或石油醚。作为优选实施方式，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
作为另一种实施方式，采用树脂分离法进行分离纯化。所述树脂吸附分离法的具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液投入大孔树脂或离子交换树脂，搅拌吸附过夜，用纱布过滤收集树脂，纯化水冲洗干净后装填层析柱，再用纯化水冲洗至无色，用30％～70％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，旋蒸除净乙醇，将pH调至酸性，结晶获得阿魏酸结晶。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明根据阿魏酸在植物中的生物合成途径，通过基因工程方法获得重组的基因工程菌，该基因工程菌可以异源表达酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶，从而促进酪氨酸生物转化，一锅法发酵生产阿魏酸，转化率高。
本发明生产阿魏酸的方法，能够成功将酪氨酸转化为阿魏酸，转化率高，得到的阿魏酸纯度较高，其工艺简单清洁，条件温和，成本较低，能够用于大规模工业化生产。
本发明生产阿魏酸的方法，无需对基因工程菌进行破碎，也无需对酶进行提取，其工艺流程短，操作简单环保。
具体实施方式
本发明生产阿魏酸的基因工程菌，可以同时表达酪氨酸解氨酶(TAL)、香豆酸-3-羟化酶(C3H)和咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)。
本发明生产阿魏酸的基因工程菌，将阿魏酸合成途径中参与的酶在基因工程菌中进行异源表达，以酪氨酸和甲硫氨酸为原料生产阿魏酸。
阿魏酸以酪氨酸为原料的合成途径为：
Figure BDA0002575151980000031
TAL：Tyrosine ammonia-lyase，酪氨酸解氨酶。
C3H：Coumarate-3-hydroxylase，香豆酸-3-羟化酶。
COMT：Caffeate O-methyltransferase，咖啡酸-3-O-甲基转移酶。
具体的，该基因工程菌采用如下方法构建得到：根据NCBI数据库中酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶、咖啡酸-3-O-甲基转移酶的蛋白序列，进行核酸序列优化，人工合成3个基因，连接至载体，并转化至宿主细胞，筛选阳性克隆，得到基因工程菌。
其中，TAL基因来源于球形红杆菌，蛋白ID为WP_011842214.1。TAL基因的核苷酸序列如序列1所示，TAL的氨基酸序列如序列2所示。
C3H由西班牙酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶5(Sam5)基因表达，Sam5基因在大肠杆菌中表达C3H，蛋白ID为WP_015103234.1。Sam5基因的核苷酸序列如序列3所示，C3H的氨基酸序列如序列4所示。
COMT基因来源于小麦，蛋白ID为ABP63535.1。COMT基因的核苷酸序列如序列5所示，COMT的氨基酸序列如序列6所示。
理论上说，只要基因工程菌中含有TAL基因、Sam5基因和COMT基因，就会同时表达这三种酶，为了便于基因的重组，同时提高该基因工程菌中TAL、C3H和COMT的表达量，从而提高阿魏酸的转化率，在本发明的一些实施例中，按照TAL-Sam5-COMT的顺序进行组装，然后连接至载体。
本发明所述的载体是基因工程载体，是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，该载体主要有质粒、病毒、科斯质粒三种类型。理想的载体能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力，且容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好，容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制，容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作，有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。
作为一种实施方式，所述载体为质粒。质粒(plasmid)是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。常用的质粒均适用于本发明。优选的，所述载体为pBR322或pET21c。
宿主细胞即受体细胞，为在转化和转导(感染)中接受外源基因的细胞。宿主细胞具有具有接受外源DNA的能力，一般为限制酶缺陷型细胞或DNA重组缺陷型细胞，不适于在人体内或在非培养条件下生存，且DNA不易转移。
理论上，可作为宿主细胞的原则为：①便于重组DNA分子导入；②便于重组DNA分子稳定存在于细胞中；③便于重组子的筛选；④遗传稳定性高，易于扩大培养与发酵；⑤安全性高，无致病性；⑥最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低；⑦密码子无明显偏爱性；⑧具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达；⑨理论与实践上具有较高的应用价值。
优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌。作为具体实施方式，所述宿主细胞为E.coliJM109、E.coli BL21(DE3)或E.coli Rosetta。
本发明解决的第二个技术问题是提供一种阿魏酸的生物合成方法。
本发明阿魏酸的生物合成方法，为一锅法发酵生产阿魏酸，具体的，将上述的生产阿魏酸的基因工程菌接种培养基中，振荡培养，得到含有阿魏酸的发酵液，分离纯化，得到阿魏酸；其中，所述培养基中含有酪氨酸、甲硫氨酸和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
本发明的培养基有两个作用，一是提供底物进行生物转化，得到阿魏酸，因此，培养基中需酪氨酸、甲硫氨酸和IPTG。其中，酪氨酸和甲硫氨酸为阿魏酸合成的原料。IPTG即异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在本发明中作为诱导剂，促进蛋白表达。
作为其中一种实施方式，所述培养基中含有0.5～10g/L酪氨酸、0.5～10g/L甲硫氨酸和0.05～0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
在本发明一些实施例中，培养基中酪氨酸的含量可以为0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L或10g/L等。甲硫氨酸的含量可以为0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L或10g/L等。IPTG的含量可以为0.05mM、0.08mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM或0.5mM等。
作为具体的实施方式，所述培养基中含有1g/L酪氨酸、1g/L甲硫氨酸和0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
培养基的另一个作用是供给该基因工程菌生长繁殖的营养物质。因此，除了上述的酪氨酸、甲硫氨酸和IPTG，培养基还必须含有供菌体生长繁殖的营养物质。这些营养物质可以为已知的，根据菌体的不同而不同。比如，当菌体为大肠杆菌菌株时，培养基可以为改良M9培养基或者TB培养基。
在一个具体实施方式中，所述培养基中含有0.1～30g/L酵母提取物、0.1～20g/L蛋白胨、0～10g/L磷酸二氢钠，0～20g/L磷酸氢二钠、0～5g/L氯化铵，0～10g/L硫酸镁、0～1g/L氯化钙、10～30g/L甘油或葡萄糖，0.5～10g/L酪氨酸、0.5～10g/L甲硫氨酸，0.05～0.5mmol/L IPTG。
在一个具体实施例中，所述培养基中含有24g/L酵母提取物、12g/L蛋白胨、2.3g/L磷酸二氢钠、17.5g/L磷酸氢二钠、20g/L甘油、1g/L酪氨酸、1g/L甲硫氨酸，0.1mM IPTG。
常用的适于菌体生长繁殖的温度均适用于本发明，优选的，所述振荡培养的温度为22～37℃，时间为3～10天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为22℃，时间为10天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为25℃，时间为9天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为28℃，时间为8天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为30℃，时间为7天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为31℃，时间为6天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为33℃，时间为5天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为35℃，时间为4天。在一个具体实施例中，振荡培养的温度为37℃，时间为3天。
菌体发酵后，可以得到含有阿魏酸的发酵液，可以采用本领域的常规方法从该发酵液中分离纯化得到阿魏酸，优选的，采用有机溶剂萃取法或树脂吸附分离法进行分离纯化。
作为其中一种实施方式，采用有机溶剂萃取法进行分离纯化。所述有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液进行浓缩后，有机溶剂萃取，萃取液用氢氧化钠溶液萃取，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。作为优选方案，有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液旋蒸浓缩后，用等体积的有机溶剂萃取3次，合并萃取液，浓缩后再用等体积的氢氧化钠溶液萃取3次，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。
其中，作为其中一种实施方式，其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或石油醚。作为优选实施方式，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
作为另一种实施方式，采用树脂分离法进行分离纯化。所述树脂吸附分离法的具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液投入大孔树脂或离子交换树脂，搅拌吸附过夜，用纱布过滤收集树脂，纯化水冲洗干净后装填层析柱，再用纯化水冲洗至无色，用30％～70％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，旋蒸除净乙醇，将pH调至酸性，结晶获得阿魏酸结晶。
其中，所述树脂可以为各种型号，比如D-101树脂、D-201树脂、AB-8树脂、717树脂等。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1基因工程菌的构建
参考阿魏酸在植物中的生物合成途径，根据NCBI中报道的蛋白序列，对基因序列进行密码子优化，使之适应大肠杆菌表达系统。人工合成酪氨酸解氨酶(TAL)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶5(Sam5)、咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)基因片段，依次连接至pBR322或pET21d载体，并转化至JM109、BL21(DE3)或Rosetta感受态细胞，筛选阳性克隆。将初筛出来的重组菌株进行酶切验证，并测序确认序列正确，获得预期的生产菌株。具体的，采用如下方法：
根据TAL、Sam5、COMT蛋白序列，对密码子进行优化，人工合成3个基因，并按照TAL-Sam5-COMT的顺序组装，中间用两组T7启动子和rbs序列连接，rbs序列为：5’-ACTAGACGATCCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCCCCTCTA GAAATAATTTTGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACAT-3’，详见序列7。TAL前端添加NdeI酶切位点(CAT-ATG)，COMT后端添加SpeI酶切位点(ACTAGT)，合成序列全长约4400bp。
将pET21c质粒用NdeⅠ和SpeⅠ双酶切，回收线性质粒。将合成的基因片段和线性质粒以连接酶进行连接，得到共表达质粒pET21c-TAL-Sam5-COMT，分别转化JM109、BL21(DE3)和Rosetta感受态细胞，通过抗性筛选获得重组大肠杆菌表达菌株FA-J、FA-B和FA-R。
实施例2摇瓶转化生产阿魏酸
将-80℃保存的由实施例1方法制备得到的菌种解冻后，在LB琼脂平板上划线，37℃培养过夜。挑取单克隆，接种于20mL含有抗生素的LB肉汤培养基，250mL三角瓶37℃200rpm培养12h获得种子液。再取5mL接种于100mL M9培养基(氯化铵1g/L，磷酸氢二钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，酵母提取物0.5g/L，硫酸镁2mM，氯化钙0.1mM，甘油20g/L，L-酪氨酸1g/L，L-蛋氨酸1g/L，IPTG 0.1mM，抗生素100mg/L)，25℃200rpm培养3天，得到含有阿魏酸的发酵液。
按如下方法测定转化率：
将5-10mL发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液，浓缩干燥，再用5mL甲醇溶解，0.45μm过滤后进行HPLC检测，其结果见表1。
阿魏酸转化率＝阿魏酸浓度/(阿魏酸浓度+咖啡酸浓度+对香豆酸浓度+酪氨酸浓度)×100％
表1
Figure BDA0002575151980000071
实施例3发酵罐生产阿魏酸
由实施例1方法制备得到的FA-J菌种解冻后，在琼脂平板上划线，37℃培养过夜。挑取单克隆，接种于150mL LB肉汤培养基，37℃培养10h。再接种于含有3L TB培养基(24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，2.31g/L磷酸二氢钠，17.4g/L磷酸氢二钠，20g/L葡萄糖，L-酪氨酸3g/L，L-蛋氨酸3g/L，IPTG 0.1mM，抗生素100mg/L，补料为400g/L葡萄糖)的5L发酵罐中，28℃培养，pH控制7.0，通气量3L/min，控制溶氧不低于30％，罐压不超过0.07MPa，通过转速和补料速度控制溶氧，培养60h后放罐，获得含有阿魏酸的发酵液。转化率结果见表2。
表2
Figure BDA0002575151980000081
实施例4阿魏酸纯化
取1L实施例3所得的发酵液离心，上清液旋蒸浓缩5倍，用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩至干，再用100mL 1％氢氧化钠溶解，用浓硫酸将pH调至3.5以下，4℃静置过夜，析出阿魏酸沉淀。抽滤获得固体，称重，按照1:5的比例加入30％乙醇加热溶解，再静置过夜结晶，获得纯度较高的阿魏酸。80℃烘干水分，冷却后称取少量固体，用甲醇溶解定容，通过HPLC测定阿魏酸浓度。根据标准品的重量/浓度比例关系，计算出阿魏酸样品的纯度：
阿魏酸纯度＝(样品峰面积×样品体积×标品重量×标品纯度)/(标品峰面积×标品体积×样品重量)×100％
最终获得的阿魏酸样品浓度为81.47％。
实施例5阿魏酸纯化
取1L实施例3所得的发酵液离心，上清液加入阿魏酸重量50倍的AB-8树脂，搅拌吸附过夜，用纱布过滤收集树脂，纯化水冲洗干净，填装层析柱，再用纯化水冲洗至无色。用50％的乙醇溶液洗脱，洗脱速度1.5BV/h，洗脱体积5BV。收集洗脱液，旋蒸至无乙醇气味。用盐酸或硫酸将pH调至3.0，搅拌过夜，析出魏酸纯度。抽滤获得固体，烘干水分，测定阿魏酸纯度。样品纯度为77.5％。
实施例6阿魏酸纯化
取1L实施例3所得的发酵液离心，上清液pH调至8.0，上717树脂层析柱。上样速度3BV/h，HPLC检测流出液中阿魏酸浓度，直至吸附饱和，上样液穿透。用纯化水冲洗至无色，再用1％盐酸或1％氢氧化钠溶液洗脱。洗脱体积3BV/h，体积10BV。收集洗脱液，浓缩10倍，将pH调至4.0，静置过夜，析出阿魏酸沉淀，烘干水分，测定阿魏酸纯度。样品纯度为79.7％。
Figure IDA0002575154030000011
Figure IDA0002575154030000021
Figure IDA0002575154030000031
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Figure IDA0002575154030000081
Figure IDA0002575154030000091
Figure IDA0002575154030000101

Claims (10)

1.生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌同时表达酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶。
2.根据权利要求1所述的生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于，采用如下方法构建得到：将酪氨酸解氨酶基因、S-腺苷甲硫氨酸合成酶5基因和咖啡酸-3-O-甲基转移酶基因连接至载体，并转化至宿主细胞，筛选阳性克隆，得到基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于：所述载体为pBR322或pET21d。
4.根据权利要求2所述的生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌；优选所述宿主细胞为E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)或E.coli Rosetta。
5.阿魏酸的生物合成方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～4任一项所述的生产阿魏酸的基因工程菌接种到培养基中，振荡培养，得到含有阿魏酸的发酵液，分离纯化，得到阿魏酸；其中，所述培养基中含有酪氨酸、甲硫氨酸和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
6.根据权利要求5所述的阿魏酸的生物合成方法，其特征在于：所述培养基中含有0.5～10g/L酪氨酸、0.5～10g/L甲硫氨酸和0.05～0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；优选所述培养基中含有1g/L酪氨酸、1g/L甲硫氨酸和0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
7.根据权利要求5所述的阿魏酸的生物合成方法，其特征在于：所述培养的温度为22～37℃，时间为3～10天。
8.根据权利要求5所述的阿魏酸的生物合成方法，其特征在于：分离纯化的方法为有机溶剂萃取法或树脂吸附分离法。
9.根据权利要求8所述的阿魏酸的生物合成方法，其特征在于：有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液浓缩后，有机溶剂萃取，萃取液用氢氧化钠溶液萃取，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸，其中，有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或石油醚；优选有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液旋蒸浓缩后，用等体积的有机溶剂萃取3次，合并萃取液，浓缩后再用等体积的氢氧化钠溶液萃取3次，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。
10.根据权利要求8所述的阿魏酸的生物合成方法，其特征在于：树脂吸附分离法的具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液投入大孔树脂或离子交换树脂，搅拌，过滤收集树脂，纯化水冲洗后，乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，除净乙醇，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。
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