CN103243066B

CN103243066B - 一种生产番茄红素的菌株及其应用

Info

Publication number: CN103243066B
Application number: CN201310209514.3A
Authority: CN
Inventors: 刘天罡; 朱发银; 邓子新
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2033-05-30
Also published as: CN103243066A

Abstract

本发明公开了一种生产番茄红素的菌株及其应用，属于合成生物学领域。生产番茄红素的菌株含有甲羟戊酸途径和经过密码子优化的番茄红素合成的相关基因；经密码子优化的番茄红素合成基因序列如SEQ ID NO.1-3所示。该菌株可用于生产番茄红素，将其种子液接入含碳源的培养基中进行原核表达得到番茄红素。对番茄红素合成的基因进行密码子优化或使甲羟戊酸途径各蛋白更加接近AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5可以进一步促进生产番茄红素。本发明使番茄红素产量大幅提高达到1g/L以上，且发酵周期缩短50%以上。

Description

一种生产番茄红素的菌株及其应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产番茄红素的菌株及其应用。

背景技术

番茄红素是一种重要的抗氧化剂，具有抗衰老，抗肿瘤和降低中风、心脑血管等疾病风险的功效，因此其可作为天然保健食品或药物。番茄红素在食品、化妆品以及医药领域具有重要用途，具有广阔的市场价值。

目前世界上番茄红素的开发生产主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等方法。天然提取主要是通过大量种植西红柿，果实成熟后通过萃取纯化获得。这种植物源的天然产物已广受消费者接受，然而此种生产方式有众多劣势。首先基于植物源材料的工业生产严重依赖其产量，受天气等不可控因素影响，具有不稳定性；大面积种植成本居高不下；具有明显的季节性；在植物果实中含量很低，而且天然萃取产率低。而利用微生物生产能很好的克服这些问题。微生物发酵生产番茄红素具有周期短，成本低、环保、安全性高、原料易获取，产物易纯化等特点。

微生物发酵最大的瓶颈在于如何实现工业化，而工业化的必要条件是其产量需要满足可以工业化的水平。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产番茄红素的菌株。

本发明的另一目的在于提供上述生产番茄红素的菌株的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用上述菌株生产番茄红素的方法。

本发明的目的还在于提供一种提高原核生物生产番茄红素能力的方法。

一种生产番茄红素的菌株，含有甲羟戊酸途径（MVA途径）和经过密码子优化的番茄红素合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括（1）将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB、（2）将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因erg13、（3）将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1、（4）将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12、（5）将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、（6）将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1和（7）将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi；所述的番茄红素合成的相关基因包括（1）将异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸缩合为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的基因crtE、（2）将两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸缩合为八氢番茄红素的基因crtB和（3）将八氢番茄红素脱氢生成番茄红素的基因crtI。

所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌BL21（DE3）的atoB（CP001509.3:2216470-2217654）、idi（CP001509.3:2863926-2864474）和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（329138949:19060-20535）、thmg1（329138949:115734-117239）、erg12（329138949:684467-685798）、erg8（329138949:712316-713671）、mvd1（329138953:701895-703085）。

所述的经过密码子优化的crtE、crtB和crtI基因优选为以来源于菠萝泛菌Pantoea ananatis的crtE（D90087.2:225-1133）、crtB（D90087.2:5057-5986）和crtI（D90087.2:3582-5060）基因为基础进行密码子优化得到，经过密码子优化的crtE、crtB和crtI基因的序列优选为如SEQID NO.1～3所示的序列。

优选的，所述的生产番茄红素的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ110的大肠杆菌；所述的质粒pMH1以pBBR1MCS为骨架载体、启动子为lac启动子，复制子替换为p15A复制子，包含atoB、erg13和thmg1基因，pMH1的序列（不含骨架载体序列）如SEQID NO.4所示；所述的质粒pFZ81以pBBR1MCS-2为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为质粒自带的pBBR1MCS复制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pFZ81的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.5所示；所述的质粒pFZ110以pET28a(+)为骨架载体、启动子为T7强启动子、复制子为质粒自带的高拷贝的pBBR322复制子，包含crtE、crtB和crtI基因，pFZ110的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.6所示。

更优选的，所述的生产番茄红素的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ111的大肠杆菌；所述的质粒pFZ111以pET28a(+)为骨架载体、启动子为T7强启动子、复制子为质粒自带的高拷贝的pBBR322复制子，包含crtE、crtB、crtI和idi基因，pFZ111的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.7所示。

上述生产番茄红素的菌株在生产番茄红素中的应用。

利用上述生产番茄红素的菌株生产番茄红素的方法，包含如下步骤：将上述生产番茄红素的菌株种子液接入含碳源的培养基中进行原核表达得到番茄红素。

所述的碳源优选为甘油、单糖（木糖，葡萄糖等）或多糖（纤维素等），更优选的，所述的碳源为五碳糖（木糖）。

所述的培养基优选为2×TY培养基或M9培养基。

所述的原核表达的诱导时间优选为菌液的OD₆₀₀为20～40。

所述的原核表达优选为在发酵罐中进行；在发酵罐中用M9培养基进行表达时，最佳诱导时间为菌液的OD₆₀₀为40。

原核表达时MVA途径各蛋白比例优选为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1-55∶2-15∶2-30∶1-5∶1-5∶2-20∶4-600；更优选的，AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5。

一种提高原核生物生产番茄红素能力的方法，通过对番茄红素合成的相关基因进行密码子优化；或使MVA途径各蛋白更加接近AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5的进一步改造；或过表达Idi、ERG8、MVD1、ERG13、ERG12和tHMG1中的任一或多个基因可以实现。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：代谢通路中各个蛋白并不是按照等摩尔情况才是最高效的，而是应该按照一定比例来最大化反应速率，本发明利用体外重建体系研究确定了MVA途径各个蛋白的最佳比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5，然后通过更加理性的合成生物学手段改造通过MVA途径生产番茄红素的各蛋白的比例，通过控制这些蛋白的比例，在最短时间内能快速的提高番茄红素的产量，该方法比传统基因工程利用随机改变代谢通路上的蛋白表达量更具有目标性，因而实验更加理性、快速、有效。同时本发明通过密码子优化合成番茄红素合成相关基因，使得这些基因能够更容易在异源宿主内进行表达。再者，在后续的发酵过程中，我们将发酵过程进行优化。通过这些技术使番茄红素产量达到1g/L以上，且发酵周期缩短50%以上，具有很好的工业运用前景。

附图说明

图1是甲羟戊酸途径示意图。

图2是番茄红素合成途径示意图。

图3是Idi利于萜类化合物生产示意图。

图4是MVA途径各蛋白优化比例对反应速率的影响图。

图5是质粒pMH1示意图。

图6是质粒pFZ81示意图。

图7是质粒pFZ110示意图。

图8是质粒pFZ111示意图。

图9是本发明番茄红素生产菌株（L1、L2和L3）示意图。

图10是L1、L2和L3菌株摇瓶发酵生产番茄红素结果图，L1通过MEP途径生产番茄红素，L2和L3通过MEP和MVA途径生产番茄红素。

图11是L3菌株用2×TY培养基进行发酵罐不同诱导时间发酵结果图。

图12是L3菌株用M9进行发酵罐不同诱导时间发酵生产番茄红素结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

通过体外重建实验表明增加ERG13，ERG8和Idi对重建体系中萜类化合物生产有促进作用，特别是增加Idi的效果更加明显，体外重建实验获得的甲羟戊酸途径各个蛋白的优化比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5。随后从大肠杆菌和酿酒酵母基因组DNA中扩增相应基因构建了用于大肠杆菌表达的甲羟戊酸途径。随后经密码子优化和基因合成构建了从甲羟戊酸产物异戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）生产番茄红素的通路，并实现了重组大肠杆菌高效生产番茄红素。相关反应途径见图1和图2。经蛋白定量实验发现构建的菌株与体外实验获得的优化比例还有一定差距，还有较大的提升潜能有待挖掘，可以朝着蛋白优化比例进行进一步改造。

实施例中所用到的引物如表1所示：

实施例1体外重建体系优化甲羟戊酸途径

体外重建体系实验方法同2011年Yu等人建立的方法（Yu,X.,et al.,2011.In vitroreconstitution and steady-state analysis of the fatty acid synthase from Escherichia coli.Proceedingsof the National Academy of Sciences.108,18643-18648.），通过对甲羟戊酸途径的各个蛋白的研究表明增加ERG13，ERG8和Idi对萜类化合物生产有促进作用，特别是增加Idi的效果更加明显（图3），体外重建实验获得的MVA途径各个蛋白的优化比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5，与等摩尔的各个蛋白相比，反应速率有明显提高（图4）

实施例2甲羟戊酸途径质粒构建

用Qiagen公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit纯化获得大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA和酿酒酵母INVSC1基因组DNA。

质粒pMH1含有甲羟戊酸途径前三个基因：来源于大肠杆菌BL21(DE3)的atoB基因（乙酰乙酰辅酶A硫酯酶），来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（HMG-CoA合酶，3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A合酶）和thmg1（HMG-CoA还原酶，3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶，删除了HMG1的跨膜区域）。质粒pFZ81含有甲羟戊酸途径后四个基因：来源于酿酒酵母INVSC1的erg12（甲羟戊酸激酶），erg8（甲羟戊酸-5-磷酸激酶）和mvd1（甲羟戊酸-5-焦磷酸激酶），来源于大肠杆菌BL21(DE3)的idi（异戊烯焦磷酸异构酶）基因。所有基因均通过PCR扩增获得，所用引物见表1。

具体构建方法如下：

（1）质粒pMH1的构建

首先利用simple cloning方法（You,C.,et al.,2012.Simple Cloning via Direct Transformationof PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis.Applied andenvironmental microbiology.78,1593-1595.），将pBBR1MCS质粒的复制子替换为来源于pMSD15质粒的p15A复制子。以质粒pBBR1MCS为模板用引物pBBR1MCS1-p15A-f和pBBR1MCS1-p15A-r进行扩增获得pBBR1MCS片段，同时p15A复制子用引物p15A-f和p15A-r扩增（引物序列见表1）获得p15A片段，经PCR产物纯化后用Nanodrop测定DNA浓度，然后将20ng PCR扩增的p15A片段和等摩尔的pBBR1MCS片段混合，经过一轮PCR扩增，扩增条件为：98℃，2min预变性，然后30个PCR循环98℃，20s；60℃，20s；72℃，6min，最后72℃充分延伸10min。随后转化大肠杆菌XL1-blue获得质粒pBBR1MCS/p15A。

用引物pBBR1MCS1-f和pBBR1MCS1-r以pBBR1MCS/p15A为模板扩增pMH1质粒骨架，同时用AtoB-f，AtoB-r；ERG13-f，ERG13-r；tHMG1-f，tHMG1-r为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pMH1质粒骨架和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液（Gibson,D.G.,2011.Enzymaticassembly of overlapping DNA fragments.Methods Enzymol.498,349-361.）中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pMH1，该质粒示意图如图5所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.4所示。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒复制子为p15A复制子。

（2）质粒pFZ81的构建

用引物pBBR1MCS2-f和pBBR1MCS2-r以pBBR1MCS-2为模板扩增pFZ81质粒骨架，同时用ERG12-f，ERG12-r；ERG8-f，ERG8-r；MVD1-f，MVD1-r；Idi-f，Idi-r为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pFZ81质粒骨架和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pFZ81，该质粒示意图如图6所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.5所示。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒复制子为pBBR1MCS复制子。

实施例3番茄红素产生代谢途径质粒构建

来源于菠萝泛菌Pantoea ananatis的crtE，crtB和crtI基因经南京金斯瑞生物科技有限公司密码子优化后进行基因合成（序列如SEQ ID NO.1-3所示），随后通过NdeI和XhoI酶切位点插入到质粒pET28a(+)中，获得质粒pFZ21，pFZ22和pFZ23。然后依次将来源于pFZ22和pFZ23含有crtB和crtI的XbaI-XhoI片段插入到pFZ21的SpeI-XhoI片段中获得质粒pFZ27，最后将pFZ27的XbaI-XhoI片段插入到质粒pET21a(+)中获得用于生产番茄红素的质粒pFZ110该质粒示意图如图7所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.6所示。

Idi基因以BL21(DE3)基因组DNA为模板通过PCR扩增（引物Idi-NdeI，Idi-XhoI见表1），然后通过NdeI，XhoI酶切后插入到经相同酶切的pET28a（+）质粒上，获得质粒pET28-Idi。随后利用SpeI与XbaI为同尾酶进行DNA连接。将pFZ110质粒骨架用SpeI-XhoI双酶切，同时将质粒pET28-Idi质粒用XbaI-XhoI双酶切后切胶回收获得含Idi基因的XbaI-XhoI片段，再用T4DNA连接酶将上述两个片段连接获得将Idi插入到pFZ110中的质粒pFZ111，该质粒示意图如图8所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.7所示。pFZ110和pFZ111质粒均使用T7强启动子控制基因表达，而且复制子也是pBBR322高拷贝的复制子。

实施例4番茄红素产生菌株的构建

直接将质粒pFZ110转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pFZ110，命名为菌株L1，该菌株是利用大肠杆菌体内本底非甲羟戊酸途径（MEP途径）生产番茄红素。将甲羟戊酸途径的两个质粒pMH1和pFZ81同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得BL21(DE3)/pMH1/pFZ81，命名为PS（parent strain）。将pFZ110和pFZ111分别转化进入菌株PS中，获得菌株L2和L3。菌株L1、L2和L3示意图如图9所示。

实施例5摇瓶发酵生产番茄红素

分别挑取十个L1，L2和L3菌株的单菌落到含2%（v/v）甘油的2×TY培养基中（同时含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素），于30℃，220rpm过夜培养，随后按1%（v/v）接种量接种到新鲜的同一培养基中30℃，220rpm继续培养至OD₆₀₀约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导表达后根据设定的时间点进行取样，每次取样1mL，4000g离心3min后弃上清，细胞沉淀保存于-40℃直至进一步分析。

对于摇瓶发酵液，1mL发酵液离心收集菌体，加入5mL丙酮于55℃萃取15min，期间每隔5min取出涡旋震荡萃取。随后经8000g离心3min后，测定OD₄₇₄，基于番茄红素的吸光系数为1.85×10⁵L/mol/cm对番茄红素进行定量。整个分析过程均在暗环境下进行以减少番茄红素降解。生产番茄红素的结果如图10所示，L1菌株在诱导后48h番茄红素产量约为0.2mg/L，L2菌株的产量为40.6mg/L，L3菌株产量达到55.6mg/L。

结论：

（1）三株菌均可产生番茄红素，证明我们构建的利用甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径生产番茄红素的重组菌株是可行的。

（2）L2菌株产量是L1菌株产量的200倍，证明我们构建的甲羟戊酸途径是相对高效的。

（3）L3菌株产量比L2菌株高出37%，证明过量表达Idi蛋白能够提高番茄红素的量。

实施例6摇瓶发酵MVA途径蛋白定量

L2，L3培养诱导条件同上，IPTG诱导20小时候取100mL菌液，离心收集菌体，菌体重悬于100mM NH₄HCO₃溶液中，用超声破碎仪破碎细胞（脉冲5s，停8s，超声时间为8min）。破碎液4℃10000g离心30min，吸取上清4℃，200000g超速离心2h，小心吸取上清至新的1.5mL离心管中，每管分装100μL，液氮速冻后-80℃保存备用。随后用Keasling组报道的利用质谱进行蛋白定量方法（Redding-Johanson,A.M.,et al.,2011.Targeted proteomics formetabolic pathway optimization:application to terpene production.Metabolic Engineering.13,194-203.）对MVA途径中各蛋白定量。

蛋白定量结果表明MVA途径中各蛋白比例为：

L2菌株中AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=10∶15∶2∶1∶1∶20∶4；

L3菌株中AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=55∶2∶30∶2∶1∶2∶600；

这与体外重建体系获得的优化比例AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5还有一定距离，说明构建的菌株还未达到理想状态，还有很大的生产潜能有待开发，可通过进一步改造朝着蛋白优化比例改造。

实施例7不同碳源培养基对番茄红素产量的影响

分别挑取十个L3菌株的单菌落到含2%（v/v）甘油（或葡萄糖或木糖）的2×TY培养基中（同时含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素），于30℃，220rpm过夜培养，随后按1%（v/v）接种量接种到新鲜的同一培养基中30℃，220rpm继续培养至OD600约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达。

结果发现利用木糖作为碳源的发酵液颜色更红，其次为甘油作为碳源的，颜色最浅的是以葡萄糖为碳源的发酵液，表明以木糖作为碳源能获得更高的番茄红素产量。

结论：通过培养基的优化能够提高番茄红素的产量，且利用五碳糖（木糖）作为碳源在同样的条件下能生产更多的番茄红素。

实施例8发酵罐中不同的诱导时间对番茄红素产量的影响

挑取十个新鲜转化的L3单菌落到含2%（v/v）甘油的2×TY培养基中（同时含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素）于30℃，220rpm过夜培养，随后按1%（v/v）接种量接种到含2%甘油的2×TY培养基中30℃，220rpm继续培养至OD₆₀₀约为2～3时，200mL接种至含有2.3L含2%甘油的2×TY培养基的7.5L发酵罐中。整个发酵过程维持在30℃，用antifoam204进行消泡。发酵初始转速为200rpm，通气为2L/min，随后调整转速（200～900rpm）和通气量（2～10L/min）保证溶氧不低于50%。当OD₆₀₀约为15时，开始补料（补料培养基为：500g/L甘油，2g/L七水硫酸镁），补料速度为1.2mL/min。当OD₆₀₀分别达到约为6，13，20，30时，加入IPTG至终浓度为0.2mM用于诱导表达，立即用锡箔纸将发酵罐包裹从而保证避光发酵减少番茄红素的降解。随后整个过程补料速度降为0.7mL/min，用9.9N的氨水维持pH为7.2，通过调整转速（200～900rpm）和通气量（2～10L/min）保证溶氧不低于20%。诱导后按照设定时间取样，每次取样50mL，直接保存于-40℃备用。

取0.5mL发酵液，4000g离心3min，吸取上清至15mL离心管内。细胞沉淀中加入20mL丙酮于55℃萃取15min，期间每隔5min取出vortex震荡萃取。随后经8000g离心3min后，测定OD₄₇₄，基于番茄红素的吸光系数为1.85×10⁵L/mol/cm对番茄红素进行定量。整个分析过程均在暗环境下进行以减少番茄红素降解。用2×TY培养基进行发酵时，对不同时期诱导的实验证实（结果如图11所示），当诱导时期为OD₆₀₀为20～30时，得到的产量最高，达到340mg/L，明显优于前期诱导结果。

实施例9M9培养基更有利于番茄红素的生产

挑取十个新鲜转化的L3单菌落到含2%（v/v）甘油的2×TY培养基中（同时含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素）于30℃，220rpm过夜培养，随后按1%（v/v）接种量接种到含4%（v/v）甘油的M9培养基中（Lu,X.,et al.,2008.Overproductionof free fatty acids in E.coli:Implications for biodiesel production.Metabolic engineering.10,333-339）30℃，220rpm继续培养至OD₆₀₀约为2～3时，200mL接种至含有2.3L M9培养基的7.5L发酵罐中。整个发酵过程维持在30℃，用antifoam204进行消泡。发酵初始转速为200rpm，通气为2L/min，随后调整转速（200-900rpm）和通气量（2-10L/min）保证溶氧不低于50%。当OD₆₀₀约为15时，开始补料（补料培养基为：500g/L甘油，2g/L七水硫酸镁），补料速度为1.2mL/min。当OD₆₀₀约为20，40时，加入IPTG至终浓度为0.2mM用于诱导表达，立即用锡箔纸将发酵罐包裹从而保证避光发酵减少番茄红素的降解。随后整个过程补料速度降为0.7mL/min，用9.9N的氨水维持pH为7.2，通过调整转速（200～900rpm）和通气量（2～10L/min）保证溶氧不低于20%。诱导后按照设定时间取样，每次取样50mL，直接保存于-40℃备用。

按照实施例8的方法，在用M9进行发酵时当OD₆₀₀达20时诱导，诱导后33h番茄产量达到900mg/L，诱导后50h番茄红素产量超过1g/L。当OD₆₀₀达到40才诱导时，诱导后27h番茄红素达到1g/L，诱导超过42h后，番茄红素产量下降（如图12所示）。同时发酵过程中，M9培养中的获得的菌体明显多于用2×TY培养基所获得的菌体，菌浓越高番茄红素的产量越高。

结论：

（1）发酵罐能显著提高番茄红素产量；

（2）发酵生产番茄红素诱导不能过早；

（3）用M9培养基进行发酵时，最佳诱导OD₆₀₀为40；

（4）番茄红素的产量与菌浓正相关，发酵优化应估计尽量提高菌浓。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种生产番茄红素的菌株及其应用

<130> 1

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 929

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crtE（opti）序列

<400> 1

catatgaccg tgtgtgcgaa aaaacatgtg catctgaccc gtgacgccgc cgaacaactg 60

ctggccgaca tcgaccgccg cctggatcaa ctgctgccgg ttgaaggcga acgtgatgtg 120

gttggtgcag caatgcgtga aggcgcgctg gcaccgggta aacgtattcg cccgatgctg 180

ctgctgctga ccgcgcgtga tctgggttgc gcagtcagtc acgatggtct gctggacctg 240

gcatgtgctg tcgaaatggt tcatgcggct agcctgatcc tggatgacat gccgtgcatg 300

gatgacgcaa aactgcgtcg cggtcgtccg accattcata gccactatgg tgaacacgtt 360

gcaatcctgg cagcagtcgc actgctgtct aaagcctttg gcgtgattgc agatgcagac 420

ggtctgacgc cgctggcaaa aaaccgtgct gtcagtgaac tgtccaatgc gatcggtatg 480

cagggtctgg tgcagggcca attcaaagac ctgagtgaag gtgacaaacc gcgctccgca 540

gaagctattc tgatgaccaa ccactttaaa acctctacgc tgttctgcgc atctatgcag 600

atggcttcta tcgttgcgaa tgccagctct gaagcccgtg attgtctgca tcgctttagc 660

ctggatctgg gccaggcatt ccaactgctg gatgacctga ccgatggcat gaccgacacg 720

ggtaaagatt caaaccagga cgcgggcaaa tcgacgctgg tgaatctgct gggtccgcgt 780

gcagttgaag aacgtctgcg ccagcatctg caactggctt cagaacacct gtcggcagct 840

tgtcaacatg gtcacgcaac gcagcacttc atccaagcct ggttcgataa aaaactggca 900

gcggtgtcgt aactagtgaa ttcctcgag 929

<210> 2

<211> 950

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crtB（opti）序列

<400> 2

catatgaata atccgtccct gctgaatcac gctgttgaaa cgatggctgt cggctctaaa 60

tcatttgcta ccgcttctaa actgttcgac gcaaaaaccc gtcgctccgt tctgatgctg 120

tatgcgtggt gccgtcattg tgatgacgtc attgatgacc agacgctggg ttttcaggca 180

cgtcaaccgg cactgcagac cccggaacaa cgtctgatgc agctggaaat gaaaacgcgc 240

caagcatacg ctggtagcca gatgcacgaa ccggcctttg cggccttcca ggaagtcgcg 300

atggcccatg atattgcacc ggcttatgcg tttgaccacc tggaaggctt cgcgatggat 360

gtgcgtgaag cacagtactc tcaactggat gacaccctgc gctattgcta ccatgtggcg 420

ggcgtggttg gtctgatgat ggcccagatc atgggcgttc gtgataacgc aaccctggat 480

cgtgcgtgcg acctgggtct ggctttccag ctgacgaata ttgcacgtga tatcgtggat 540

gacgcccatg caggccgctg ttatctgccg gcgtcatggc tggaacacga aggtctgaac 600

aaagaaaatt acgcagctcc ggaaaaccgt caagctctgt cgcgcatcgc gcgtcgcctg 660

gttcaggaag ccgaaccgta ttacctgagc gctaccgcag gtctggcagg tctgccgctg 720

cgttctgcct gggcaattgc tacggcgaaa caagtctatc gcaaaatcgg cgtcaaagtg 780

gaacaggctg gtcagcaagc gtgggatcag cgtcaaagta ccacgacccc ggaaaaactg 840

accctgctgc tggcggcctc cggtcaggcg ctgacctccc gtatgcgtgc tcatccgccg 900

cgtccggccc atctgtggca acgtccgctg tgactagtga attcctcgag 950

<210> 3

<211> 1499

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crtI（opti）序列

<400> 3

catatgaaac cgaccacggt gattggtgct ggctttggcg gcctggctct ggcgattcgt 60

ctgcaagcgg ctggcattcc ggtgctgctg ctggaacagc gtgataaacc gggcggtcgc 120

gcctatgttt acgaagatca aggctttacc ttcgacgctg gtccgaccgt cattacggac 180

ccgagtgcga tcgaagaact gtttgcgctg gccggcaaac agctgaaaga atatgttgaa 240

ctgctgccgg tcaccccgtt ttaccgtctg tgctgggaat ctggtaaagt gttcaactat 300

gataatgacc agacgcgcct ggaagctcaa attcagcaat tcaacccgcg tgatgttgaa 360

ggctatcgcc agtttctgga ctacagtcgt gccgtgttca aagaaggcta tctgaaactg 420

ggtaccgttc cgtttctgtc cttccgtgat atgctgcgtg cagccccgca gctggcaaaa 480

ctgcaagcct ggcgtagcgt gtattctaaa gttgctagct acatcgaaga tgaacacctg 540

cgccaggcgt ttagtttcca ttccctgctg gttggcggca atccgtttgc caccagctct 600

atttatacgc tgatccatgc actggaacgt gaatggggtg tctggtttcc gcgcggcggt 660

accggcgcgc tggtgcaggg tatgattaaa ctgttccagg atctgggcgg cgaagtggtt 720

ctgaacgccc gcgttagcca catggaaacc acgggcaata aaatcgaagc agtccatctg 780

gaagatggtc gtcgctttct gacccaggca gtggcttcta acgcagatgt cgtgcacacg 840

tatcgtgacc tgctgagcca gcatccggca gctgtgaaac agtctaacaa actgcaaacc 900

aaacgcatgt caaattcgct gtttgttctg tacttcggcc tgaaccatca ccatgatcag 960

ctggcgcacc atacggtctg ttttggcccg cgttatcgcg aactgattga cgaaatcttt 1020

aatcacgatg gtctggcgga agacttctca ctgtacctgc acgcgccgtg cgtgaccgat 1080

agttccctgg caccggaagg ctgtggttcg tattacgtcc tggcaccggt gccgcacctg 1140

ggtaccgcta acctggattg gacggtggaa ggtccgaaac tgcgtgaccg catttttgcc 1200

tatctggaac agcactacat gccgggcctg cgtagccaac tggttaccca tcgcatgttc 1260

acgccgtttg atttccgtga ccagctgaat gcatatcatg gttcagcttt ttcggttgaa 1320

ccggtcctga cccaatccgc atggttccgt ccgcacaacc gcgataaaac cattacgaat 1380

ctgtacctgg ttggcgcggg tacgcatccg ggcgccggta tcccgggtgt gattggctcg 1440

gcgaaagcga cggctggcct gatgctggaa gacctgattt gactagtgaa ttcctcgag 1499

<210> 4

<211> 4515

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMH1序列（不含骨架载体序列）

<400> 4

gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca ccgcggtggc ggccgctcta 60

gaactagtgg atccttagga tttaatgcag gtgacggacc catctttcaa acgatttata 120

tcagtggcgt ccaaattgtt aggttttgtt ggttcagcag gtttcctgtt gtgggtcata 180

tgactttgaa ccaaatggcc ggctgctagg gcagcacata aggataattc acctgccaag 240

acggcacagg caactattct tgctaattga cgtgcgttgg taccaggagc ggtagcatgc 300

gggcctctta cacctaataa gtccaacatg gcaccttgtg gttctagaac agtaccacca 360

ccgatggtac ctacttcgat ggatggcatg gatacggaaa ttctcaaatc accgtccact 420

tctttcatca atgttataca gttggaactt tcaacatttt gtgcaggatc ttgtcctaat 480

gccaagaaaa cagctgtcac taaattagct gcatgtgcgt taaatccacc aacagaccca 540

gccattgcag atccaaccaa attcttagca atgttcaact caaccaatgc ggaaacatca 600

ctttttaaca cttttctgac aacatcacca ggaatagtag cttctgcgac gacactctta 660

ccacgacctt cgatccagtt gatggcagct ggtttttttg tcggtacagt agttaccaga 720

aacggagaca acctccatat cttcccagcc atactcttct accatttgct ttaatgagta 780

ttcgacacct ttagaaatca tattcatacc cattgcgtca ccagtagttg ttctaaatct 840

catgaagagt aaatctcctg ctagacaagt ttgaatatgt tgcagacgtg caaatcttga 900

tgtagagtta aaagcttttt taattgcgtt ttgtccctct tctgagtcta accatatctt 960

acaggcacca gatcttttca aagttgggaa acggactact gggcctcttg tcataccatc 1020

cttagttaaa acagttgttg caccaccgcc agcattgatt gccttacagc cacgcatggc 1080

agaagctacc aaacaaccct ctgtagttgc cattggtata tgataagatg taccatcgat 1140

aaccaagggg cctataacac caacgggcaa aggcatgtaa cctataacat tttcacaaca 1200

agcgccaaat acgcggtcgt agtcataatt tttatatggt aaacgatcag atgctaatac 1260

aggagcttct gccaaaattg aaagagcctt cctacgtacc gcaaccgctc tcgtagtatc 1320

acctaatttt ttctccaaag cgtacaaagg taacttaccg tgaataacca aggcagcgac 1380

ctctttgttc ttcaattgtt ttgtatttcc actacttaat aatgcttcta attcttctaa 1440

aggacgtatt ttcttatcca agctttcaat atcgcgggaa tcatcttcct cactagatga 1500

tgaaggtcct gatgagctcg attgcgcaga tgataaactt ttgactttcg atccagaaat 1560

gactgtttta ttggttaaaa cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat 1620

gctagccata tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct 1680

gctgcccata gtgtaatcct ccttattttt taacatcgta agatcttcta aatttgtcat 1740

cgatgttggt caagtagtaa acaccacttt gcaaatgctc aatggaacct tgaggtttga 1800

agttcttctt caaatgggca ttttctctca attcgatggc agcttcgtaa tcctttggag 1860

tttcggtgat tctcttggct aatttgttag taatatctaa ttccttgata atatgttgga 1920

cgtcaccaac aattttgcaa gaatatagag atgcagctaa accggaaccg taagaaaata 1980

aaccaacacg cttgccttgt aagtcgtcag atccaacata gtttaataga gatgcaaagg 2040

cggcataaac agatgcggtg tacatgttac ctgtgtttgt tggaacaatc aaagattggg 2100

caactctctc tttgtggaat ggcttagcaa cattaacaaa agttttttca atgttcttat 2160

cggttaaaga ttcgtcataa tcgcgagtag ctaattcggc gtcaacttct gggaacaatt 2220

gaggattggc tctgaaatcg ttatatagta atctaccgta tgattttgtg accaatttac 2280

aggttggaac atggaaaacg ttgtagtcga aatatttcaa aacgttcaaa gcatccgaac 2340

cagcgggatc gctaaccaac cctttagaaa tagccttctt ggaataactc ttgtaaactt 2400

gatcaagagc cttgacgtaa caagttaatg aaaaatgacc atcgacgtaa ggatattcgc 2460

tggtgaaatc tggcttgtaa aaatcgtagg cgtgttccat gtaagaagct cttacagagt 2520

caaatacaat tggagcatca ggaccgatcc acatagcaac agtaccggca ccaccggttg 2580

gtcttgcggc acccttatcg tagatggcaa tatcaccgca aactacaatg gcgtctctac 2640

catcccatgc gttagattca atccagttca aagagttgaa caacgcgttg gtaccaccgt 2700

aacaggcatt aagcgtgtca ataccttcga cgtcagtgtt ttcaccaaac aattgcatca 2760

agacagactt gacagacttg gacttgtcaa tcagagtttc agtaccgact tctaatctac 2820

caattttgtt ggtgtcgatg ttgtaactct tgatcaactt agacaaaaca gttagggaca 2880

tcgagtagat atcttctctg tcattgacaa aagacatgtt ggtttggccc agaccaattg 2940

tgtatttacc ttgagaaacg ccatcaaatt tctctagctc agattggttg acacattgag 3000

ttgggatgta aatttggata cctttaatac cgacattttg aggtctggtt ttttgttcag 3060

cggtcttttg tttttttagt tcagtcattt gcaagtttgt attgtgtaat tgttgttgct 3120

tttgcggcct aagtcttcct ttaataccac accaacaaag tttagttgag agtttcattt 3180

agctgtcctc cttaattcaa ccgttcaatc accatcgcaa ttccctgacc gccgccaatg 3240

cacagtgttg ccagccccag cgttttatcg cgtgcctgca tggcatgtaa tagtgtgacc 3300

agaatacgag caccactggc accgatagga tgcccgagcg cgatggcccc gccgttgaca 3360

ttcactttct cagaatcaaa gcccaggttt ttcccaacgg caaggaactg tgcagcaaat 3420

gcttcattag cctcaatgag atcaatatcc gccagttgca gccccgccag ttgtaacgct 3480

ttttgcgtgg caggtactgg ccccataccc atcaatgcgg ggggcacgcc accgctggca 3540

taacttttaa tgcgagccag gggggtaagg cctgctgcca gcgccgcaga ttcttccata 3600

atcaccagag cggcagcacc gtcgttaata ccagacgcgt tcccagcggt gactgttcct 3660

gctttatcga aggccgggcg caatgcacct aacgcttcag ccgttgaatt cgctttcggg 3720

aattcgtctt gactgaagac gaaggttttc tttcgagtga caacatttac cgggacgatt 3780

tcggctgtaa aagcaccgga ctcaattgcg gctgccgctt tacgctgtga atgtagcgcc 3840

agttcatcct gcatttcacg ggtaattccg tactctttag ccacgttttc ggcggtaatc 3900

cccatatgat aaccatgggt ggcgcacatc aggccatcgc gcaggattac gtcataaacc 3960

tgtccgtctc caagacgata accagagcgt gcttttgcat cgagtaagta gggggctaaa 4020

ctcatatttt ccataccccc cgccacaatg ctctgcgcct gacctgcctg aatggcctgg 4080

gcggcaagcg ccacactttt aagacccgaa ccacatactt tattgaccgt gaatccgcac 4140

accgtttctg ccagcccgct ttttaacagt gcctgacgcg ccggattttg ccccagcccg 4200

gcttgtaaca cgttacccat aatcacttca tcaacgtgtt gtgaatcgat ttttgcacgt 4260

tcaatggcgg ctttaattac tgtcgccccc aggtcgatgg cgctggtgga agcgagtgaa 4320

ccgttaaaac taccgatagc agtacgtacc gcactgacga tgacacaatt tttcatttta 4380

tattcctcct agtcgactct agaggatccc cgggctgcag gaattcgata tcaagcttat 4440

cgataccgtc gacctcgagg gggggcccgg tacccagctt ttgttccctt tagtgagggt 4500

taattgcgcg ctggg 4515

<210> 5

<211> 4667

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pFZ81序列（不含骨架载体序列）

<400> 5

cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctct tatttaagct gggtaaatgc 60

agataatcgt tttctggctt cgcgatttgt cgcctgcatc accatccacg gactgaacgc 120

ccacggcgtg gcatcaatac cgtgtaatac atctgctaaa tcacaccatt gataatccat 180

cacttcatca tcattgatct gtaacgcact agtggtgcgt gcggcaaata ccggacacac 240

ttcattttcc acaatgccac tcggatcggt ggcgcggtag cgaaagtcag gatagataga 300

ttcaggaggc gtaatttcca cgccaagctc ataacggcaa cggcggatca ctgcgtcttc 360

gttgctttct cccagttgtg ggtgcccaca aaccgagtta gtccacacgc caggccatgc 420

ttttttgctc agtgcgcggc gggtaactaa taattgtcct ttggcattaa acagccaact 480

ggagaacgcg agatgtaagc gggtgtctgc cgtgtgtgcg gcatactttt ccagcgtacc 540

cgtgggaact ccctgtgcat tcaataaaat gacgtgttcc gtttgcatat ggctgccgcg 600

cggcaccagg ccgctgctgt gatgatgatg atgatggctg ctgcccatat agtaatcctc 660

ctcccgggct gcagttattc ctttggtaga ccagtctttg cgtcaatcaa agattcgttt 720

gtttcttgtg ggcctgaacc gacttgagtt aaaatcactc tggcaacatc cttttgcaac 780

tcaagatcca attcacgtgc agtaaagtta gatgattcaa attgatggtt gaaagcctca 840

agctgctcag tagtaaattt cttgtcccat ccaggaacag agccaaacaa tttatagata 900

aatgcaaaga gtttcgactc attttcagct aagtagtaca acacagcatt tggacctgca 960

tcaaacgtgt atgcaacgat tgtttctccg taaaactgat taatggtgtg gcaccaactg 1020

atgatacgct tggaagtgtc attcatgtag aatattggag ggaaagagtc caaacatgtg 1080

gcatggaaag agttggaatc catcattgtt tcctttgcaa aggtggcgaa atctttttca 1140

acaatggctt tacgcatgac ttcaaatctc tttggtacga catgttcaat tctttcttta 1200

aatagttcgg aggttgccac ggtcaattgc ataccctgag tggaactcac atccttttta 1260

atatcgctga caactaggac acaagctttc atctgaggcc agtcagagct gtctgcgatt 1320

tgtactgcca tggaatcatg accatcttca gcttttccca tttcccaggc cacgtatccg 1380

ccaaacaacg atctacaagc tgaaccagac ccctttcttg ctattctaga tatttctgaa 1440

gttgactgtg gtaattggta taacttagca attgcagaga ccaatgcagc aaagccagca 1500

gcggaggaag ctaaaccagc tgctgtagga aagttatttt cggagacaat gtggagtttc 1560

cattgagata atgtgggcaa tgaggcgtcc ttcgattcca tttcctttct taattggcgt 1620

aggtcgcgca gacaattttg agttctttca ttgtcgatgc tgtgtggttc tccatttaac 1680

cacaaagtgt cgcgttcaaa ctcaggtgca gtagccgcag aggtcaacgt tctgaggtca 1740

tcttgcgata aagtcactga tatggacgaa ttggtgggca gattcaactt cgtgtccctt 1800

ttcccccaat acttaagggt tgcgatgttg acgggtgcgg taacggatgc tgtgtaaacg 1860

gtcatgagta ttacctccta tttatcaaga taagtttccg gatctttttc tttcctaaca 1920

ccccagtcag cctgagttac atccagccat tgaaccttag aaaatctttt gtcattagcg 1980

gtttgagccc taagatcaac atcttgctta gtaatcactg caatggcgtc ataaccacca 2040

gcaccaggta ttaagcaagt aagaactcct tttaaggtct ggcaatcatc caataagcta 2100

gtttgtacgg gaggttcgat atcggcacca gattctttag ttatttttct aaaggaacgt 2160

ctaattgtgg caactgcatc tctaacttct gtgatttcag gatacttttg acaggtacag 2220

tcattcctct caagagactc aaatatctga tcgctgtaat cgtcatgagt ctcgtgtaag 2280

cgatctagtt tagatagtcc atccataaat ctagaatttg catgatcgag ttctgtatat 2340

attttcaagc tttctggcat atgcgaatca taccaatttt ttaccttctg gaccagtttt 2400

actgtttctg aaccattctt aatatcgccc atccataaag ttaatcccga aggtaaatgg 2460

ttacttttaa tcgtaatatt ccagtcttct tcatcaacca aatgcgccag tttactgccg 2520

taagtagcac ttccaatatc tggcaaatta gagattaatg cgggtgggaa tcttctatat 2580

ctgatagatc catatgctgc cgccgctaca tcaaacccgc ttccaatttt accctgagct 2640

tgacaatgag caacttgtgc taaattatga ataacttctc tatatttgtc tacattattt 2700

tccaggtccg atacaaaaaa ggaggccaaa gctgtagtta aaactgtgac taaacctgcc 2760

gaggagccca gccctgtttt gggaacttct tcaattctgt gcgaatgaaa actcaatctt 2820

ctgttgccac gatgttcggt aacgctatcc tcctgagaat ggtaggcatc atcagagaaa 2880

atatcaataa cgaacaagtt tctattgcag tagtcgtcca tgttaggttt aaagtagcta 2940

aatacgttag cgataacttt ttcaatgaaa gggttcttag atccgcctat cgaaacagga 3000

atgaagccac ttttaggact tatatggtac agccactccc catctttaaa ttgtttactt 3060

ttcacacgca cttcaaactt atcagaccct tgcaatgaac cgtaaggatg ggctacagca 3120

tgcattcttg ccgataatcc gactacaaat gcttcatatt ttgtatctaa aactaaatat 3180

ccaccagcta gtaacgcttt ccctggggca ctgaaggctc tcaactctga catttgatct 3240

gcctcctatg aagtccatgg taaattcgtg tttcctggca ataatagatc gtcaatttgt 3300

tgctttgtgg tagttttatt ttcaaataat tggaatacta gggatttgat tttaggatct 3360

ttattcaaat tttttgcgct taacaaacag cagccagtcc cacccaagtc tgtttcaaat 3420

gtctcgtaac taaaatcatc ttgcaatttc tttttgaaac tgtcaatttg ctcttgagta 3480

atgtctcttc gtaacaaagt caaagagcaa ccgccgccac cagcaccggt aagttttgtg 3540

gagccaattc tcaaatcatc gctcagattt ttaataagtt ctaatccagg atgagaaaca 3600

ccgattgaga caagcagtcc atgatttatt cttatcaatt ccaatagttg ttcatacagt 3660

tcattattag tttctacggc ctcgtcatcg gtgcctttac atttacttaa ctttgtcatg 3720

atctctaagc cttgtagggc acattcaccc atggcatcta gaattggctt cataacttca 3780

ggaaatttct cggtgaccaa cacacgaacg cgagcaacaa gatcttttgt agaccttgga 3840

attctagtat aggttaggat cattggaatg gctgggaaat catctaagaa cttaaaattg 3900

tttgtattta ttgttccatt atgtgagtct ttttcaaata gcagggcatt accataagtg 3960

gccacagcgt tatctattcc tgaaggggta ccgtgaatac acttttcacc tatgaaggcc 4020

cattgattca ctatatgctt atcgttttct gacagctttt ccaagtcatt agatcctatt 4080

aaccccccca agtaggccat agctaaggcc agtgatacag aaatagaggc gcttgagccc 4140

aacccagcac cgatgggtaa agtagacttt aaagaaaact taatattctt ggcatggggg 4200

cataggcaaa caaacatata caggaaacaa aacgctgcat ggtagtggaa ggattcggat 4260

agttgagcta acaacggatc caaaagacta acgagttcct gagacaagcc atcggtggct 4320

tgttgagcct tggccaattt ttgggagttt acttgatcct cggtgatggc attgaaatca 4380

ttgatggacc acttatgatt aaagctaatg tccgggaagt ccaattcaat agtatctggt 4440

gcagatgact cgcttattag caggtaggtt ctcaacgcag acacactagc agcgacggca 4500

ggcttgttgt acacagcaga gtgttcacca aaaataataa cctttcccgg tgcagaagtt 4560

aagaacggta atgacatggt taattcctcc tactgcagga attcgatatc aagcttatcg 4620

ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt gttcccc 4667

<210> 6

<211> 3521

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pFZ110序列（不含骨架载体序列）

<400> 6

catatgaccg tgtgtgcgaa aaaacatgtg catctgaccc gtgacgccgc cgaacaactg 60

ctggccgaca tcgaccgccg cctggatcaa ctgctgccgg ttgaaggcga acgtgatgtg 120

gttggtgcag caatgcgtga aggcgcgctg gcaccgggta aacgtattcg cccgatgctg 180

ctgctgctga ccgcgcgtga tctgggttgc gcagtcagtc acgatggtct gctggacctg 240

gcatgtgctg tcgaaatggt tcatgcggct agcctgatcc tggatgacat gccgtgcatg 300

gatgacgcaa aactgcgtcg cggtcgtccg accattcata gccactatgg tgaacacgtt 360

gcaatcctgg cagcagtcgc actgctgtct aaagcctttg gcgtgattgc agatgcagac 420

ggtctgacgc cgctggcaaa aaaccgtgct gtcagtgaac tgtccaatgc gatcggtatg 480

cagggtctgg tgcagggcca attcaaagac ctgagtgaag gtgacaaacc gcgctccgca 540

gaagctattc tgatgaccaa ccactttaaa acctctacgc tgttctgcgc atctatgcag 600

atggcttcta tcgttgcgaa tgccagctct gaagcccgtg attgtctgca tcgctttagc 660

ctggatctgg gccaggcatt ccaactgctg gatgacctga ccgatggcat gaccgacacg 720

ggtaaagatt caaaccagga cgcgggcaaa tcgacgctgg tgaatctgct gggtccgcgt 780

gcagttgaag aacgtctgcg ccagcatctg caactggctt cagaacacct gtcggcagct 840

tgtcaacatg gtcacgcaac gcagcacttc atccaagcct ggttcgataa aaaactggca 900

gcggtgtcgt aactagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatgggcag 960

cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc atatgaataa 1020

tccgtccctg ctgaatcacg ctgttgaaac gatggctgtc ggctctaaat catttgctac 1080

cgcttctaaa ctgttcgacg caaaaacccg tcgctccgtt ctgatgctgt atgcgtggtg 1140

ccgtcattgt gatgacgtca ttgatgacca gacgctgggt tttcaggcac gtcaaccggc 1200

actgcagacc ccggaacaac gtctgatgca gctggaaatg aaaacgcgcc aagcatacgc 1260

tggtagccag atgcacgaac cggcctttgc ggccttccag gaagtcgcga tggcccatga 1320

tattgcaccg gcttatgcgt ttgaccacct ggaaggcttc gcgatggatg tgcgtgaagc 1380

acagtactct caactggatg acaccctgcg ctattgctac catgtggcgg gcgtggttgg 1440

tctgatgatg gcccagatca tgggcgttcg tgataacgca accctggatc gtgcgtgcga 1500

cctgggtctg gctttccagc tgacgaatat tgcacgtgat atcgtggatg acgcccatgc 1560

aggccgctgt tatctgccgg cgtcatggct ggaacacgaa ggtctgaaca aagaaaatta 1620

cgcagctccg gaaaaccgtc aagctctgtc gcgcatcgcg cgtcgcctgg ttcaggaagc 1680

cgaaccgtat tacctgagcg ctaccgcagg tctggcaggt ctgccgctgc gttctgcctg 1740

ggcaattgct acggcgaaac aagtctatcg caaaatcggc gtcaaagtgg aacaggctgg 1800

tcagcaagcg tgggatcagc gtcaaagtac cacgaccccg gaaaaactga ccctgctgct 1860

ggcggcctcc ggtcaggcgc tgacctcccg tatgcgtgct catccgccgc gtccggccca 1920

tctgtggcaa cgtccgctgt gactagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 1980

ccatgggcag cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc 2040

atatgaaacc gaccacggtg attggtgctg gctttggcgg cctggctctg gcgattcgtc 2100

tgcaagcggc tggcattccg gtgctgctgc tggaacagcg tgataaaccg ggcggtcgcg 2160

cctatgttta cgaagatcaa ggctttacct tcgacgctgg tccgaccgtc attacggacc 2220

cgagtgcgat cgaagaactg tttgcgctgg ccggcaaaca gctgaaagaa tatgttgaac 2280

tgctgccggt caccccgttt taccgtctgt gctgggaatc tggtaaagtg ttcaactatg 2340

ataatgacca gacgcgcctg gaagctcaaa ttcagcaatt caacccgcgt gatgttgaag 2400

gctatcgcca gtttctggac tacagtcgtg ccgtgttcaa agaaggctat ctgaaactgg 2460

gtaccgttcc gtttctgtcc ttccgtgata tgctgcgtgc agccccgcag ctggcaaaac 2520

tgcaagcctg gcgtagcgtg tattctaaag ttgctagcta catcgaagat gaacacctgc 2580

gccaggcgtt tagtttccat tccctgctgg ttggcggcaa tccgtttgcc accagctcta 2640

tttatacgct gatccatgca ctggaacgtg aatggggtgt ctggtttccg cgcggcggta 2700

ccggcgcgct ggtgcagggt atgattaaac tgttccagga tctgggcggc gaagtggttc 2760

tgaacgcccg cgttagccac atggaaacca cgggcaataa aatcgaagca gtccatctgg 2820

aagatggtcg tcgctttctg acccaggcag tggcttctaa cgcagatgtc gtgcacacgt 2880

atcgtgacct gctgagccag catccggcag ctgtgaaaca gtctaacaaa ctgcaaacca 2940

aacgcatgtc aaattcgctg tttgttctgt acttcggcct gaaccatcac catgatcagc 3000

tggcgcacca tacggtctgt tttggcccgc gttatcgcga actgattgac gaaatcttta 3060

atcacgatgg tctggcggaa gacttctcac tgtacctgca cgcgccgtgc gtgaccgata 3120

gttccctggc accggaaggc tgtggttcgt attacgtcct ggcaccggtg ccgcacctgg 3180

gtaccgctaa cctggattgg acggtggaag gtccgaaact gcgtgaccgc atttttgcct 3240

atctggaaca gcactacatg ccgggcctgc gtagccaact ggttacccat cgcatgttca 3300

cgccgtttga tttccgtgac cagctgaatg catatcatgg ttcagctttt tcggttgaac 3360

cggtcctgac ccaatccgca tggttccgtc cgcacaaccg cgataaaacc attacgaatc 3420

tgtacctggt tggcgcgggt acgcatccgg gcgccggtat cccgggtgtg attggctcgg 3480

cgaaagcgac ggctggcctg atgctggaag acctgatttg a 3521

<210> 7

<211> 4170

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pFZ111序列（不含骨架载体序列）

<400> 7

catatgaccg tgtgtgcgaa aaaacatgtg catctgaccc gtgacgccgc cgaacaactg 60

ctggccgaca tcgaccgccg cctggatcaa ctgctgccgg ttgaaggcga acgtgatgtg 120

gttggtgcag caatgcgtga aggcgcgctg gcaccgggta aacgtattcg cccgatgctg 180

ctgctgctga ccgcgcgtga tctgggttgc gcagtcagtc acgatggtct gctggacctg 240

gcatgtgctg tcgaaatggt tcatgcggct agcctgatcc tggatgacat gccgtgcatg 300

gatgacgcaa aactgcgtcg cggtcgtccg accattcata gccactatgg tgaacacgtt 360

gcaatcctgg cagcagtcgc actgctgtct aaagcctttg gcgtgattgc agatgcagac 420

ggtctgacgc cgctggcaaa aaaccgtgct gtcagtgaac tgtccaatgc gatcggtatg 480

cagggtctgg tgcagggcca attcaaagac ctgagtgaag gtgacaaacc gcgctccgca 540

gaagctattc tgatgaccaa ccactttaaa acctctacgc tgttctgcgc atctatgcag 600

atggcttcta tcgttgcgaa tgccagctct gaagcccgtg attgtctgca tcgctttagc 660

ctggatctgg gccaggcatt ccaactgctg gatgacctga ccgatggcat gaccgacacg 720

ggtaaagatt caaaccagga cgcgggcaaa tcgacgctgg tgaatctgct gggtccgcgt 780

gcagttgaag aacgtctgcg ccagcatctg caactggctt cagaacacct gtcggcagct 840

tgtcaacatg gtcacgcaac gcagcacttc atccaagcct ggttcgataa aaaactggca 900

gcggtgtcgt aactagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatgggcag 960

cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc atatgaataa 1020

tccgtccctg ctgaatcacg ctgttgaaac gatggctgtc ggctctaaat catttgctac 1080

cgcttctaaa ctgttcgacg caaaaacccg tcgctccgtt ctgatgctgt atgcgtggtg 1140

ccgtcattgt gatgacgtca ttgatgacca gacgctgggt tttcaggcac gtcaaccggc 1200

actgcagacc ccggaacaac gtctgatgca gctggaaatg aaaacgcgcc aagcatacgc 1260

tggtagccag atgcacgaac cggcctttgc ggccttccag gaagtcgcga tggcccatga 1320

tattgcaccg gcttatgcgt ttgaccacct ggaaggcttc gcgatggatg tgcgtgaagc 1380

acagtactct caactggatg acaccctgcg ctattgctac catgtggcgg gcgtggttgg 1440

tctgatgatg gcccagatca tgggcgttcg tgataacgca accctggatc gtgcgtgcga 1500

cctgggtctg gctttccagc tgacgaatat tgcacgtgat atcgtggatg acgcccatgc 1560

aggccgctgt tatctgccgg cgtcatggct ggaacacgaa ggtctgaaca aagaaaatta 1620

cgcagctccg gaaaaccgtc aagctctgtc gcgcatcgcg cgtcgcctgg ttcaggaagc 1680

cgaaccgtat tacctgagcg ctaccgcagg tctggcaggt ctgccgctgc gttctgcctg 1740

ggcaattgct acggcgaaac aagtctatcg caaaatcggc gtcaaagtgg aacaggctgg 1800

tcagcaagcg tgggatcagc gtcaaagtac cacgaccccg gaaaaactga ccctgctgct 1860

ggcggcctcc ggtcaggcgc tgacctcccg tatgcgtgct catccgccgc gtccggccca 1920

tctgtggcaa cgtccgctgt gactagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 1980

ccatgggcag cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc 2040

atatgaaacc gaccacggtg attggtgctg gctttggcgg cctggctctg gcgattcgtc 2100

tgcaagcggc tggcattccg gtgctgctgc tggaacagcg tgataaaccg ggcggtcgcg 2160

cctatgttta cgaagatcaa ggctttacct tcgacgctgg tccgaccgtc attacggacc 2220

cgagtgcgat cgaagaactg tttgcgctgg ccggcaaaca gctgaaagaa tatgttgaac 2280

tgctgccggt caccccgttt taccgtctgt gctgggaatc tggtaaagtg ttcaactatg 2340

ataatgacca gacgcgcctg gaagctcaaa ttcagcaatt caacccgcgt gatgttgaag 2400

gctatcgcca gtttctggac tacagtcgtg ccgtgttcaa agaaggctat ctgaaactgg 2460

gtaccgttcc gtttctgtcc ttccgtgata tgctgcgtgc agccccgcag ctggcaaaac 2520

tgcaagcctg gcgtagcgtg tattctaaag ttgctagcta catcgaagat gaacacctgc 2580

gccaggcgtt tagtttccat tccctgctgg ttggcggcaa tccgtttgcc accagctcta 2640

tttatacgct gatccatgca ctggaacgtg aatggggtgt ctggtttccg cgcggcggta 2700

ccggcgcgct ggtgcagggt atgattaaac tgttccagga tctgggcggc gaagtggttc 2760

tgaacgcccg cgttagccac atggaaacca cgggcaataa aatcgaagca gtccatctgg 2820

aagatggtcg tcgctttctg acccaggcag tggcttctaa cgcagatgtc gtgcacacgt 2880

atcgtgacct gctgagccag catccggcag ctgtgaaaca gtctaacaaa ctgcaaacca 2940

aacgcatgtc aaattcgctg tttgttctgt acttcggcct gaaccatcac catgatcagc 3000

tggcgcacca tacggtctgt tttggcccgc gttatcgcga actgattgac gaaatcttta 3060

atcacgatgg tctggcggaa gacttctcac tgtacctgca cgcgccgtgc gtgaccgata 3120

gttccctggc accggaaggc tgtggttcgt attacgtcct ggcaccggtg ccgcacctgg 3180

gtaccgctaa cctggattgg acggtggaag gtccgaaact gcgtgaccgc atttttgcct 3240

atctggaaca gcactacatg ccgggcctgc gtagccaact ggttacccat cgcatgttca 3300

cgccgtttga tttccgtgac cagctgaatg catatcatgg ttcagctttt tcggttgaac 3360

cggtcctgac ccaatccgca tggttccgtc cgcacaaccg cgataaaacc attacgaatc 3420

tgtacctggt tggcgcgggt acgcatccgg gcgccggtat cccgggtgtg attggctcgg 3480

cgaaagcgac ggctggcctg atgctggaag acctgatttg actagaaata attttgttta 3540

actttaagaa ggagatatac catgggcagc agccatcatc atcatcatca cagcagcggc 3600

ctggtgccgc gcggcagcca tatgcaaacg gaacacgtca ttttattgaa tgcacaggga 3660

gttcccacgg gtacgctgga aaagtatgcc gcacacacgg cagacacccg cttacatctc 3720

gcgttctcca gttggctgtt taatgccaaa ggacaattat tagttacccg ccgcgcactg 3780

agcaaaaaag catggcctgg cgtgtggact aactcggttt gtgggcaccc acaactggga 3840

gaaagcaacg aagacgcagt gatccgccgt tgccgttatg agcttggcgt ggaaattacg 3900

cctcctgaat ctatctatcc tgactttcgc taccgcgcca ccgatccgag tggcattgtg 3960

gaaaatgaag tgtgtccggt atttgccgca cgcaccacta gtgcgttaca gatcaatgat 4020

gatgaagtga tggattatca atggtgtgat ttagcagatg tattacacgg tattgatgcc 4080

acgccgtggg cgttcagtcc gtggatggtg atgcaggcga caaatcgcga agccagaaaa 4140

cgattatctg catttaccca gcttaaataa 4170

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P15A-f

<400> 8

gcattgccgc cgtgggtttc tcgagcgggg cggagatttc ctggaagatg 50

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P15A-r

<400> 9

ggggccactt tttgccggag ctcgagaaat attttatctg attaataaga tg 52

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBBR1MCS1-p15A-f

<400> 10

catcttatta atcagataaa atatttctcg agctccggca aaaagtggcc cc 52

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBBR1MCS1-p15A-r

<400> 11

catcttccag gaaatctccg ccccgctcga gaaacccacg gcggcaatgc 50

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBBR1MCS1-f

<400> 12

tttgaaagat gggtccgtca cctgcattaa atcctaagga tccactagtt ctaga 55

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBBR1MCS1-r

<400> 13

ttttatattc ctcctagtcg actctagagg atccccgggc tgcaggaatt cgatatcaa 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> atoB-f

<400> 14

cccggggatc ctctagagtc gactaggagg aatataaaat gaaaaattgt gtcatcgtc 59

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> atoB-r

<400> 15

gttgagagtt tcatttagct gtcctcctta attcaaccgt tcaatcacc 49

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ERG13-f

<400> 16

acggttgaat taaggaggac agctaaatga aactctcaac taaact 46

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ERG13-r

<400> 17

tggctgctgc ccatagtgta atcctcctta ttttttaaca tcgtaagat 49

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> tHMG1-f

<400> 18

atgttaaaaa ataaggagga ttacactatg ggcagcagcc atcatca 47

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> tHMG1-r

<400> 19

ttaggattta atgcaggtga cgg 23

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBBR1MCS2-f

<400> 20

cagaaaacga ttatctgcat ttacccagct taaataagag ctccaattcg ccctatagt 59

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBBR1MCS2-r

<400> 21

ttaagaacgg taatgacatg gttaattcct cctactgcag gaattcgata tcaag 55

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ERG12-f

<400> 22

ctgcagtagg aggaattaac catgtcatta ccgttcttaa ct 42

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ERG12-r

<400> 23

ctcaactctg acatttgatc tgcctcctat gaagtccatg gtaa 44

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ERG8-f

<400> 24

ttaccatgga cttcatagga ggcagatcaa atgtcagagt tgagagcctt c 51

<210> 25

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ERG8-r

<400> 25

gatgctgtgt aaacggtcat gagtattacc tcctatttat caagataagt ttc 53

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MVD1-f

<400> 26

atcttgataa ataggaggta atactcatga ccgtttacac agcatccgtt 50

<210> 27

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MVD1-r

<400> 27

tgcccatata gtaatcctcc tcccgggctg cagttattcc tttggtagac cagtc 55

<210> 28

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Idi-f

<400> 28

ggaataactg cagcccggga ggaggattac tatatgggca gcagccatca t 51

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Idi-r

<400> 29

ttatttaagc tgggtaaatg caga 24

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Idi-NdeI

<400> 30

atatcatatg caaacggaac acgtc 25

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Idi-XhoI

<400> 31

tatactcgag ttatttaagc tgggtaaatg 30

Claims

1.一种生产番茄红素的大肠杆菌菌株，其特征在于含有甲羟戊酸途径和经过密码子优化的番茄红素合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括atoB、erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1和idi基因；所述的番茄红素合成的相关基因为经密码子优化的crtE、crtB和crtI基因，其序列如SEQ ID NO.1-3所示；各蛋白表达比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi＝10∶15∶2∶1∶1∶20∶4或55∶2∶30∶2∶1∶2∶600。

2.根据权利要求1所述的生产番茄红素的大肠杆菌菌株，其特征在于：生产番茄红素的大肠杆菌菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ110的大肠杆菌或含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ111的大肠杆菌；

所述的质粒pMH1以pBBR1MCS为骨架载体、复制子为p15A、启动子为lac启动子、包含atoB、erg13和thmg1基因；

所述的质粒pFZ81以pBBR1MCS-2为骨架载体、复制子为pBBR1MCS复制子、启动子为lac启动子、包含erg12、erg8、mvd1和idi基因；

所述的质粒pFZ110以pET28a(+)为骨架载体、复制子为pBBR322高拷贝复制子、启动子为T7强启动子、包含crtE、crtB和crtI基因；

所述的质粒pFZ111以pET28a(+)为骨架载体、复制子为pBBR322高拷贝复制子、启动子为T7强启动子、包含crtE、crtB、crtI和idi基因。

3.权利要求1或2所述的菌株在生产番茄红素中的应用。

4.利用权利要求1或2所述的菌株生产番茄红素的方法，其特征在于包含如下步骤：将权利要求1或2所述的菌株种子液接入含碳源的培养基中进行原核表达得到番茄红素。

5.根据权利要求4所述的生产番茄红素的方法，其特征在于：所述的碳源为甘油、单糖或多糖；所述的培养基为2×TY培养基或M9培养基；所述的原核表达加入IPTG诱导的时间为菌液的OD₆₀₀为20～40时。

6.根据权利要求4所述的生产番茄红素的方法，其特征在于：在发酵罐中用M9培养基进行原核表达时，加入IPTG诱导的时间为菌液的OD₆₀₀为40时。