CN112646764B - 一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产生番茄红素的重组乳酸乳球菌菌株及其构建方法和应用。所述的重组菌株是通过消除番茄红素合成前体物的2条竞争途径：乳酸脱氢酶基因和α‑乙酰乳酸合成酶基因的部分核苷酸序列；再使用质粒引入菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因(crtE)、八氢番茄红素合成酶基因(crtB)和八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)构建得到。实验证实本发明的重组乳酸乳球菌经过摇动培养后能够产生番茄红素，也预示该重组乳酸乳球菌在保健品和生物药物开发领域具有广阔的应用潜力。

Description

一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其构建方法和应用。
背景技术
几个世纪以来，乳酸乳球菌一直应用于奶酪、酸奶、酸菜等食品的发酵，是美国食品药品监督管理局认定的安全级微生物。乳酸乳球菌也有一些益生特性，如具有免疫调节特性、通过胃肠道(GIT)存活性，但又不在肠道内定植等，这些特性使乳酸乳球菌成为生物治疗药物的优选传递体。2000年，Science杂志报道了使用重组乳酸乳球菌分泌白介素10以治疗小鼠的结肠炎，随后20年内，以乳酸乳球菌做载体用于近60种治疗药物的传递，所针对的病症涵盖肠炎、流感、糖尿病、感染、乃至癌症。当下随着生物技术的迅猛发展，通过理性设计对乳酸乳球菌进行遗传改造，获得功能强化的菌株，实现对疾病的诊断或治疗，符合精准医疗的发展趋势。
番茄红素是异戊二烯类化合物，属于类胡萝卜素，分子式是C40H56，分子量为536.89，由8个异戊二烯单元构成的包括11个共轭双键和2个非共轭双键的脂溶性碳氢化合物。由于番茄红素中存在多个共轭双键而具有极强的抗氧化能力，是自然界最强的抗氧化剂之一，具有抗辐射、防癌抗癌、防治心血管疾病等多种生理功能。因此番茄红素被广泛应用于药品、保健食品中。中国居民膳食营养素参考摄入量(2013版)建议番茄红素应为18-70mg/天。
由于哺乳动物体内无法合成番茄红素，机体所需的番茄红素必须从外源摄取。目前番茄红素制备方式有植物提取、化学合成和微生物发酵。植物提取法获得的番茄红素无污染，但成本过高。化学合成法原料价格低廉、反应速率快、产量高，成本较低，但是终产物难以控制、与天然番茄红素结构差别大、生物活性低，且有化学试剂残留，因此使用范围受到限制。发酵法生产是利用微生物转化葡萄糖等价格低廉的碳源产生番茄红素，再从菌体中提取出来。微生物发酵法具有生产周期短、不受气候、地理位置因素影响，且发酵过程易控制，产品安全性高等优点。很多光合细菌和部分革兰氏阴性非光合细菌均能合成番茄红素，例如固氮红细菌、噬夏孢欧文氏菌和草生欧文氏菌等，但是由于产物含量较低，只用作类胡萝卜素合成机理研究模型。近年代谢工程与合成生物学的发展快速推动了微生物细胞工厂的应用，以大肠杆菌、酵母菌和三孢布拉氏霉菌等作为细胞工厂实现了番茄红素高产量合成。
乳酸乳球菌是食品安全技术微生物，是生物治疗药物传递的优选宿主，同时在乳酸乳球菌细胞合成番茄红素可以强化菌株的抗氧化能力，且重组乳酸菌具有抗癌防癌等生理功能，产物合成后无需提取可直接以活菌药物的形式服用，在产品的使用方式或活性保存方面优势巨大。经检索，通过遗传改造乳球乳球菌消除其番茄红素合成前体物的2条竞争途径：乳酸脱氢酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因的部分核苷酸序列；再使用质粒引入菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因(crtE)、八氢番茄红素合成酶基因(crtB)和八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)构建能够产生番茄红素的工程菌株重组乳酸乳球菌及其应用还未见报道。
发明内容
针对现有乳酸乳球菌无法合成番茄红素的不足，本发明提供了一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，同时提供了重组菌株的构建方法和应用。
本发明所述的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，是通过在乳酸乳球菌中消除其番茄红素合成前体物的两条竞争途径：乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径；再对该菌株中引入外源表达元件后构建获得；
其特征在于：
所述乳酸乳球菌选乳酸乳球菌NZ9000；所述消除乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径是通过在乳酸乳球菌NZ9000基因组中敲除ldh、als基因的部分核苷酸序列实现，其中所述敲除的ldh基因核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，敲除的als基因核苷酸序列如SEQID No:2所示；该敲除的基因片段仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，例如敲除ldh基因的其他部分或全部、als基因的其他部分或全部，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。所述外源表达元件是菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI，该crtE、crtB和crtI的核苷酸序列以crtEBI表示，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；获得的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌基因型是NZ9000ΔldhΔals/pSEC:crtEBI。
上述产生番茄红素的重组乳酸乳球菌中：所述的crtE、crtB和crtI基因由质粒pSEC:crtEBI携带；该pSEC:crtEBI质粒包含来自于菠萝泛菌的crtE、crtB和crtI基因、PnisA启动子、氯霉素抗性标记、复制起始蛋白RepA和RepC，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
本发明所述产生番茄红素的重组乳酸乳球菌在发酵制备番茄红素中的应用。
上述的应用中，发酵制备番茄红素的方法及条件是：将重组菌株种子按照体积比2％的比例转接至发酵培养基中以如下条件发酵：30℃、100rpm～150rpm摇动培养至OD600＝0.4，加入终浓度为10ng/mL的nisin(乳酸链球菌肽、尼生素)，继续摇动培养12±2h，即产生含番茄红素的发酵产物；其中，所述的发酵培养基配方是：10g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ-磷酸甘油二钠、0.005g/L氯霉素。
实验检测证实：上述使用100rpm摇动培养，番茄红素的产量是0.80±0.03mg/L。上述使用150rpm摇动培养，番茄红素的产量是0.86±0.04mg/L。
本发明提供了一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其在发酵制备番茄红素中的应用，在乳酸乳球菌细胞合成番茄红素可以强化菌株的抗氧化能力，且重组乳酸菌具有抗癌防癌等生理功能，产物合成后无需提取可直接以活菌药物的形式服用，在产品的使用方式或活性保存方面优势巨大，预示着该重组乳酸乳球菌以其具有的强抗氧化能力在保健品和生物药物开发领域应用前景广阔。
附图说明
图1：番茄红素标准品的液相色谱检测图。
图2：重组乳酸乳球菌产生番茄红素的液相色谱检测图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中，乳酸乳球菌NZ9000购自Novagen公司；载体pSEC:crtEBI由青岛睿博兴科生物技术有限公司合成。载体pSEC:crtEBI构建所依据的骨架pSEC质粒的来源及构建方法参考文献：Loir YL,Nouaille S,Commissaire J,Brétigny L,Gruss A,Langella P.2001.Applied andEnvironmental Microbiology 67:4119-4127。
实施例1：消除乳酸乳球菌中番茄红素合成前体物的竞争支路
利用CRISPR/Cas9结合单链DNA重组工程，对乳酸乳球菌NZ9000中番茄红素合成前体物的竞争支路乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径进行消除。以上竞争支路消除的方法是在乳酸乳球菌NZ9000的染色体上敲除ldh基因的部分核苷酸序列和als基因的部分核苷酸序列。
上述利用CRISPR/Cas9结合单链DNA重组工程进行乳酸乳球菌染色体片段敲除的相关方法已在论文Microb Cell Fact(2019)18:22中公开。
(1)敲除ldh基因的部分核苷酸序列
敲除ldh基因的部分核苷酸序列的具体方法：
①构建打靶质粒；②同源重组及CRISPR/Cas9打靶筛选；③敲除突变株的验证；④同源重组质粒消除。
上述构建打靶质粒方法是：
将引物ldh-spacerF(5’-AAACCATACGCTTTTGCCCTTGTTAACCAG-3’)和ldh-spacerR(5’-AAAACTGGTTAACAAGGGCAAAAGCGTATG-3’)进行体外磷酸化和退火，产物插入到BsaI限制性内切酶处理的pTHCas9质粒中，获得打靶质粒pTHCas9ldh。
体外退火反应体系为：5μL 10μM ldh-spacerF、5μL 10μM ldh-spacerR、2.5μL 10×T4 DNA ligase buffer(NEB)、0.5μL T4多聚核苷酸激酶、12μL ddH2O。反应条件为：37℃30min，95℃5min，自然降温至25℃。
上述同源重组及CRISPR/Cas9打靶筛选方法是：
在GM17培养基(含5μg/mL氯霉素)中过夜活化重组乳酸乳球菌NZ9000/pL-RecT，以2％比例转接于SolI(含5μg/mL氯霉素)中在30℃静置培养至OD600＝0.2，加入终浓度为10ng/μL的nisin后继续培养至OD600＝0.4。在4℃6000rpm离心10min收集菌体细胞，使用SolII洗涤菌体细胞两次后，将菌体细胞重悬于原培养体积1/50的SolII中，制得感受态细胞。向感受态细胞中加入100ng的打靶质粒pTHCas9ldh和100μg的单链DNA ldho(5’-TCCCCTTGAGTTTTTTCTTTAAAAAGGTCAACAATACCTAGATTTTCTTTAATTCCTTTCAAATTATAAACGAGTATTTT-3’)，吹吸混匀后一起转移至预冷的电转杯中。
设置电转仪的电转化参数为：电压2000V，电容20μF，电阻200Ω。将电转杯放入电转仪中，电击。
吸出电转杯中的细胞并加入1mL SGM17，在30℃复苏培养2h后，涂布含有10μg/mL红霉素的GM17平板，30℃培养48h，平板上长出来的菌落用于敲除突变株的验证。
其中，上述GM17培养基配方为：5g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏。2.5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ-磷酸甘油二钠。
上述SolI配方为：GM17培养基中添加10g/L甘氨酸和170g/L蔗糖。
上述SolII配方为：170g/L蔗糖、10％甘油。
上述SGM17配方为:GM17培养基中添加76.3g/L蔗糖、4g/L氯化镁、22g/L氯化钙。
上述敲除突变株的验证方法是：
选择GM17平板(含10μg/mL红霉素)上生长的菌落接种于GM17液体培养基中(含10μg/mL红霉素)，30℃过夜培养。收集菌体细胞，提取染色体。
以染色体为模板，使用引物ldhF(5’-GATCTTAAAACAATACAGCCTGCC-3’)和ldhR(5’-GGTCAGCGTCGCTTGCAT-3’)通过PCR扩增目的片段为230bp则为敲除突变株，如果为330bp则为野生菌菌株。
上述PCR扩增反应体系：0.8μL的ldhF、0.8μL的ldhR，1.6μL dNTP，2μL 10×Buffer，0.2μL染色体DNA，0.2μL Taq酶，14.4μL ddH2O。反应程序：94℃30min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；16℃保温。
上述同源重组质粒消除方法是：
将获得的敲除突变株在GM17培养基中连续传代培养20代后，将培养液在GM17平板上划线，挑取菌落分别点种在GM17平板、含有10μg/mL红霉素的GM17平板上和含有5μg/mL氯霉素的GM17平板上。选取在GM17平板上生长，而在含有10μg/mL红霉素的GM17平板上和含有5μg/mL氯霉素的GM17平板上不生长的菌落即为质粒被消除。至此步骤获得敲除ldh基因的部分核苷酸序列的突变菌株乳酸乳球菌NZ9000Δldh。其中所述的敲除ldh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
(2)敲除als基因的部分核苷酸序列
敲除als基因的部分核苷酸序列的具体方法：
(1)构建打靶质粒；(2)同源重组及CRISPR/Cas9打靶筛选；(3)敲除突变株的验证；(4)同源重组质粒消除。
上述构建打靶质粒方法是：
将引物als-spacerF(5’-AAACTAACCATAAAGTGAAGTATGTATTTG-3’)和als-spacerR(5’-AAAACAAATACATACTTCACTTTATGGTTA-3’)进行体外磷酸化和退火，产物插入到BsaI限制性内切酶处理的pTHCas9质粒中，获得打靶质粒pTHCas9als。
其中体外退火反应体系为：5μL 10μM als-spacerF、5μL 10μM als-spacerR、2.5μL 10×T4 DNA ligase buffer(NEB)、0.5μL T4多聚核苷酸激酶、12μL ddH2O。反应条件为：37℃30min，95℃5min，自然降温至25℃。
上述同源重组及CRISPR/Cas9打靶筛选方法是：
在GM17培养基(含5μg/mL氯霉素)中过夜活化重组乳酸乳球菌NZ9000Δldh/pL-RecT，以2％比例转接于SolI(含5μg/mL氯霉素)中在30℃静置培养至OD600＝0.2，加入终浓度为10ng/μL的nisin后继续培养至OD600＝0.4。在4℃6000rpm离心10min收集菌体细胞，使用SolII洗涤菌体细胞两次后，将菌体细胞重悬于原培养体积1/50的SolII中，制得感受态细胞。向感受态细胞中加入100ng的打靶质粒pTHCas9als和100μg的单链DNA also(5’-ACCATTTGAGGGCCTTCTTCATTTTCTAATAAATCAAAAATTTTTATTTTACCTCTATTTGTTCTAATTCATATTTCATA-3’)，吹吸混匀后一起转移至预冷的电转杯中。
设置电转仪的电转化参数为：电压2000V，电容20μF，电阻200Ω。将电转杯放入电转仪中，电击。
吸出电转杯中的细胞并加入1mL SGM17，在30℃复苏培养2h后，涂布含有10μg/mL红霉素的GM17平板，30℃培养48h，平板上长出来的菌落用于敲除突变株的验证。
其中，上述GM17培养基配方为：5g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏。2.5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ-磷酸甘油二钠。
上述SolI配方为：GM17培养基中添加10g/L甘氨酸和170g/L蔗糖。
上述SolII配方为：170g/L蔗糖、10％甘油。
上述SGM17配方为:GM17培养基中添加76.3g/L蔗糖、4g/L氯化镁、22g/L氯化钙。
上述敲除突变株的验证方法是：
选择GM17平板(含10μg/mL红霉素)上生长的菌落接种于GM17液体培养基中(含10μg/mL红霉素)，30℃过夜培养。收集菌体细胞，提取染色体。
以染色体为模板，使用引物alsF(5’-CAAAATAATTGTAAAAGGGTC-3’)和alsR(5’-AGTGGAGTTGCAAGGTTTGA-3’)利用PCR扩增目的片段为260bp则为敲除突变株，如果为360bp则为野生菌菌株。
上述PCR扩增反应体系：0.8μL的alsF、0.8μL的alsR，1.6μL dNTP，2μL 10×Buffer，0.2μL染色体DNA，0.2μL Taq酶，14.4μL ddH2O。反应程序：94℃30min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；16℃保温。
上述同源重组质粒消除方法是：
将获得的敲除突变株在GM17培养基中连续传代培养20代后，将培养液在GM17平板上划线，挑取菌落分别点种在GM17平板、含有10μg/mL红霉素的GM17平板上和含有5μg/mL氯霉素的GM17平板上。选取在GM17平板上生长，而在含有10μg/mL红霉素的GM17平板上和含有5μg/mL氯霉素的GM17平板上不生长的菌落即为质粒被消除。至此步骤获得敲除ldh基因的部分核苷酸序列和als基因的部分核苷酸序列的突变菌株乳酸乳球菌NZ9000ΔldhΔals。其中所述敲除的als基因核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
实施例2：番茄红素基因表达重组质粒的合成
本发明所述的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，是通过在乳酸乳球菌中消除其番茄红素合成前体物的两条竞争途径：乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径；再对该菌株中引入外源表达元件后构建获得；其中所述消除乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径是通过在乳酸乳球菌NZ9000基因组中敲除ldh、als基因的部分核苷酸序列实现；所述外源表达元件是菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI，该crtE、crtB和crtI的核苷酸序列以crtEBI表示，共3372个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。其中所述的crtE、crtB和crtI基因由质粒pSEC:crtEBI携带；在乳球菌NZ9000中的重组质粒pSEC:crtEBI包含来自于菠萝泛菌的crtE、crtB和crtI基因、PnisA启动子、氯霉素抗性标记、复制起始蛋白RepA和RepC，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。该重组质粒pSEC:crtEBI共6582个碱基，交由青岛睿博兴科生物技术有限公司进行基因合成。
实施例3：本发明所述产生番茄红素的乳酸乳球菌的构建
将重组质粒pSEC:crtEBI电转化进入乳酸乳球菌NZ9000ΔldhΔals，获得重组的番茄红素产生菌株NZ9000ΔldhΔals/pSEC:crtEBI。
上述电转化方法是：
①在GM17培养基中过夜活化乳酸乳球菌NZ9000ΔldhΔals，以2％比例转接于SolI中在30℃静置培养至OD600＝0.4。在4℃6000rpm离心10min收集菌体细胞，使用SolII洗涤菌体细胞两次后，将菌体细胞重悬于原培养体积1/50的SolII中，制得感受态细胞；
②向感受态细胞中加入50ng的pSEC:crtEBI，吹吸混匀后一起转移至预冷的电转杯中。
③设置电转仪的电转化参数为：电压2000V，电容20μF，电阻200Ω。将电转杯放入电转仪中，电击。
④吸出电转杯中的细胞并加入1mL SGM17，在30℃复苏培养2h后，涂布含有5μg/mL氯霉素的GM17平板，30℃培养48h，平板上长出来的菌落重组菌株验证。
⑤挑取菌落接种于含有5μg/mL氯霉素的GM17培养基中，收集菌体并提取质粒pSEC:crtEBI，经过PstI/XhoI酶切验证，获得验证正确的重组菌株即为生番茄红素的重组乳酸乳球菌，命名为重组菌株NZ9000ΔldhΔals/pSEC:crtEBI。
其中，上述GM17培养基配方为：5g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏、2.5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ-磷酸甘油二钠。
上述SolI配方为：GM17培养基中添加10g/L甘氨酸和170g/L蔗糖。
上述SolII配方为：170g/L蔗糖、10％甘油。
上述SGM17配方为:GM17培养基中添加76.3g/L蔗糖、4g/L氯化镁、22g/L氯化钙。
实施例4本发明所述产生番茄红素的重组乳酸乳球菌在发酵制备番茄红素中的应用
将实施例3中的重组菌株NZ9000ΔldhΔals/pSEC:crtEBI接种于5mL种子培养基中，30℃静置培养12h。
再将重组菌株种子按照2％的比例转接至25mL发酵培养基中以如下条件发酵：30℃、100rpm～150rpm摇动培养至OD600＝0.4，加入终浓度为10ng/mL nisin，继续摇动培养12h，即可产生含番茄红素的发酵产物。
上述使用100rpm摇动培养，番茄红素的产量是0.80±0.03mg/L。
上述使用150rpm摇动培养，番茄红素的产量是0.86±0.04mg/L。
所述的种子培养基配方是：5g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏、2.5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ-磷酸甘油二钠、0.005g/L氯霉素。
所述的发酵培养基配方是：10g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ-磷酸甘油二钠、0.005g/L氯霉素。
实施例5含番茄红素的发酵产物的检测方法
将实施例4中的发酵液经过6000rpm离心5min收集菌体，用无菌水清洗菌体细胞两次，向菌体沉淀中加入0.2g玻璃珠和含1％BHT(二叔丁基对甲酚)的丙酮，重选菌体细胞后用生物样品均质器震荡破碎，在室温放置30min萃取；12000rpm离心10min取上清，使用0.22μm滤器过滤，滤液使用HPLC检测。
HPLC检测方法：采用Waters C18柱(4.6*150mm，5μm)；柱温30℃；流动相：甲醇：乙腈：二氯甲烷＝21:21:8(体积比)；流速：1mL/min，进样量：20μL；进样时间：20min；DAD灯检测；检测波长为474nm。
番茄红素的产量是0.80～0.86±0.03～0.04mg/L。
序列表
<110> 山东大学
<120>一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其应用
<141> 2020-12-16
<160>4
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<221> 乳酸乳球菌NZ9000的乳酸脱氢酶基因（ldh基因）部分核苷酸序列
<222>（1）…（100）
<400>1
atggctgata aacaacgtaa gaaagttatc cttgttggtg acggtgctgt aggttcatca 60
tacgcttttg cccttgttaa ccaaggaatt gcacaagaat 100
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<221> 乳酸乳球菌NZ9000的α-乙酰乳酸合成酶基因（als基因）部分核苷酸序列
<222>（1）…（100）
<400> 2
atgtctgaga aacaatttgg ggcgaacttg gttgtcgata gtttgattaa ccataaagtg 60
aagtatgtat ttgggattcc aggagcaaaa attgaccggg 100
<210> 3
<211> 3372
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> crtEBI的核苷酸序列
<222>（1）…（3372）
<400> 3
atgacggtct gcgcaaaaaa acacgttcat ctcactcgcg atgctgcgga gcagttactg 60
gctgatattg atcgacgcct tgatcagtta ttgcccgtgg agggagaacg ggatgttgtg 120
ggtgccgcga tgcgtgaagg tgcgctggca ccgggaaaac gtattcgccc catgttgctg 180
ttgctgaccg cccgcgatct gggttgcgct gtcagccatg acggattact ggatttggcc 240
tgtgcggtgg aaatggtcca cgcggcttcg ctgatccttg acgatatgcc ctgcatggac 300
gatgcgaagc tgcggcgcgg acgccctacc attcattctc attacggaga gcatgtggca 360
atactggcgg cggttgcctt gctgagtaaa gcctttggcg taattgccga tgcagatggc 420
ctcacgccgc tggcaaaaaa tcgggcggtt tctgaactgt caaacgccat cggcatgcaa 480
ggattggttc agggtcagtt caaggatctg tctgaagggg ataagccgcg cagcgctgaa 540
gctattttga tgacgaatca ctttaaaacc agcacgctgt tttgtgcctc catgcagatg 600
gcctcgattg ttgcgaatgc ctccagcgaa gcgcgtgatt gcctgcatcg tttttcactt 660
gatcttggtc aggcatttca actgctggac gatttgaccg atggcatgac cgacaccggt 720
aaggatagca atcaggacgc cggtaaatcg acgctggtca atctgttagg cccgagggcg 780
gttgaagaac gtctgagaca acatcttcag cttgccagtg agcatctctc tgcggcctgc 840
caacacgggc acgccactca acattttatt caggcctggt ttgacaaaaa actcgctgcc 900
gtcagttaat aatactagag ctcaaggagg tactagatga ataatccgtc gttactcaat 960
catgcggtcg aaacgatggc agttggctcg aaaagttttg cgacagcctc aaagttattt 1020
gatgcaaaaa cccggcgcag cgtactgatg ctctacgcct ggtgccgcca ttgtgacgat 1080
gttattgacg atcagacgct gggctttcag gcccggcagc ctgccttaca aacgcccgaa 1140
caacgtctga tgcaacttga gatgaaaacg cgccaggcct atgcaggatc gcagatgcac 1200
gaaccggcgt ttgcggcttt tcaggaagtg gctatggctc atgatatcgc cccggcttac 1260
gcgtttgatc atctggaagg cttcgccatg gatgtacgcg aagcgcaata cagccaactg 1320
gatgatacgc tgcgctattg ctatcacgtt gcaggcgttg tcggcttgat gatggcgcaa 1380
atcatgggcg tgcgggataa cgccacgctg gaccgcgcct gtgaccttgg gctggcattt 1440
cagttgacca atattgctcg cgatattgtg gacgatgcgc atgcgggccg ctgttatctg 1500
ccggcaagct ggctggagca tgaaggtctg aacaaagaga attatgcggc acctgaaaac 1560
cgtcaggcgc tgagccgtat cgcccgtcgt ttggtgcagg aagcagaacc ttactatttg 1620
tctgccacag ccggcctggc agggttgccc ctgcgttccg cctgggcaat cgctacggcg 1680
aagcaggttt accggaaaat aggtgtcaaa gttgaacagg ccggtcagca agcctgggat 1740
cagcggcagt caacgaccac gcccgaaaaa ttaacgctgc tgctggccgc ctctggtcag 1800
gcccttactt cccggatgcg ggctcatcct ccccgccctg cgcatctctg gcagcgcccg 1860
ctctaataat actagagctc aaggaggtac tagatgaaac caactacggt aattggtgca 1920
ggcttcggtg gcctggcact ggcaattcgt ctacaagctg cggggatccc cgtcttactg 1980
cttgaacaac gtgataaacc cggcggtcgg gcttatgtct acgaggatca ggggtttacc 2040
tttgatgcag gcccgacggt tatcaccgat cccagtgcca ttgaagaact gtttgcactg 2100
gcaggaaaac agttaaaaga gtatgtcgaa ctgctgccgg ttacgccgtt ttaccgcctg 2160
tgttgggagt cagggaaggt ctttaattac gataacgatc aaacccggct cgaagcgcag 2220
attcagcagt ttaatccccg cgatgtcgaa ggttatcgtc agtttctgga ctattcacgc 2280
gcggtgttta aagaaggcta tctaaagctc ggtactgtcc cttttttatc gttcagagac 2340
atgcttcgcg ccgcacctca actggcgaaa ctgcaagcat ggagaagcgt ttacagtaag 2400
gttgccagtt acatcgaaga tgaacatctg cgccaggcgt tttctttcca ctcgctgttg 2460
gtgggcggca atcccttcgc cacctcatcc atttatacgt tgatacacgc gctggagcgt 2520
gagtggggcg tctggtttcc gcgtggcggc accggcgcat tagttcaggg gatgataaag 2580
ctgtttcagg atctgggtgg cgaagtcgtg ttaaacgcca gagtcagcca tatggaaacg 2640
acaggaaaca agattgaagc cgtgcattta gaggacggtc gcaggttcct gacgcaagcc 2700
gtcgcgtcaa atgcagatgt ggttcatacc tatcgcgacc tgttaagcca gcaccctgcc 2760
gcggttaagc agtccaacaa actgcaaact aagcgcatga gtaactctct gtttgtgctc 2820
tattttggtt tgaatcacca tcatgatcag ctcgcgcatc acacggtttg tttcggcccg 2880
cgttaccgcg agctgattga cgaaattttt aatcatgatg gcctcgcaga ggacttctca 2940
ctttatctgc acgcgccctg tgtcacggat tcgtcactgg cgcctgaagg ttgcggcagt 3000
tactatgtgt tggcgccggt gccgcattta ggcaccgcga acctcgactg gacggttgag 3060
gggccaaaac tacgcgaccg tatttttgcg taccttgagc agcattacat gcctggctta 3120
cggagtcagc tggtcacgca ccggatgttt acgccgtttg attttcgcga ccagcttaat 3180
gcctatcatg gctcagcctt ttctgtggag cccgttctta cccagagcgc ctggtttcgg 3240
ccgcataacc gcgataaaac cattactaat ctctacctgg tcggcgcagg cacgcatccc 3300
ggcgcaggca ttcctggcgt catcggctcg gcaaaagcga cagcaggttt gatgctggag 3360
gatctgatat aa 3372
<210> 4
<211> 6582
<212> DNA
<213> 人工序列
<221>表达载体pSEC:crtEBI的核苷酸序列
<222>（1）…（6582）
<400> 4
tgcatatttt cggcaatctt ctcaatgaga tgctcttcag catgttcaat gatgtcgatt 60
ttttattaaa acgtctcaaa atcgtttctg agacgtttta gcgtttattt cgtttagtta 120
tcggcataat cgttaaaaca ggcgttatcg tagcgtaaaa gcccttgagc gtagcgtgct 180
ttgcagcgaa gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc 240
gcagcgtcct tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tttgagggaa tgaaattccc 300
tcatgggttt gattttaaaa attgcttgca attttgccga gcggtagcgc tggaaaattt 360
ttgaaaaaaa tttggaattt ggaaaaaaat ggggggaaag gaagcgaatt ttgcttccgt 420
actacgaccc cccattaagt gccgagtgcc aatttttgtg ccaaaaacgc tctatcccaa 480
ctggctcaag ggtttgaggg gtttttcaat cgccaacgaa tcgccaacgt tttcgccaac 540
gttttttata aatctatatt taagtagctt tattgttgtt tttatgatta caaagtgata 600
cactaatttt ataaaattat ttgattggag ttttttaaat ggtgatttca gaatcgaaaa 660
aaagagttat gatttctctg acaaaagagc aagataaaaa attaacagat atggcgaaac 720
aaaaaggttt ttcaaaatct gcggttgcgg cgttagctat agaagaatat gcaagaaagg 780
aatcagaaca aaaaaaataa gcgaaagctc gcgtttttag aaggatacga gttttcgcta 840
cttgtttttg ataaggtaat atatcatggc tattaaaaat actaaagcta gaaattttgg 900
atttttatta tatcctgact caattcctaa tgattggaaa gaaaaattag agagtttggg 960
cgtatctatg gctgtcagtc ctttacacga tatggacgaa aaaaaagata aagatacatg 1020
gaatagtagt gatgttatac gaaatggaaa gcactataaa aaaccacact atcacgttat 1080
atatattgca cgaaatcctg taacaataga aagcgttagg aacaagatta agcgaaaatt 1140
ggggaatagt tcagttgctc atgttgagat acttgattat atcaaaggtt catatgaata 1200
tttgactcat gaatcaaagg acgctattgc taagaataaa catatatacg acaaaaaaga 1260
tattttgaac attaatgatt ttgatattga ccgctatata acacttgatg aaagccaaaa 1320
aagagaattg aagaatttac ttttagatat agtggatgac tataatttgg taaatacaaa 1380
agatttaatg gcttttattc gccttagggg agcggagttt ggaattttaa atacgaatga 1440
tgtaaaagat attgtttcaa caaactctag cgcctttaga ttatggtttg agggcaatta 1500
tcagtgtgga tatagagcaa gttatgcaaa ggttcttgat gctgaaacgg gggaaataaa 1560
atgacaaaca aagaaaaaga gttatttgct gaaaatgagg aattaaaaaa agaaattaag 1620
gacttaaaag agcgtattga aagatacaga gaaatggaag ttgaattaag tacaacaata 1680
gatttattga gaggagggat tattgaataa ataaaagccc ccctgacgaa agtcgacggc 1740
aatagttacc cttattatca agataagaaa gaaaaggatt tttcgctacg ctcaaatcct 1800
ttaaaaaaac acaaaagacc acatttttta atgtggtctt tattcttcaa ctaaagcacc 1860
cattagttca acaaacgaaa attggataaa gtgggatatt tttaaaatat atatttatgt 1920
tacagtaata ttgactttta aaaaaggatt gattctaatg aagaaagcag acaagtaagc 1980
ctcctaaatt cactttagat aaaaatttag gaggcatatc aaatgaactt taataaaatt 2040
gatttagaca attggaagag aaaagagata tttaatcatt atttgaacca acaaacgact 2100
tttagtataa ccacagaaat tgatattagt gttttatacc gaaacataaa acaagaagga 2160
tataaatttt accctgcatt tattttctta gtgacaaggg tgataaactc aaatacagct 2220
tttagaactg gttacaatag cgacggagag ttaggttatt gggataagtt agagccactt 2280
tatacaattt ttgatggtgt atctaaaaca ttctctggta tttggactcc tgtaaagaat 2340
gacttcaaag agttttatga tttatacctt tctgatgtag agaaatataa tggttcgggg 2400
aaattgtttc ccaaaacacc tatacctgaa aatgcttttt ctctttctat tattccatgg 2460
acttcattta ctgggtttaa cttaaatatc aataataata gtaattacct tctacccatt 2520
attacagcag gaaaattcat taataaaggt aattcaatat atttaccgct atctttacag 2580
gtacatcatt ctgtttgtga tggttatcat gcaggattgt ttatgaactc tattcaggaa 2640
ttgtcagata ggcctaatga ctggctttta taatatgaga taatgccgac tgtacttttt 2700
acagtcggtt ttctaatgtc actaacctgc cccgttagtt gaagaaggtt tttatattac 2760
agctccaaga tctagtctta taactatact gacaatagaa acattaacaa atctaaaaca 2820
gtcttaattc tatcttgaga aagtattggt aataatatta ttgtcgataa cgcgagcata 2880
ataaacggct ctgattaaat tctgaagttt gttagataca atgatttcgt tcgaaggaac 2940
tacaaaataa attataagga ggcactcaaa atgagtacaa aagattttaa cttggatttg 3000
gtatctgttt cgaagaaaga ttcaggtgca tcaccacgca ttacaagtat ttcgctatgt 3060
acacccggtt gtaaaacagg agactctgca tggatccccc gtctgaacga acttaatggg 3120
aggaaaaatt aaaaaagaac agttatgaaa aaaaagatta tctcagctat tttaatgtct 3180
acagtgatac tttctgctgc agccatgacg gtctgcgcaa aaaaacacgt tcatctcact 3240
cgcgatgctg cggagcagtt actggctgat attgatcgac gccttgatca gttattgccc 3300
gtggagggag aacgggatgt tgtgggtgcc gcgatgcgtg aaggtgcgct ggcaccggga 3360
aaacgtattc gccccatgtt gctgttgctg accgcccgcg atctgggttg cgctgtcagc 3420
catgacggat tactggattt ggcctgtgcg gtggaaatgg tccacgcggc ttcgctgatc 3480
cttgacgata tgccctgcat ggacgatgcg aagctgcggc gcggacgccc taccattcat 3540
tctcattacg gagagcatgt ggcaatactg gcggcggttg ccttgctgag taaagccttt 3600
ggcgtaattg ccgatgcaga tggcctcacg ccgctggcaa aaaatcgggc ggtttctgaa 3660
ctgtcaaacg ccatcggcat gcaaggattg gttcagggtc agttcaagga tctgtctgaa 3720
ggggataagc cgcgcagcgc tgaagctatt ttgatgacga atcactttaa aaccagcacg 3780
ctgttttgtg cctccatgca gatggcctcg attgttgcga atgcctccag cgaagcgcgt 3840
gattgcctgc atcgtttttc acttgatctt ggtcaggcat ttcaactgct ggacgatttg 3900
accgatggca tgaccgacac cggtaaggat agcaatcagg acgccggtaa atcgacgctg 3960
gtcaatctgt taggcccgag ggcggttgaa gaacgtctga gacaacatct tcagcttgcc 4020
agtgagcatc tctctgcggc ctgccaacac gggcacgcca ctcaacattt tattcaggcc 4080
tggtttgaca aaaaactcgc tgccgtcagt taataatact agagctcaag gaggtactag 4140
atgaataatc cgtcgttact caatcatgcg gtcgaaacga tggcagttgg ctcgaaaagt 4200
tttgcgacag cctcaaagtt atttgatgca aaaacccggc gcagcgtact gatgctctac 4260
gcctggtgcc gccattgtga cgatgttatt gacgatcaga cgctgggctt tcaggcccgg 4320
cagcctgcct tacaaacgcc cgaacaacgt ctgatgcaac ttgagatgaa aacgcgccag 4380
gcctatgcag gatcgcagat gcacgaaccg gcgtttgcgg cttttcagga agtggctatg 4440
gctcatgata tcgccccggc ttacgcgttt gatcatctgg aaggcttcgc catggatgta 4500
cgcgaagcgc aatacagcca actggatgat acgctgcgct attgctatca cgttgcaggc 4560
gttgtcggct tgatgatggc gcaaatcatg ggcgtgcggg ataacgccac gctggaccgc 4620
gcctgtgacc ttgggctggc atttcagttg accaatattg ctcgcgatat tgtggacgat 4680
gcgcatgcgg gccgctgtta tctgccggca agctggctgg agcatgaagg tctgaacaaa 4740
gagaattatg cggcacctga aaaccgtcag gcgctgagcc gtatcgcccg tcgtttggtg 4800
caggaagcag aaccttacta tttgtctgcc acagccggcc tggcagggtt gcccctgcgt 4860
tccgcctggg caatcgctac ggcgaagcag gtttaccgga aaataggtgt caaagttgaa 4920
caggccggtc agcaagcctg ggatcagcgg cagtcaacga ccacgcccga aaaattaacg 4980
ctgctgctgg ccgcctctgg tcaggccctt acttcccgga tgcgggctca tcctccccgc 5040
cctgcgcatc tctggcagcg cccgctctaa taatactaga gctcaaggag gtactagatg 5100
aaaccaacta cggtaattgg tgcaggcttc ggtggcctgg cactggcaat tcgtctacaa 5160
gctgcgggga tccccgtctt actgcttgaa caacgtgata aacccggcgg tcgggcttat 5220
gtctacgagg atcaggggtt tacctttgat gcaggcccga cggttatcac cgatcccagt 5280
gccattgaag aactgtttgc actggcagga aaacagttaa aagagtatgt cgaactgctg 5340
ccggttacgc cgttttaccg cctgtgttgg gagtcaggga aggtctttaa ttacgataac 5400
gatcaaaccc ggctcgaagc gcagattcag cagtttaatc cccgcgatgt cgaaggttat 5460
cgtcagtttc tggactattc acgcgcggtg tttaaagaag gctatctaaa gctcggtact 5520
gtcccttttt tatcgttcag agacatgctt cgcgccgcac ctcaactggc gaaactgcaa 5580
gcatggagaa gcgtttacag taaggttgcc agttacatcg aagatgaaca tctgcgccag 5640
gcgttttctt tccactcgct gttggtgggc ggcaatccct tcgccacctc atccatttat 5700
acgttgatac acgcgctgga gcgtgagtgg ggcgtctggt ttccgcgtgg cggcaccggc 5760
gcattagttc aggggatgat aaagctgttt caggatctgg gtggcgaagt cgtgttaaac 5820
gccagagtca gccatatgga aacgacagga aacaagattg aagccgtgca tttagaggac 5880
ggtcgcaggt tcctgacgca agccgtcgcg tcaaatgcag atgtggttca tacctatcgc 5940
gacctgttaa gccagcaccc tgccgcggtt aagcagtcca acaaactgca aactaagcgc 6000
atgagtaact ctctgtttgt gctctatttt ggtttgaatc accatcatga tcagctcgcg 6060
catcacacgg tttgtttcgg cccgcgttac cgcgagctga ttgacgaaat ttttaatcat 6120
gatggcctcg cagaggactt ctcactttat ctgcacgcgc cctgtgtcac ggattcgtca 6180
ctggcgcctg aaggttgcgg cagttactat gtgttggcgc cggtgccgca tttaggcacc 6240
gcgaacctcg actggacggt tgaggggcca aaactacgcg accgtatttt tgcgtacctt 6300
gagcagcatt acatgcctgg cttacggagt cagctggtca cgcaccggat gtttacgccg 6360
tttgattttc gcgaccagct taatgcctat catggctcag ccttttctgt ggagcccgtt 6420
cttacccaga gcgcctggtt tcggccgcat aaccgcgata aaaccattac taatctctac 6480
ctggtcggcg caggcacgca tcccggcgca ggcattcctg gcgtcatcgg ctcggcaaaa 6540
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Claims (1)

1.一种发酵制备番茄红素的方法，步骤是：
(1)通过在乳酸乳球菌NZ9000中消除其番茄红素合成前体物的两条竞争途径：乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径；再对该菌株中引入外源表达元件后构建产生番茄红素的重组乳酸乳球菌；
(2)将重组乳酸乳球菌菌株种子按照体积比2％的比例转接至发酵培养基中发酵即得到含番茄红素的发酵产物；
其特征在于：
所述消除乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径是通过在乳酸乳球菌NZ9000基因组中敲除ldh、als基因的部分核苷酸序列实现，其中所述敲除的ldh基因核苷酸序列如SEQID No:1所示，敲除的als基因核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述外源表达元件是菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI，该crtE、crtB和crtI的核苷酸序列以crtEBI表示，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；获得的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌基因型是NZ9000ΔldhΔals/pSEC:crtEBI；其中所述的crtE、crtB和crtI基因由质粒pSEC:crtEBI携带；该pSEC:crtEBI质粒包含来自于菠萝泛菌的crtE、crtB和crtI基因、PnisA启动子、氯霉素抗性标记、复制起始蛋白RepA和RepC，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；
所述发酵制备番茄红素的发酵条件是：30℃、100rpm～150rpm摇动培养至OD600＝0.4，加入终浓度为10ng/mL的nisin，继续摇动培养12±2h，即产生含番茄红素的发酵产物；其中，所述的发酵培养基配方是：10g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ-磷酸甘油二钠、0.005g/L氯霉素。
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