CN109321508B - 产heparosan的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产heparosan的基因工程菌。该基因工程菌以食品级谷氨酸棒状杆菌作为宿主细胞，通过导入heparosan合成酶基因、共表达heparosan合成途径的关键基因、通过敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对谷氨酸棒状杆菌进行底盘微生物改造、导入裂解酶基因，以及采用RBS调控策略或者酶修饰等手段调控谷氨酸棒状杆菌或产heparosan的基因工程菌中heparosan合成酶的酶活构建获得。该工程菌安全，高产、无毒性，且能够合成低分子量heparosan。

Description

产heparosan的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，涉及产heparosan的基因工程菌及其应用。

背景技术

肝素(heparin)是在哺乳动物结缔组织的肥大细胞表达的由糖醛酸与氨基葡萄糖组成的酸性多糖。自从1916年发现以来，肝素作为一种高效的抗凝血药物被广泛应用。肝素不仅是抗凝的首选药物，而且是目前用量最大的药物之一。但是，大量或长期使用肝素后会产生一些副作用，如出血、血小板减少等。但是通过降解肝素得到的低分子量肝素(LMWH)，临床应用发现几乎无副作用的，因此，为了减少肝素使用所产生的副作用，目前低分子肝素基本上替代了肝素作为抗凝血药物使用。

目前使用的肝素类药物全部由动物脏器提取得到，主要是猪小肠，有潜在的不安全因素和供应隐患，这将造成依赖肉市场的原料供应不稳、环境和生态危害以及潜在的人畜间交叉感染等危害。例如，2008年爆发了一次由肝素污染引起的安全事件，严重的影响到使用者的生命安全，致使肝素污染成为一个国际议题。此次肝素污染事件使人们对动物来源的肝素产生了恐慌，人们迫切希望寻求更加安全有效的新方法来合成肝素。研究者尝试了多种新方法制备肝素药物，例如化学合成包含特殊五塘序列的肝素类似物、酶化学合成寡糖及对K5荚膜多糖heparosan进行修饰等方法。

近年来的研究发现一种heparosan成分，其二糖骨架结构与脊椎动物中的肝素类似，但未硫酸化，也没有将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糠醛酸，可对heparosan进行一系列的硫酸化和异构化等相关修饰以获得微生物源低分子量肝素。heparosan目前已经在大肠杆菌K5、D型多杀性巴斯德菌和副鸡禽杆菌的荚膜中被发现，但只有E.coli K5被用于发酵生产heparosan。E.coli K5是一株病原菌，基于其生产的heparosan不宜直接用于药用，需经过多轮突变减轻毒性后才可用。

因此，目前存在的问题是需要构建一株合成heparosan的无毒性安全菌株，其能够高产低分子量heparosan。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种产heparosan的基因工程菌。该工程菌安全，高产、无毒性，且能够合成低分子量heparosan。

为此，本发明提供了一种产heparosan的基因工程菌。

根据本发明第一方面的实施方式，所述产heparosan的基因工程菌为含有heparosan合成酶基因的谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些实施例中，所述heparosan合成酶基因包括来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC，和/或来源于巴斯德菌的heparosan合成酶基因PmHS1和/或PmHS2。

根据本发明的第二方面的实施方式，所述产heparosan的基因工程菌中还共表达了heparosan合成途径的关键基因。

在本发明的一些实施例中，所述heparosan合成途径的关键基因包括UDP-GlcA合成基因模块和UDP-GlcNAc合成基因模块。

根据本发明的第三方面的实施方式，所述产heparosan的基因工程菌为经过底盘微生物改造的产heparosan的基因工程菌。

在本发明的一些实施例中，所述底盘微生物改造包括竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化。

在本发明的一些优选的实施例中，所述竞争代谢途径相关基因包括糖酵解途径相关基因、磷酸戊糖途径相关基因和乳酸途径相关基因。

根据本发明的第四方面的实施方式，所述产heparosan的基因工程菌中还含有产生低分子量heparosan的裂解酶基因。

在本发明的一些实施例中，所述裂解酶基因来源于裂解酶、肝素酶II和肝素酶III中的至少一种。

根据本发明的第五方面的实施方式，所述基因工程菌中的heparosan合成酶经过了产生低分子量heparosan的酶活调控。

在本发明的一些实施例中，所述调控的手段包括RBS调控策略和/或酶修饰。

根据本发明第一到第五方面的实时方式所述基因工程菌所合成的heparosan存在于胞内和/或胞外，优选存在于胞内。

根据本发明的第六方面的实施方式，所述基因工程菌中还含有将胞内产物转运至胞外的heparosan转运系统。

本发明还提供了上述基因工程菌在制备heparosan中的应用。

在本发明的一些优选的实施例中，所述heparosan为低分子量heparosan。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述低分子量heparosan的分子量为2-10kD。

在本发明的一些具体的实施例中，将所述基因工程菌进行发酵培养，制备heparosan。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，发酵诱导条件为：IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)诱导浓度为0.4-2.0mM，进一步优选为0.8-1.2mM。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，发酵诱导条件为：诱导温度为24-34℃，优选为28-32℃，进一步优选为30-32℃。

本发明将heparosan合成酶基因导入谷氨酸棒状杆菌中，构建可以生产heparosan的重组菌株，同时，通过调控UDP-GlcA合成模块、UDP-GlcNAc合成基因模块、合成酶的稳定性及碳代谢流向等，获得了heparosan产量和分子量各异的重组菌。在此基础上，本发明还通过调控heparosan的分子量，直接体内合成低分子量heparosan；通过构建多糖转运系统，将胞内产物转运到胞外。本发明选用的宿主谷氨酸棒状杆菌是食品级微生物，对人和动物均无致病性，弥补了野生菌E.coli K5的致病性对heparosan应用的限制，为非动物源肝素和类肝素药物的制备奠定了基础。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1为kfiA和kfiC基因密码子优化前后产量对比图；

图2示出不同基因组合调控的代谢途径优化对heparosan产量的影响；

图3示出重组菌株的诱导条件优化结果，其中，图3A示出IPTG诱导浓度的优化结果，图3B示出诱导温度的优化结果，图3C示出不同诱导时间下诱导温度的优化结果；

图4示出重组菌株的发酵罐上罐结果，其中，图4A示出发酵过程中的OD600、葡萄糖剩余量和胞内产量，图4B示出发酵过程中的胞外产物产量；

图5示出重组谷氨酸棒状杆菌生产的heparosan的结构鉴定结果，其中，图5A示出产物的13C-NMR谱，图5B示出产物的1H-NMR谱，图5C示出产物的LC-MS检测结果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。就好比汽车有了底盘才有基础，在这个基础上可以制造各种各样的车体，安装各种功能组件。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。

本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌，如谷氨酸棒状杆菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物。

本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。

本发明所述用语“基因模块”是指表达模式相似的基因组合在一起组成的一个模块。

本发明中所述用语“heparosan”又称为N-acetylheparosan，(-GlcA-1,4-GlcNAc-1,4-)n(其中GlcA代表葡糖醛酸；Glc-NAc代表乙酰氨基葡糖)，是某些细菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，同时也是肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体；本发明中称为“肝素前体”或“肝素原”。

本发明中所述用语“低分子量heparosan”是指分子量为2-10kD的heparosan。

本发明所述用语“hasB”是指编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因，所述UDP-葡萄糖脱氢酶催化UDP-Glc生成UDP-GlcA，其在谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)中也被称为udgA1。

Ⅱ.实施方案

如前所述，heparosan目前虽然已经在大肠杆菌K5、D型多杀性巴斯德菌和副鸡禽杆菌的荚膜中被发现，但只有E.coli K5被用于发酵生产heparosan。然而E.coli K5是一株病原菌，基于其生产的heparosan不宜直接用于药用，需经过多轮突变减轻毒性之后才可用。鉴于此，本发明人对于产heparosan的基因工程菌的构建进行了大量的研究，本发明人研究发现，采用食品级谷氨酸棒状杆菌为宿主细胞，通过导入heparosan合成酶基因、共表达heparosan合成途径的关键基因、通过敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对谷氨酸棒状杆菌进行底盘微生物改造、导入裂解酶基因，以及采用RBS调控策略或者酶修饰等手段调控谷氨酸棒状杆菌或产heparosan的基因工程菌中heparosan合成酶的酶活，可以构建并获得一种产heparosan的基因工程菌，该工程菌安全、高产、无毒性，且能够合成低分子量heparosan。

因此，本发明第一方面的实施方式所涉及的产heparosan的基因工程菌为含有heparosan合成酶基因的谷氨酸棒状杆菌。所述heparosan合成酶基因作为聚合基因模块用于在谷氨酸棒状杆菌中构建heparosan合成途径。

本发明中，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏编号为ATCC13032。该菌株为食品级菌株，安全、无毒性。

在本发明的一些实施例中，所述heparosan合成酶基因包括来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC，和/或来源于巴斯德菌的heparosan合成酶基因PmHS1和/或PmHS2，优选为来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC。本领域技术人员应该了解的是，来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC共同作为聚合基因模块，而来源于巴斯德菌的heparosan合成酶基因PmHS1和PmHS2可以分别独立地作为聚合基因模块。

在本发明的一些具体的实施例中，所述E.coli K5的保藏编号为ATCC 23506。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因kfiA的核苷酸序列如SEQNo.1所示和SEQ No.2所示，优选如SEQ No.1所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因kfiC的核苷酸序列如SEQNo.4和SEQ No.5所示，优选如SEQ No.4所示。

在一些例子中，例如，可以利用基因kfiA和kfiC构建基因工程菌，用于构建重组质粒的相关引物如表1所示，相应的序列如SEQ No.11-26所示。

表1构建重组质粒的相关引物(基因kfiA和kfiC)

在本发明的一些具体的实施例中，所述巴斯德菌来自瓦赫宁根乌尔中央兽医研究所，菌种编号为40456。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因PmHS1的核苷酸序列如SEQNo.27所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因PmHS2的核苷酸序列如SEQNo.28所示。

在一些例子中，例如可以利用基因PmHS1和/或基因PmHS2构建基因工程菌，用于构建重组质粒的相关引物如表2所示，相应的序列如SEQ No.33-44所示。

表2构建重组质粒的相关引物(基因PmHS1和/或基因PmHS2)

本发明第二方面的实施方式所涉及的产heparosan的基因工程菌中还共表达了heparosan合成途径的关键基因。

在本发明的一些实施例中，所述heparosan合成途径的关键基因包括UDP-GlcA合成基因模块和UDP-GlcNAc合成基因模块。这些模块可用于调控UDP-GlcA和UDP-GlcNAc前体的浓度及存在比例，从而达到调控heparosan产量及分子量的目的。

在本发明的一些具体的实施例中，所述UDP-GlcA合成基因模块包含以下基因：pgm、galU、hasB和kfiD。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因pgm的核苷酸序列如SEQNo.29所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因galU的核苷酸序列如SEQNo.30所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因hasB的核苷酸序列如SEQNo.7所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因kfiD的核苷酸序列如SEQNo.6所示。

在本发明的一些具体的实施例中，所述UDP-GlcNAc合成基因模块包含以下基因：pgi、glmS、glmU和mrsA。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因pgi的核苷酸序列如SEQNo.32所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因glmS的核苷酸序列如SEQNo.8所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因glmU的核苷酸序列如SEQ No.9所示。

在本发明的一些进一步具体的实施例中，所述基因mrsA的核苷酸序列如SEQNo.31所示。

本领域技术人员应该了解的是，在heparosan合成过程中，在第一方面是实施例中所述的heparosan合成酶基因(聚合基因模块)的作用下，上述UDP-GlcA合成基因模块和UDP-GlcNAc合成模块的产物UDP-GlcA和UDP-GlcNAc作为底物交替连接形成的聚合物。所以本发明中的heparosan合成途径含有两个前体合成基因模块，即UDP-GlcA合成基因模块和UDP-GlcNAc合成基因模块，以及一个聚合基因模块，即来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC，和/或来源于巴斯德菌的heparosan合成酶基因PmHS1和/或PmHS2。

本发明第三方面的实施方式所涉及的产heparosan的基因工程菌为经过底盘微生物改造的产heparosan的基因工程菌。

在本发明的一些实施例中，所述底盘微生物改造包括竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化，由此可以调控碳代谢流向，使更多的底物流向heparosan的合成。

在本发明的一些优选的实施例中，所述竞争代谢途径相关基因包括糖酵解途径相关基因、磷酸戊糖途径相关基因和乳酸途径相关基因。

本发明利用上述第一、第二和第三方面的实施方式调控碳代谢流向，从而达到调控heparosan合成的目的。

本发明第四方面的实施方式所涉及的产heparosan的基因工程菌中还含有产生低分子量heparosan的裂解酶基因。这些基因可以特异性的酶解heparosan，直接合成低分子量heparosan(分子量为2-10kD)。

在本发明的一些实施例中，所述裂解酶基因来源于裂解酶、肝素酶II和肝素酶III中的至少一种。

本发明第五方面的实施方式所涉及的所述基因工程菌中的heparosan合成酶经过了产生低分子量heparosan的酶活调控。

在本发明的一些实施例中，所述调控的手段包括RBS调控策略和/或者酶修饰，由此可以实现2-10kD的低分子量heparosan的合成。

本发明第一到第五方面的实施方式中所述的基因工程菌所合成的heparosan存在于胞内和/或胞外，优选存在于胞内。

本发明第六方面的实施方式所涉及的基因工程菌中还含有将胞内产物转运至胞外的heparosan转运系统。

为实现上述实施方案，本发明还提供了一种产heparosan基因工程菌的制备方法，其包括步骤A，在谷氨酸棒状杆菌中导入heparosan合成酶基因，在谷氨酸棒状杆菌中构建heparosan合成途径，获得含有heparosan合成酶基因的谷氨酸棒状杆菌作为产heparosan基因工程菌。

在本发明的一些实施例中，所述heparosan合成酶基因包括来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC，和/或来源于巴斯德菌的heparosan合成酶基因PmHS1和/或PmHS2。

根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括步骤B，在步骤A中构建的产heparosan基因工程菌中共表达heparosan合成途径的关键基因，例如，UDP-GlcA合成基因模块(含基因pgm、galU、hasB和kfiD)和UDP-GlcNAc合成基因模块(含基因pgi、glmS、glmU和mrsA)。由此调控UDP-GlcA和UDP-GlcNAc前体的浓度及存在比例，从而达到调控heparosan产量及分子量的目的。

本领域技术人员应该了解的是，在heparosan合成过程中，在第一方面是实施方式所导入的heparosan合成酶基因(聚合基因模块)的作用下，上述UDP-GlcA合成基因模块和UDP-GlcNAc合成基因模块的产物UDP-GlcA和UDP-GlcNAc作为底物交替连接形成的聚合物。所以本发明中的heparosan合成途径含有两个前体合成基因模块，即UDP-GlcA合成基因模块和UDP-GlcNAc合成基因模块，以及一个聚合基因模块，即来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC，和/或来源于巴斯德菌的heparosan合成酶基因PmHS1和/或PmHS2。

根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括步骤C，对谷氨酸棒状杆菌进行底盘微生物改造，敲除或弱化竞争代谢途径相关基因，调控碳代谢流向，使更多的底物流向heparosan的合成，达到高产的目的，获得经过底盘微生物改造的产heparosan的基因工程菌。

在本发明的一些优选的实施例中，所述竞争代谢途径相关基因包括糖酵解途径相关基因、磷酸戊糖途径相关基因和乳酸途径相关基因。

利用本发明利用上述步骤A、步骤B和步骤C可用于调控碳代谢流向，从而达到调控heparosan合成的目的。

根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括步骤D，在上述步骤A、步骤B或步骤C中构建的产heparosan的基因工程菌中外源导入裂解酶基因，可以特异性的酶解heparosan，直接合成低分子量heparosan(分子量为2-10kD)。

在本发明的一些实施例中，所述裂解酶基因来源于裂解酶、肝素酶II和肝素酶III中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括步骤E，采用RBS调控策略或者酶修饰等手段调控上述步骤A、步骤B、步骤C或步骤D中构建的产heparosan的基因工程菌中heparosan合成酶的酶活，通过酶活的控制达到分子量调控的目的，实现2-10kD的低分子量heparosan的合成。

本发明利用上述步骤D和/或步骤E构建产heparosan的基因工程菌可以直接合成低分子量heparosan的基因工程菌。

本发明步骤A到步骤E中所构建的所述基因工程菌所合成的heparosan存在于胞内和/或胞外，优选存在于胞内。

鉴于此，在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括在步骤A到步骤E中任意一项所构建的基因工程菌中构建有将胞内产物转运至胞外的heparosan转运系统，由此可以实现将基因工程菌中的胞内产物heparosan转运至胞外。

本领域技术人员应该了解的是，本发明中对于上述构建基因工程菌的步骤B到步骤E的次序没有特别的限制，例如，上述构建基因工程菌的步骤B到步骤E既可以依字母顺序进行，也可以以任意次序进行。

本发明所涉及的上述基因工程菌在制备heparosan中的应用，可以理解为利用上述基因工程菌制备heparosan的方法。

在本发明的一些优选的实施例中，所述heparosan为低分子量heparosan；优选地，所述低分子量heparosan的分子量为2-10kD。

在本发明的一些具体的实施例中，将上述基因工程菌进行发酵培养，制备heparosan。本发明人研究发现通过控制发酵诱导条件，可以进一步提高heparosan的产量。例如，在本发明的一些进一步具体的实施例中，发酵诱导条件为：诱导剂IPTG诱导浓度为0.4-2.0mM，优选为0.8-1.2mM，进一步优选为0.8mM；诱导温度为24-34℃，优选为28-32℃，进一步优选为30-32℃，更进一步优选为30℃。

本发明提供了一种制备heparosan的基因工程菌，其是在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中外源导入heparosan合成酶基因，构建谷氨酸棒状杆菌中heparosan合成途径。

所述重组谷氨酸棒状杆菌，还通过共表达UDP-GlcA合成基因模块和UDP-GlcNAc合成基因模块，调控UDP-GlcA和UDP-GlcNAc前体的浓度及存在比例，从而达到调控heparosan产量及分子量的目的。

所述重组谷氨酸棒状杆菌，还通过进行底盘微生物改造，调控碳代谢流向，从而达到调控heparosan合成的目的。底盘微生物改造包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径和乳酸途径等竞争代谢途径的敲除或弱化等手段，调控碳代谢流向，使更多的底物流向heparosan的合成，达到高产的目的。

本发明通过在构建的产heparosan的基因工程菌中再外源导入裂解酶基因或者对heparosan合成酶进行酶活的调控，构建可以直接合成低分子量heparosan的基因工程菌。

本发明通过在构建的产heparosan和低分子量heparosan的基因工程菌中构建多糖转运系统，将胞内产物转运至胞外。

Ⅲ.实施例

实施例1：重组质粒的构建

该实施例中所用到的引物如前文中表1所示。

首先提取E.coli K5的基因组，以提取的E.coli K5基因组DNA为模板，选用EcoRI-KfiA-F/KpnI-KfiA-R和XbaI-KfiC-F/SbfI-KfiC-R作为引物，进行目的基因KfiA和KfiC的PCR扩增，得到含有选定酶切位点的目的片段。然后以pEC-XK99E载体为骨架，将目的基因KfiA和KfiC逐步插入到pEC-XK99E多克隆位点对应的酶切位点处，以得到重组质粒pEC-XK99E-KfiA-KfiC，待测序验证后，用于后续的重组菌株的构建。同时还委托华大基因进行了KfiA和KfiC基因密码子的优化工作，并合成密码子优化之后的目的基因，构建了密码子优化之后的重组质粒。

同样的方法，以提取的E.coli K5和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因组为模板，分别以Sma I-kfiB-F/Sma I-kfiB-R、Sbf I-kfiD-F/SbfI-kfiD-R、SacI-hasB-F/SacI-hasB-R、SbfI-glmS-F/SbfI-glmS-R、SbfI-glmU-F/SbfI-glmU-R、KpnI-glmS-F/KpnI-glmS-R作为扩增引物，进行目的基因kfiB、kfiD、hasB、glmS和glmU的扩增，之后按照不同的排列组合，将它们插入到PXMJ19和pEC-XK99E-KfiA-KfiC的对应的多克隆位点处，构建重组质粒PXMJ19-kfiB、PXMJ19-kfiD、PXMJ19-hasB、PXMJ19-kfiD-kfiB、PXMJ19-kfiB-hasB、PXMJ19-kfiD-hasB、PXMJ19-kfiD-kfiB-hasB、pEC-XK99E-kfiA-kfiC-glmS、pEC-XK99E-kfiA-kfiC-glmU和PXMJ19-kfiD-kfiB-glmS-hasB。

实施例2：重组菌株的构建

(1)感受态细胞的制备

将-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的甘油菌接种到4mL的LBHIS(培养基)试管中，过夜培养之后，以一定的接种量接入20mL EPO培养基中，使初始OD600为0.3左右。在30℃摇床培养约2h，当OD600达0.9左右取出用于制备感受态细胞。

LBHIS培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉2.5，NaCl 5，脑心浸提液18.5，山梨醇91。

EPO培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，甘氨酸30，Tween80 10。

将培养好的菌落装入1.5mL离心管，冰浴使菌体冷却到0℃，之后4℃、4500rpm冷冻离心10min收集菌体，用100μL预冷的10％的甘油重悬菌体(三管菌体混一管)，然后4℃、4500rpm冷冻离心10min收集菌体。重复洗涤三次，洗涤完成后用100μL 10％的无菌甘油重悬菌体，用于电转化。

(2)谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的电转化

在制备的谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中加入4μL构建成功的重组质粒，轻柔的混匀，冰浴5-10min，之后将混合液移入预冷的0.2cm电击杯中，电击条件为：1.8kv，电击5ms，50μF，100Ω。电击完毕后立即加入800μL在46℃预热的LBHIS培养基，轻柔的混匀后吸出放入1.5mL离心管中，46℃水浴6min，然后置于30℃复苏3h。复苏完成之后吸取一定量的菌液涂布于对应抗性平板上，30℃培养24-36h，对长出的单菌落进行菌落PCR验证、划线纯化等操作，然后挑取合适的阳性克隆，将其接种到4mL的LBHIS培养基的试管中，过夜培养之后，进行甘油菌的保存，将保存的甘油菌放置在-80℃冰箱中存放。

为了构建途径优化的重组菌株，需要按照上述方法以Y-AC制备感受态细胞，然后将PXMJ19-kfiB、PXMJ19-kfiD、PXMJ19-hasB、PXMJ19-kfiD-kfiB、PXMJ19-kfiB-hasB、PXMJ19-kfiD-hasB、PXMJ19-kfiD-kfiB-hasB和PXMJ19-kfiD-kfiB-glmS-hasB分别电转进该感受态细胞中，制备所需的重组菌株。同样的方法，将pEC-XK99E-kfiA-kfiC-glmS和pEC-XK99E-kfiA-kfiC-glmU与PXMJ19-kfiD-kfiB-hasB分别进行共转，构建所需的重组菌株。构建的重组菌株如表3所示。

表3构建的重组菌株

实施例3：重组菌株的摇瓶发酵验证

(1)重组菌株的摇瓶培养

吸取-80℃冰箱中存放的重组菌株的甘油菌100μL接种于4mL的LBHIS试管培养基中，30℃、200rpm摇床培养12-14h。之后将种子液按照2％的接种量接种到20mL LBG种子培养基中，同样在30℃、200rpm摇床培养12-14h。待种子培养完成之后，按照5％的接种量将种子液接种到配好的50mL无菌发酵培养基中，在OD600＝2.5左右时，加入终浓度为0.8mMIPTG，对目的基因进行诱导表达，在30℃、200rpm摇床条件下培养48h左右。

LBG种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，葡萄糖20。

(2)生物量的测定

取发酵液用去离子水进行适当稀释之后，用酶标仪测定其在600nm波长下的吸光值，选用96孔板进行吸光值的测定，装液量是200μL。

(3)样品的预处理

摇瓶培养完成之后，取30mL发酵液于50mL离心管中，在8000rpm、4℃条件下离心20min，以分离发酵上清液和细胞沉淀。采用高压匀浆机对其进行细胞破胞，在1300bar压力下循环破碎5min。破胞完成之后，同样在8000rpm、4℃条件下离心20min，以分离破胞上清液和破胞后的细胞碎片。

将发酵上清液和破胞上清液分别用预冷的3倍体积无水乙醇进行醇沉，以收集heparosan的粗品。在发酵上清液和破胞上清液中加入预冷的3倍体积无水乙醇，混匀后在4℃冰箱中醇沉2h，之后在8000rpm、4℃条件下离心20min以收集沉淀。醇沉得到的样品待乙醇挥发完全之后，用适量的去离子水复溶，用于后续的样品含量测定。

(4)heparosan含量的测定

本发明采用硫酸咔唑法对heparosan进行定量，通过测定葡萄糖醛酸的含量，间接的对heparosan进行定量。heparosan会在浓硫酸存在的条件下酸解成葡萄糖醛酸和葡萄糖胺，其中的葡萄糖醛酸与咔唑试剂反应生成紫红色物质，该物质与葡萄糖醛酸的含量成正比关系，通过葡萄糖醛酸在肝素前体中的比例，确定肝素前体的含量。

具体测定方法为：取1mL处理好的待测样品于比色管中，缓慢加入5ml冰浴的硼砂硫酸溶液(称取0.954gNa₂B₄O₇·10H₂O试剂，加入100mL浓硫酸使其溶解)，混匀后插入冰水浴中放热，待放热完毕后沸水加热10min，之后将样品放入冰水浴中冷却。冷至室温后，加入0.2mL咔唑试剂(称取0.125g咔唑试剂，使其溶于100mL无水乙醇中)，混匀，沸水加热15min使其显色。反应完成之后，待样品冷至室温，测定其OD530。

标准曲线的测定：用容量瓶精准配制出浓度分别是10、20、30、40、50mg/L的葡萄糖醛酸标准溶液，用上述硫酸咔唑法测定各个标准液的OD530。根据测定结果以葡萄糖醛酸的浓度为横坐标，OD530作为纵坐标绘制标准曲线。

根据上述的样品处理和定量方法对构建的重组菌株进行发酵验证，结果如图1和图2所示。图1是kfiA和kfiC基因密码子优化前后产量对比图，从图中可以看出密码子优化之后菌株对葡萄糖的消耗比较快，菌株生长趋势比未优化的好，相应的heparosan在前期合成速度也比较快，在培养32h达到最高产量487mg/L。而没有进行密码子优化的菌株在36h产量最高，达到了527mg/L。所以在后续代谢途径优化的时候，将选择未优化的菌株Y-AC作为对象，发酵时间选择36h。

在Y-AC的基础上进行代谢途径的优化，结果如图2所示。从图中可以看出，基因KfiB、KfiD、hasB的添加对heparosan产量的提升都是有利的，而glmS和glmU基因的加入则不利于产量的提升，尤其是glmS基因，由于其核糖开关效应导致菌体生长受阻，造成了重组菌株几乎无heparosan产生。从中可以看出，目前来说最好的菌株是BDH，产量有1.04g/L。

实施例4：发酵条件优化及发酵罐培养

按照实例3重组菌株发酵验证的实验方法，通过改变诱导条件，进行菌株的培养和产量测定，以筛选最适的发酵诱导条件。IPTG浓度的设定是0、0.4mM、0.8mM、1.2mM、1.6mM和2.0mM。诱导温度选择24℃、26℃、28℃、30℃、32℃和34℃六个温度点。该部分实验选择目前来说产量最高的菌株BDH作为研究对象，对照组选用PP菌株。结果见图3A-3C，从图3A可以看出，当IPTG诱导浓度是0.8mM时，OD600和heparosan产量都是最高的。而且，1.2mM和1.6mM诱导时，产量和0.8mM IPTG诱导产量几乎相等，所以综合考虑成本等因素，本发明将选择0.8mM作为最适的IPTG诱导浓度。从图3B和3C可以看出，30℃诱导40h时的产量最高，有1.2g/L左右。所以在后续的实验中，将选择30℃作为诱导温度。

根据上述结果可知，目前最好的菌株是BDH菌株，最适IPTG浓度是0.8mM，最适诱导温度是30℃。据此，本发明以BDH菌株作为对象，选用最适的诱导条件进行5L发酵罐培养的尝试，结果如图4A和4B所示。从图4A中可以看出，OD600和胞内产物合成的趋势是一致的，胞内heparosan在36h最高，有1.10g/L。同时，对胞外产物同时进行了检测，结果如图4B所示。从图4B中可以看出，从24-40h胞外heparosan的产量随着时间的延长而增加，36-40h急剧增加，40h时硫酸咔唑法检测响应值最高，高达2.03g/L。40h之后随着时间的延长，胞外heparosan又逐渐减少。综上所述，BDH菌株上罐后胞内胞外heparosan的产量总和是3.13g/L。这仅是初步尝试，后续将进行上罐优化以进一步提升产量。

实施例5：样品的分离纯化

采用常用的离子交换纯化的方法对目标产物heparosan进行分离纯化，根据heparosan的带电性，填料选用DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose等弱阴离子交换剂树脂。

(1)样品的预处理

发酵完成之后，取发酵液于8000rpm、4℃条件下离心20min，以分离发酵上清液和细胞沉淀。发酵上清液因比较黏稠，不利于上样，所以用缓冲液A(50mM NaCl，50mM NaAc，pH4.5)或者去离子水稀释两倍之后再上样。稀释之后用冰醋酸调节其pH＝4.5，同样的条件下再次离心以除去不溶物，收集上清液用于后续的分离纯化。

细胞沉淀用等体积缓冲液A(50mM NaCl，50mM NaAc，pH4.5)或者去离子水重悬，采用高压匀浆机对其进行细胞破碎，在1300bar压力下循环破碎5min。破胞完成之后，同样在8000rpm、4℃条件下离心20min，以收集破胞上清液。用冰醋酸调节破胞上清液使其pH＝4.5，然后在8000rpm、4℃条件下离心以除去不溶物，收集上清液用于后续的分离纯化，该部分可除去大部分的蛋白质杂质。

(2)heparosan的分离纯化

akta分离纯化系统清洗完毕之后，取20mL的玻璃层析管竖直安装于试验台上，然后倒入DEAE-Sephacel填料(GE，美国通用电气公司)，使其在压力控制下装柱子，压力设置为0.02MPa。在装柱完成之后，用至少100mL缓冲液A(50mM NaCl，50mM NaAc，pH4.5)平衡柱子，之后将预处理之后的样品(发酵上清液/破胞上清液)进行上样操作。上样完成之后，用200mL缓冲液A冲洗柱子，洗去未吸附的杂质，然后用100mL缓冲液B(1.5M NaCl，50mM NaAc，pH4.5)进行洗脱，将吸附的样品洗脱下来。洗脱液需要用透析袋进行脱盐处理，脱盐完成之后，用真空冷冻干燥机对样品进行冻干处理，即得到纯化之后的样品。

实施例6：重组菌株产物的结构鉴定

(1)核磁鉴定

分离纯化的样品送至北京化工大学分析测试中心进行核磁鉴定。样品使用D₂O溶解，使用600MHz的核磁共振波谱仪进行¹H-NMR和¹³C-NMR谱的测定。核磁结果如图5A和5B所示，从图中可以看出，构建的基因工程菌产生的样品测定的¹H-NMR和¹³C-NMR谱图和heparosan标准品的谱图基本一致，差异仅在于纯化的胞内样品1H-NMR和13C-NMR谱图较标准品都多出了一个杂峰的存在。

(2)二糖结构分析

将分离纯化得到的样品进行亚硝酸降解，收集二糖片段，使用LC-MS的检测手段对其进行二糖结构的鉴定。首先用NaOH溶液对heparosan进行去乙酰化处理，之后用pH 3.9的HNO₂溶液对heparosan样品进行降解处理。将亚硝酸处理之后的样品用Superose 12柱子进行分离，每1mL洗脱液收集一管，用硫酸咔唑法测定每管样品的OD530，根据测定结果绘制洗脱曲线。将洗脱峰对应的样品用超纯水溶解，然后送样至中国计量科学研究院进行LC-MS的检测，以对重组菌株的产物进行二糖结构的鉴定。结果如图5C所示，从图中可以看出，heparosan经亚硝酸降解之后，得到的二糖是GM(葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的二糖)的二糖结构，而去磺基化的肝素样品经亚硝酸降解之后，得到的339处的峰的二糖结构包括GM和IM(艾杜糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的二糖)两种存在形式。因为以heparosan为底物，制备肝素时，需要经过异构化处理将heparosan中的一部分葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸。所以目标产物heparosan质谱检测应该仅有GM一种形式的二糖存在。上述二糖结构鉴定结果符合这一说法，说明了二糖结构鉴定的正确性。

综上所述，结合图5A-5C的结构鉴定结果，可以得出如下结论：构建的基因工程菌制备的是本发明的目标产物heparosan，说明基因工程菌的构建是成功的。

实施例7：重组菌株产物分子量调控

通过GPC测试可以发现，构建的重组菌株合成的heparosan的分子量大于150kD，而本发明用于低分子量肝素制备的heparosan的分子量大小要求是5kD左右。所以为了得到低分子量heparosan，本发明通过在构建的基因工程菌中导入裂解酶基因，达到直接合成低分子量heparosan的目的。按照实例1重组质粒的构建方法，将选择的裂解酶基因Elma插入到质粒PXMJ19对应的酶切位点处，构建重组质粒PXMJ19-Elma。然后按照实例2重组菌株的构建方法，将该质粒与质粒pEC-XK99E-kfiA-kfiC进行共转，构建可以合成低分子量heparosan的重组菌株，记为Elma菌株。待菌株构建完成之后，进行摇瓶发酵和GPC检测，同时以AC菌株作为比较菌株，以验证分子量调控效果，结果见表4。

表4分子量调控结果

从表3中的调控结果可以看出，本发明的分子量调控策略是有效的，加入裂解酶之后得到的产物的分子量明显降低，且低分子(7.74kD)的占比更多，通过发酵时间的延长，本发明能够调控目标菌株使其生产分子量范围2-10kD的低分子量heparosan。

实施例8：多糖转运系统的构建

上述构建的产heparosan以及低分子量heparosan的重组谷氨酸棒状杆菌合成的产物主要存在于胞内，这对于后续的分离纯化以及产量的提升具有一定的限制。所以为了后续工业化使用，本发明在重组菌中又构建了多糖转运系统，将胞内产物转运至胞外。按照实施例1和2的方法将负责多糖转运的基因构建重组质粒，之后将重组质粒转入到宿主中，构建可以进行多糖转运的基因工程菌。结果表明，采用含有该转运系统的基因工程菌，胞内产物转运至胞外的转运率较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 产heparosan的基因工程菌及其应用

<130> RB1802921-FF

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> （基因KfiA）

<400> 1

atgattgttg caaatatgtc atcataccca cctcgaaaaa aagagttggt gcattctata 60

caaagtttac atgctcaagt agataaaatt aatctttgcc tgaatgagtt tgaagaaatt 120

cctgaggaat tagatggttt ttcaaaatta aatccagtta ttccagataa agattataag 180

gatgtgggca aatttatatt tccttgcgct aaaaatgata tgatcgtact tacagatgat 240

gatattattt accctcccga ttatgtagaa aaaatgctca atttttataa ttcctttgca 300

atattcaatt gcattgttgg gattcatggc tgtatataca tagatgcatt tgatggagat 360

cagtctaaaa gaaaagtatt ttcatttact caagggctat tgcgaccgag agttgtaaat 420

caattaggta cagggactgt ttttcttaag gcagatcaat taccatcttt aaaatatatg 480

gatggttctc aacgattcgt cgatgttaga ttttctcgct atatgttaga gaatgaaatt 540

ggtatgatat gtgttcccag agaaaaaaac tggctaagag aggtctcatc aggttcaatg 600

gaaggacttt ggaacacatt tacaaaaaaa tggcctttag acatcataaa agaaacacaa 660

gcaatcgcag gatattcaaa acttaacctc gaattagtgt ataatgtgga agggtaa 717

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> （密码子优化后基因KfiA）

<400> 2

atgatcgtgg ctaacatgtc ctcctaccca ccacgcaaga aggagctggt gcactccatc 60

cagtccctgc acgcacaggt ggataagatc aacctgtgcc tgaacgagtt cgaggagatc 120

ccagaggaac tggacggctt ctccaagctg aacccagtga tcccagataa ggattacaag 180

gatgtgggca agttcatctt cccatgcgca aagaacgata tgatcgtgct gaccgatgat 240

gatatcatct acccaccaga ctacgtggaa aagatgctga acttctacaa ctccttcgct 300

atcttcaact gcatcgtggg catccacggc tgcatctaca tcgacgcttt cgatggcgac 360

cagtccaagc gcaaggtgtt ctccttcacc cagggcctgc tgcgcccacg cgtggttaac 420

cagctgggca ccggcaccgt gttcctgaag gctgaccagc tgccatccct gaagtacatg 480

gacggctccc agcgcttcgt cgatgtgcgc ttctcccgct acatgctgga aaacgaaatc 540

ggcatgatct gcgtgccacg cgagaagaac tggctgcgcg aggtgtcctc cggctccatg 600

gagggcctgt ggaacacctt caccaagaag tggccactgg atatcatcaa ggaaacccag 660

gcaatcgcag gctactccaa gctgaatctg gagctggtgt acaacgtgga gggctaa 717

<210> 3

<211> 1692

<212> DNA

<213> （基因KfiB）

<400> 3

atgatgaata aattagtgct agtcggacat cctggctcaa agtatcagat agttgaacat 60

tttttgaaag aaattggcat gaactcacca aattattcta caagtaataa aatttcccca 120

gaatatatca ccgcttcatt atgtcaattt tatcaaacac cagaagttaa tgatgtagta 180

gatgagagag aattctcagc tgttcaagtc tcaaccatgt gggatagcat ggttcttgaa 240

ctaatgatga acaatctaaa taacaaactt tgggggtggg cagatccatc tataatattt 300

tttcttgatt tttggaaaaa tatagataaa agcataaaat tcatcatgat atatgatcac 360

cctaaatata atttaatgcg ttcagtaaat aatgcccctc tctctttaaa tataaataat 420

agtgtagata actggattgc atataataaa agattgcttg attttttttt ggagaataaa 480

gaacgatgtg tgttgattaa ttttgaggcg tttcaaagca ataagaaaaa tattataaag 540

ccattgagta atattataaa aatagataat ctaatgtctg cgcattacaa aaattcaata 600

ttgtttgatg tggttgagaa taatgattat acaaaatcaa atgaaattgc cctgcttgaa 660

aaatatacaa ctttattttc tttaagtgca aatgagactg aaattacatt taatgataca 720

aaggttagtg agtacttagt atctgaatta ataaaagaaa gaaccgaggt tctgaagctt 780

tataatgagt tacaagccta tgcaaaccta ccttatatag aaacatcgaa agataacgtt 840

tcggctgagg ctgcattatg ggaggtagtc gaagagagaa attctatctt caatattgta 900

tctcatttgg tgcaagagtc aaaaaagaag gatgcagata ttgaattgac taaatctata 960

tttaagaaaa gacaattttt attattgaac aggattaatg agctaaaaaa agaaaaggaa 1020

gaggtaatta aactttcaaa aataaatcac aacgatgttg tgagacaaga aaaatatcca 1080

gatgatattg aaaaaaaaat aaatgacata cagaaatatg aagaagagat aagcgaaaaa 1140

gaatcaaaac tcactcaggc aatatcagaa aaagaacaga ttttaaaaca attgcataaa 1200

tatgaagaag agataagcga aaaagaatca aaactcactc aggcaatatc agaaaaagaa 1260

cagattttaa aacaattgca tatagtgcaa gagcagttgg aacactattt tatagaaaat 1320

caggaaatta aaaagaaact tccacctgtg ctatatggag cagctgagca gataaaacaa 1380

gagttaggtt atcgacttgg ttatattata gtctcgtatt ctaaatccct caaggggatt 1440

attaccatgc catttgcact tatccgtgag tgtgtttttg aaaaaaaacg taagaagagt 1500

tatggcgttg atgtgccact ctatttatat gctgatgctg ataaggctga aagagttaag 1560

aaacatttat cttatcaatt agggcaggct attatctcca gtgctaattc gatatttgga 1620

ttcattaccc ttccatttaa gttaattgtt gttgtttata aatataggag agctaaaatc 1680

aagggctgtt aa 1692

<210> 4

<211> 1563

<212> DNA

<213> （基因KfiC）

<400> 4

atgaacgcag aatatataaa tttagttgaa cgtaaaaaga aattagggac aaatattggt 60

gctcttgatt ttttattatc aattcataag gagaaagttg atcttcaaca taaaaactcg 120

cctttaaaag gtaacgataa ccttattcac aaaagaataa acgaatacga caatgtactt 180

gaactatcta agaatgtatc agctcagaat tctggcaatg agttttctta tttattggga 240

tatgcagatt ctcttagaaa agttggtatg ttggatactt atattaaaat tgtttgttat 300

ctaacaattc aatctcgtta ttttaaaaat ggcgaacgag ttaagctttt tgaacatata 360

agtaacgctc tacggtattc aaggagtgat tttctcatta atcttatttt tgaacgatat 420

atcgaatata taaaccatct aaaattgtcg cccaaacaaa aagattttta tttttgtacg 480

aagttttcaa aatttcatga ttatactaaa aatggatata aatatttagc atttgataat 540

caagccgatg cagggtatgg cctgacttta ttattaaatg caaacgatga tatgcaagat 600

agttataatc tactccctga gcaagaactt tttatttgta atgctgtaat agataatatg 660

aatatttata ggagtcaatt taacaaatgt ctacgaaaat acgatttatc agaaataact 720

gatatatacc caaataaaat tatattgcaa ggaattaagt tcgataagaa aaaaaatgtt 780

tatggaaaag atcttgttag tataataatg tcagtattca attcagaaga tactattgca 840

tactcattac attcattgtt gaatcaaaca tatgaaaata ttgaaattct cgtgtgcgat 900

gattgttcat cggacaaaag ccttgaaata attaagagca tagcttattc tagttcaaga 960

gtgaaagtat atagctcacg aaaaaaccaa ggcccttata atataagaaa tgagctaata 1020

aaaaaagcac acggtaattt catcaccttt caagatgcag atgatctttc tcatccggag 1080

agaatacaaa gacaagttga ggttcttcgc aataataagg ctgtaatctg tatggctaac 1140

tggatccgtg ttgcgtcaaa tggaaaaatt caattcttct atgatgataa agccacaaga 1200

atgtctgttg tatcgtcaat gataaaaaaa gatatttttg cgacagttgg tggctataga 1260

caatctttaa ttggtgcaga tacggagttt tatgaaacag taataatgcg ttatgggcga 1320

gaaagtattg taagattact gcagccattg atattggggt tatggggaga ctccggactt 1380

accaggaata aaggaacaga agctctacct gatggatata tatcacaatc tcgaagagaa 1440

tatagtgata tcgcggcaag acaacgagtg ttagggaaaa gtatcgtaag tgataaagat 1500

gtacgtggtt tattatctcg ctatggtttg tttaaagatg tatcaggaat aattgaacaa 1560

tag 1563

<210> 5

<211> 1563

<212> DNA

<213> （密码子优化后基因KfiC）

<400> 5

atgaacgctg aatacatcaa cctggtggag cgcaagaaga agctgggcac caacatcggc 60

gcactggact tcctgctgtc catccacaag gaaaaggtcg atctgcagca caagaactcc 120

ccactgaagg gcaacgataa cctgatccac aagcgcatca acgagtacga taacgtcctg 180

gaactgtcca agaacgtctc cgctcagaac tccggcaacg aattctccta cctgctgggc 240

tacgcagact ccctgcgcaa ggtcggcatg ctggatacct acatcaagat cgtgtgctac 300

ctgaccatcc agtcccgcta cttcaagaac ggcgaacgcg tcaagctgtt cgagcacatc 360

tccaacgctc tgcgctactc ccgctccgat ttcctgatca acctgatctt cgaacgctac 420

atcgagtaca tcaaccacct gaagctgtcc ccaaagcaga aggacttcta cttctgcacc 480

aagttctcca agttccacga ttacaccaag aacggctaca agtacctggc tttcgacaac 540

caggctgatg caggctacgg cctgaccctg ctgctgaacg ctaacgatga catgcaggat 600

tcctacaacc tgctgccaga acaggaactg ttcatctgca acgctgtcat cgataacatg 660

aacatctacc gctcccagtt caacaagtgc ctgcgcaagt acgacctgtc cgagatcacc 720

gatatctacc caaacaagat catcctgcaa ggtatcaagt tcgacaagaa gaagaacgtg 780

tacggcaagg atctggtctc catcatcatg tccgtgttca actccgaaga caccatcgct 840

tactccctgc actccctgct gaaccagacc tacgaaaaca tcgagatcct ggtctgcgat 900

gattgctcct ccgataagtc cctggagatc atcaagtcca tcgcatactc ctcctcccgc 960

gtgaaggtgt actcctcccg caagaaccag ggcccataca acatccgcaa cgagctgatc 1020

aagaaggctc acggcaactt catcaccttc caggacgctg atgacctgtc ccacccagaa 1080

cgcatccagc gccaggtcga agtcctgcgc aacaacaagg cagtgatctg catggcaaac 1140

tggatccgcg tggcatccaa cggcaagatc cagttcttct acgatgataa ggcaacccgc 1200

atgtccgtgg tctcctccat gatcaagaag gatatcttcg caaccgtggg cggctaccgc 1260

cagtccctga tcggcgcaga taccgaattc tacgagaccg tgatcatgcg ctacggccgc 1320

gaatccatcg tccgcctgct gcagccactg atcctgggcc tgtggggcga ctccggcctg 1380

actcgtaaca agggcaccga ggctctgcca gacggctaca tctcccagtc ccgccgcgag 1440

tactccgata tcgcagcacg ccagcgcgtg ctgggcaagt ccatcgtctc cgacaaggac 1500

gtgcgcggcc tgctgtcccg ctacggtctg ttcaaggacg tctccggcat catcgagcag 1560

taa 1563

<210> 6

<211> 1179

<212> DNA

<213> （基因KfiD）

<400> 6

atgttcggaa cactaaaaat aactgtttca ggcgctggtt acgttgggct ttcaaatgga 60

attctaatgg ctcaaaatca tgaagtggtt gcatttgata cccatcaaaa aaaagttgac 120

ttacttaatg ataaactctc tcctatagag gataaggaaa ttgaaaatta tctttcaact 180

aaaatactta attttcgcgc aactactaac aaatatgaag cctataaaaa tgccaattac 240

gttattattg ctacaccaac gaattatgac ccaggttcaa attactttga tacatcaagc 300

gttgaagctg tcattcgtga cgtaacggaa atcaacccaa acgcaattat ggtggttaaa 360

tctacggtcc cagtaggttt cacaaaaaca attaaagaac atttaggtat taataatatt 420

atcttctctc cagaattttt acgagaagga agagccctat acgataatct ccatccatct 480

cgcattatta tcggtgaatg ttctgaacgg gcagaacgtt tggcagtgtt atttcaggaa 540

ggagcgatta aacaaaatat acccgtttta tttacagatt ctacggaagc ggaagcgatt 600

aagttatttt caaatactta tttggctatg cgagttgcat tttttaatga attggatagt 660

tacgcagaaa gttttggtct gaatacgcgt cagattattg acggtgtttg tttggatccg 720

cgcattggta attactacaa taatccttct tttggttatg gtggctactg tttgccaaaa 780

gataccaagc aattattagc caactatcag tctgttccga ataaacttat atctgcaatt 840

gttgatgcta accgtacacg taaggacttt atcactaatg ttattttgaa acatagacca 900

caagttgtgg gggtttatcg tttgattatg aaaagtggtt cagataattt tagagattct 960

tctattcttg gtattataaa gcgtatcaag aaaaaaggcg tgaaagtaat tatttatgag 1020

ccgcttattt ctggagatac attctttaac tcacctttgg aacgggagct ggcgatcttt 1080

aaagggaaag ctgatattat tatcactaac cgaatgtcag aggagttgaa cgatgtggtc 1140

gacaaagtct atagtcgcga tttgtttaaa tgtgactaa 1179

<210> 7

<211> 1164

<212> DNA

<213> （基因hasB）

<400> 7

atgaaaattg ccgtcgcagg gctcggatat gttgggcttt caaatgcagc tctcctctct 60

aaaaatcata aagttgttgc agttgacatt gatgaagaac gagtgaaact agttcaagaa 120

tttcgttcgc caattgtcga tagcgatctc gaagaatatc tgtccactaa gcctcaaaac 180

ttaactgcca caacggacgc cgaagccgct tacaaaggcg cagattttat tgttattgca 240

acgccaacta attacgaccc agagtcaaac ttttttgata cttccagcgt tgagtccgta 300

attgagatag tccttaaggt ttctcctgga tccacaatcg taattaaatc gactatccct 360

gttggtttta catcggaact acgcattaag catccagaag cttcgattat tttttcacct 420

gagttcctgc gtgaaggccg agcattctac gacaatctct acccatccag agttgtcgtt 480

ggtgatcgca gtcctctggg ggaagaattt gcgactctgt tagctgaggg ggcaaaagaa 540

aagcctccga ttctacttac ggactcaact gaggcagagg cgattaaatt attttctaat 600

acatatcttg cactgcgagt tgcttttttc aacgaactgg atacttatgc gtctgttcga 660

agcttggata ctaagcagat tattgaaggg gtagggctcg atccacgtat tggatctcat 720

tacaataatc cttcatttgg atatggcgga tattgtcttc cgaaagatac gaaacagctt 780

ctcgccaact ataaggatgt cccgcagaat ctaatctctg cagtagtcca agcaaataag 840

actcgtaagg actttattgc agaggatatc ctcagtaaat cacctactgt agttggaatt 900

taccgccttg taatgaagtc tggatcagat aactttcgtt cttcttctat tcaaggagtc 960

atgaaacgaa ttaaggccaa gggaatcgaa attgtagtat ttgaaccgaa tctcggagaa 1020

gaaactttct acaattcgaa gatccttaat gacatcgaag agtttaagga ttactgcgac 1080

atcattattg caaatcgtcc aaccgatgag ctttctgatg taccagaaaa agtttataca 1140

cgtgatattt tccagcgtga ctaa 1164

<210> 8

<211> 1878

<212> DNA

<213> （基因glmS）

<400> 8

atgcgcatgt gtggaattgt tggatatatt ggccaagcgg gcgactcccg tgattacttt 60

gctctagatg tagttgttga aggactacgt cgcctggaat accgcggata tgactccgca 120

ggtattgcta ttcacgccaa tggtgagatt agctaccgaa agaaggccgg aaaggttgct 180

gcactagatg cagaaatcgc taaagcacct cttccagatt ctattttggg aattggacac 240

acccgttggg caactcatgg tggcccaacc gatgtcaacg ctcaccccca cgttgtttcc 300

aatggcaagc ttgccgtagt acacaacggc atcatcgaaa actttgcgga actgcgctct 360

gagctttccg ctaagggcta caactttgta tccgataccg ataccgaagt tgctgcttct 420

ttgcttgctg aaatttacaa tactcaggca aacggtgacc tcacccttgc tatgcagctg 480

accggtcagc gccttgaggg tgctttcacc ctgctagcta ttcatgctga tcacgatgac 540

cgcatcgttg cagctcgtcg taactctcct ttggttatcg gcgtcggcga gggcgagaac 600

ttcctcggat ctgacgtttc tggctttatt gattacaccc gcaaggctgt agagctggct 660

aatgaccagg ttgttaccat caccgctgat gattacgcca tcaccaactt tgatggatca 720

gaagcagttg gcaagccttt cgacgtggag tgggacgctg cagctgctga aaagggtggc 780

ttcggttcct tcatggagaa ggaaatccac gatcagccag cagctgttcg cgataccctg 840

atgggccgtc ttgatgaaga tggcaagctc gttcttgatg agctgcgcat cgatgaagct 900

attctgcgta gtgtcgacaa gatcgtcatt gttgcttgtg gtactgcagc ttatgcaggc 960

caggttgctc gttacgccat tgagcactgg tgccgcatcc caaccgaggt ggagctggct 1020

cacgagttcc gttaccgcga cccaatcctc aacgagaaga cccttgttgt ggcattgtcc 1080

cagtccggcg agaccatgga taccctcatg gctgttcgcc acgcacgtga gcagggtgcc 1140

aaggttgttg ctatttgtaa cactgttgga tccactcttc cacgtgaagc agatgcgtcc 1200

ctgtacacct acgctggccc tgagatcgct gtggcgtcca ccaaggcgtt cttggctcag 1260

atcactgctt cttacttgct tggcctgtac ttggctcagc tgcgcggcaa caagttcgct 1320

gatgaggttt cttccattct ggacagcctg cgtgagatgc ctgagaagat tcagcaggtc 1380

atcgatgcag aagagcagat caagaagctt ggccaagata tggcagatgc taagtctgtg 1440

ctgttcctgg gccgccacgt tggtttccca gttgcgcttg agggtgcgtt gaagctcaag 1500

gagatcgcat acctgcacgc tgaaggtttc gctgcaggcg agctcaagca cggcccaatt 1560

gctttggttg aggaaggcca gccgatcttc gttatcgtgc cttcacctcg tggtcgcgat 1620

tccctgcact ccaaggttgt ctccaacatt caggagatcc gtgcacgtgg cgctgtcacc 1680

atcgtgattg cagaggaagg cgatgaggct gtcaacgatt acgccaactt catcatccgc 1740

attcctcagg ccccaaccct gatgcagcct ctgctgtcca ccgtgcctct gcagatcttt 1800

gcgtgcgctg tggcaaccgc aaagggctac aacgtggatc agcctcgtaa cctggcaaag 1860

tctgtcaccg tcgaataa 1878

<210> 9

<211> 1458

<212> DNA

<213> （基因glmU）

<400> 9

ttgagcgcaa gcgatttctc gagcgcagtt gtcgttttgg cagctggtgc cggaacccga 60

atgaaatcag acttacaaaa aacgttgcat agcatcggtg gacgcagtct catttcacat 120

agcttgcatg cagctgccgg gcttaatccc gagcacattg ttgcagtaat tggacatgga 180

cgcgaccagg tgggtccagc cgttgcccag gttgcagaag aactggaccg ggaagtcctc 240

atcgctatcc aagaggaaca aaatggcacg ggacacgctg tgcagtgcgc catggatcag 300

ctcgagggct ttgaaggcac gatcattgtc accaacggcg atgttcccct gctcaccgac 360

cacactctgt ctgcactgct ggatgcacac gtggaagttc caaccgctgt caccgtgttg 420

accatgcgtc tggatgaccc caccggctac ggccgcatcg tgcgcaacga agaaggcgaa 480

gtcaccgcca tcgttgagca aaaagatgct tcagcagaag tccaagccat cgatgaggtc 540

aactccggtg tctttgcttt cgacgccgcc atcttgcgtt ccgcactggc tgaactgaag 600

tccgacaacg ctcagggcga gctgtacctg accgacgtat tgggcattgc tcgtggcgag 660

ggccacccag tgcgcgccca caccgccgcc gatgctcgtg aactcgccgg tgtcaacgat 720

cgtgtgcagc tcgcagaagc cggcgccgaa ctaaaccgtc gcaccgtcat cgccgctatg 780

cgtggtggcg caaccatcgt tgatccagca accacctgga tcgatgtgga ggtttctatc 840

ggccgcgacg tgatcatcca ccctggcacc cagctcaagg gcgaaactgt catcggagac 900

cgcgttgaag ttggtccaga caccaccttg accaacatga ccatcggcga cggcgcatcc 960

gtaatccgca cccacggttt cgactccacc atcggtgaaa acgccaccgt tggccccttc 1020

acctacatcc gcccaggaac cacactggga ccagaaggca agctcggtgg cttcgtagaa 1080

accaagaagg ccacaatcgg ccgtggctcc aaggttccac acctcaccta tgtcggcgac 1140

gccaccatcg gcgaggaatc caacatcgga gcctcctctg tcttcgtgaa ctacgacggt 1200

gaaaacaagc accacaccac catcggcagc cacgttcgca ctggttctga caccatgttt 1260

atcgctccag tgaccgtggg tgacggagcg tattccggag ccggtacagt aattaaagac 1320

gatgttccgc caggagccct tgccgtgtcc ggcggacgcc aacgaaacat cgaaggctgg 1380

gtgcaaaaga agcgccctgg aaccgctgca gcacaagccg cagaagccgc ccaaaacgtc 1440

cacaaccagg aaggctaa 1458

<210> 10

<211> 2463

<212> DNA

<213> （基因Elma）

<400> 10

atgacggtct caaccgaagt tgaccacaac gaatacacag gtaacggcgt tacgacatca 60

tttccgtata ccttccgtat tttcaaaaaa tccgacctgg ttgttcaggt gtctgacctt 120

aacggtaacg ttacaaaact agtgctggat gctggttata cggtaacagg ggcgggaact 180

tatagtggcg gtgcagtggt tcttccgtcg ccgcttgctg ctggctggcg aatcacgata 240

gagcgtgtgc ttgatgtggt gcaggagact gatcttcgca atcagggaaa atttttcccc 300

gaagttcatg aggatgcatt tgactacctg acgatgctga tccagcgatg ttttgggtgg 360

ttcagacgtg cattgatgaa accatctttg cttgcaaaat attacgatgc aaagcaaaac 420

agaatatcta accttgccga tccatcactt gagcaggacg ctgtaaataa tcgctcaatg 480

cgtaattatg tcgatgctgc aatcgccgga gttattggtg gttttggttg gtttattcag 540

tatggttctg gagcggtata cagaacgttc caggataaga tgcgtgatgg tgtcagcatt 600

aaggattttg gagctcaaaa tggaatctta aatgataaca aggatgcttt tacaaaatca 660

ttacattcgt ttagcagtgt ttttgttccg gaaggggtat tcaatacatc tttagtttct 720

ctttcacgtt gtggcttgta cggaacaggt gggggaacga taaaacagta tgacagagat 780

ggtaatcatc tggtttttaa catgcccgat ggtggcatgc ttagtacgct aacaattatg 840

ggaaataaat cagatgatag tgtgcaggga caccaggtgt cattttcagg tggccatgat 900

gtatcggtta aaaatatcag atttacaaat acgcgaggac caggatttag cttgatcgct 960

tatccggata atggtattcc gtcaggttac attgttagag atataagagg agagtattta 1020

gggttcgcaa ataataaaaa agcaggttgt gtgctttttg attcatcgca aaatacgcta 1080

attgatggtg tgatagccag aaattatcct cagtttggtg cagtggaact taaaacagca 1140

gcaaaatata acattgtcag caatgttatt ggtgaagagt gtcagcacgt tgtttacaat 1200

ggaactgaga cggaaactgc cccaacgaat aatatcatta gcagtgtaat ggctaacaac 1260

ccaaaatacg ccgcagtagt tgttggcaag gggactggta acctgatttc ggatgtgctg 1320

gttgattact ctgaatcgga cgcaaagcag gcgcacggcg tcaccgttca gggaaataat 1380

aatattgcca gtaatattct aatgactggg tgtgatggga aaaatgaatc aggagatctg 1440

cagacatcta caaccattcg tttcttagat gctgcacgca gtaattatgc gtcaatattc 1500

cccatgtata gttcttccgg cgtggttacc ttcgaggaag ggtgtatcag gaactttgtt 1560

gaaattaaac atccgggtga cagaaataat attctgagtt ctgcatcagc ggtgactggt 1620

atttccagta tagacggcac tacaaatagc aatgttgttc acgtccctgc gcttggtcag 1680

tacgttggga ctatgtcagg gcgttttgaa tggtgggtta aatattttaa ccttgctaac 1740

cagacgcttg tttctgcaga taaattcaga atgcttgctg aaggcgatgt atctctggct 1800

gtgggaggcg gtataagttc gcaattgaaa ttattcaata gtgataatac taaaggcact 1860

atgtcgctaa taaatggaaa tattcgaata tctactggaa attcagaata tatacagttt 1920

tctgattcag ccatgacacc atcgacaacg aatacttatt ctcttgggtt ggctggtcgt 1980

gcatggtcgg ggggatttac ccagtcagcg tttacggtgc tgtccgatgc gcgtttcaag 2040

actgctccag aggttattga tgagaaaata ctggacgcat gggaaagagt ggaatgggtt 2100

tcataccagt accttgacag gatcgaagtg aaaggtaaag acggagcaag atggcacttt 2160

ggtgcagttg cgcagcatgt tatcagtgta tttcagaatg aaggcataga tgtgtcacga 2220

ctggcattta tctgttatga caagtggaat gagaccccgg cagaatacag ggatgtgacg 2280

gaagaagagc attctgcagg agtttaccca cttatacaga caaaggttct ggtacgcgaa 2340

gccgtcgagg ctggtgaatg ttacggtatc cgttatgaag aggctctgat tctggaatct 2400

gcgatgatga gacgcagggt taaaaagctg gaagagcaag ttttgcaatt aacagggaat 2460

tga 2463

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> （引物EcoRI-KfiA-F）

<400> 11

ggaattcaag gaggatatac atatgattgt tgcaaatatg tcatcatacc ca 52

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> （引物KpnI-KfiA-R）

<400> 12

ggggtacctt acccttccac attatacact aattcgag 38

<210> 13

<211> 55

<212> DNA

<213> （引物XbaI-KfiC-F）

<400> 13

gctctagaaa ggaggatata catatgaacg cagaatatat aaatttagtt gaacg 55

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> （引物SbfI-KfiC-R）

<400> 14

gcctgcaggc tattgttcaa ttattcctga tacatct 37

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> （引物Sma I-kfiB-F）

<400> 15

tcccccggga aggaggatat acatatgatg aataaattag tgctagtcgg ac 52

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> （引物Sma I-kfiB-R）

<400> 16

tcccccgggt taacagccct tgattttagc tctcc 35

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> （引物Sbf I-kfiD-F）

<400> 17

gcctgcagga aggaggatat acatatgttc ggaacactaa aaataactgt ttc 53

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> （引物Sbf I-kfiD-R）

<400> 18

gcctgcaggt tagtcacatt taaacaaatc gcgac 35

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> （引物SacI-hasB-F）

<400> 19

cgagctcaag gaggatatac atatgaaaat tgccgtcgca g 41

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> （引物SacI-hasB-R）

<400> 20

cgagctctta gtcacgctgg aaaatatcac g 31

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物SbfI-glmS-F）

<400> 21

gcctgcagga aggaggatat acatatgcgc atgtgtggaa ttgttggat 49

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> （引物SbfI-glmS-R）

<400> 22

gcctgcaggt tattcgacgg tgacagactt tgcca 35

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> （引物SbfI-glmU-F）

<400> 23

gcctgcagga aggaggatat acatatgagc gcaagcgatt tctc 44

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> （引物SbfI-glmU-R）

<400> 24

gcctgcaggt tagccttcct ggttgtggac gtttt 35

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> （引物KpnI-glmS-F）

<400> 25

ggggtaccaa ggaggatata catatgcgca tgtgtggaat tgttggat 48

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> （引物KpnI-glmS-R）

<400> 26

ggggtacctt attcgacggt gacagacttt gcca 34

<210> 27

<211> 1854

<212> DNA

<213> （基因PmHS1）

<400> 27

atgagcttat ttaaacgtgc tactgagcta tttaagtcag gaaactataa agatgcacta 60

actctatatg aaaatatagc taaaatttat ggttcagaaa gccttgttaa atataatatt 120

gatatatgta aaaaaaatat aacacaatca aaaagtaata aaatagaaga agataatatt 180

tctggagaaa acaaattttc agtatcaata aaagatctat ataacgaaat aagcaatagt 240

gaattaggga ttacaaaaga aagactagga gccccccctc tagtcagtat tataatgact 300

tctcataata cagaaaaatt cattgaagcc tcaattaatt cactattatt gcaaacatac 360

aataacttag aagttatcgt tgtagatgat tatagcacag ataaaacatt tcagatcgca 420

tccagaatag caaactctac aagtaaagta aaaacattcc gattaaactc aaatctaggg 480

acatactttg cgaaaaatac aggaatttta aagtctaaag gagatattat tttctttcag 540

gatagcgatg atgtatgtca ccatgaaaga atcgaaagat gtgttaatgc attattatcg 600

aataaagata atatagctgt tagatgtgca tattctagaa taaatctaga aacacaaaat 660

ataataaaag ttaatgataa taaatacaaa ttaggattaa taactttagg cgtttataga 720

aaagtattta atgaaattgg tttttttaac tgcacaacca aagcatcgga tgatgaattt 780

tatcatagaa taattaaata ctatggtaaa aataggataa ataacttatt tctaccactg 840

tattataaca caatgcgtga agattcatta ttttctgata tggttgagtg ggtagatgaa 900

aataatataa agcaaaaaac ctctgatgct agacaaaatt atctccatga attccaaaaa 960

atacacaatg aaaggaaatt aaatgaatta aaagagattt ttagctttcc tagaattcat 1020

gacgccttac ctatatcaaa agaaatgagt aagctcagca accctaaaat tcctgtttat 1080

ataaatatat gctcaatacc ttcaagaata aaacaacttc aatacactat tggagtacta 1140

aaaaaccaat gcgatcattt tcatatttat cttgatggat atccagaagt acctgatttt 1200

ataaaaaaac tagggaataa agcgaccgtt attaattgtc aaaacaaaaa tgagtctatt 1260

agagataatg gaaagtttat tctattagaa aaacttataa aggaaaataa agatggatat 1320

tatataactt gtgatgatga tatccggtat cctgctgact acataaacac tatgataaaa 1380

aaaattaata aatacaatga taaagcagca attggattac atggtgttat attcccaagt 1440

agagtcaaca agtatttttc atcagacaga attgtctata attttcaaaa acctttagaa 1500

aatgatactg ctgtaaatat attaggaact ggaactgttg cctttagagt atctattttt 1560

aataaatttt ctctatctga ttttgagcat cctggcatgg tagatatcta tttttctata 1620

ctatgtaaga aaaacaatat actccaagtt tgtatatcac gaccatcgaa ttggctaaca 1680

gaagataaca aaaacactga gaccttattt catgaattcc aaaatagaga tgaaatacaa 1740

agtaaactca ttatttcaaa caacccttgg ggatactcaa gtatatatcc attattaaat 1800

aataatgcta attattctga acttattccg tgtttatctt tttataacga gtaa 1854

<210> 28

<211> 1956

<212> DNA

<213> （基因PmHS2）

<400> 28

atgaagggaa aaaaagagat gactcaaatt caaatagcta aaaatccacc ccaacatgaa 60

aaagaaaatg aactcaacac ctttcaaaat aaaattgata gtctaaaaac aactttaaac 120

aaagacatca tttctcaaca aactttattg gcaaaacagg acagtaaaca tccgctatcc 180

gcatcccttg aaaacgaaaa taaactttta ttaaaacaac tccaattggt tctgcaagaa 240

tttgaaaaaa tatataccta taatcaagca ttagaagcaa agctagaaaa agataagcaa 300

acaacatcaa taacagattt atataatgaa gtcgctaaaa gtgatttagg gttagtcaaa 360

gaaactaaca gcgcaaatcc attagtcagt attatcatga catctcacaa tacagcgcaa 420

tttatcgaag cttctattaa ttcattattg ttacaaacat ataaaaacat agaaattatt 480

attgtagatg atgatagctc ggataataca tttgaaattg cctcgagaat agcgaatacg 540

acaagcaaag tcagagtatt tagattaaat tcaaacctag gaacttactt tgcgaaaaat 600

acaggcatat taaaatctaa aggtgacatt attttctttc aagatagtga tgatgtatgt 660

catcatgaaa gaatagaaag atgtgtaaat atattattag ctaataaaga aactattgct 720

gttcgttgtg catactcaag actagcacca gaaacacaac atatcattaa agtcaataat 780

atggattata gattaggttt tataaccttg ggtatgcaca gaaaagtatt tcaagaaatt 840

ggtttcttca attgtacgac taaaggctca gatgatgagt tttttcatag aattgcgaaa 900

tattatggaa aagaaaaaat aaaaaattta ctcttgccgt tatactacaa cacaatgaga 960

gaaaactctt tatttactga tatggttgaa tggatagaca atcataacat aatacagaaa 1020

atgtctgata ccagacaaca ttatgcaacc ctgtttcaag cgatgcataa cgaaactgcc 1080

tcacatgatt tcaaaaatct ttttcaattc cctcgtattt acgatgcctt accagtacca 1140

caagaaatga gtaagttgtc caatcctaag attcctgttt atatcaatat ttgttctatt 1200

ccctcaagaa tagcgcaatt acgacgtatt atcggcatac taaaaaatca atgtgatcat 1260

tttcatattt atcttgatgg ctatgtagaa atccctgact tcataaaaaa tttaggtaat 1320

aaagcaaccg ttgttcattg caaagataaa gataactcca ttagagataa tggcaaattc 1380

attttactgg aagagttgat tgaaaaaaat caagatggat attatataac ctgtgatgat 1440

gacattatct atccaagcga ttacatcaat acgatgatca agaagctgaa tgaatacgat 1500

gataaagcgg ttattggttt acacggcatt ctctttccaa gtagaatgac caaatatttt 1560

tcggcggata gactggtata tagcttctat aaacctctgg aaaaagacaa agcggtcaat 1620

gtattaggta caggaactgt tagctttaga gtcagtctct ttaatcaatt ttctctttct 1680

gactttaccc attcaggcat ggctgatatc tatttctctc tcttgtgtaa gaaaaataat 1740

attcttcaga tttgtatttc aagaccagca aactggctaa cagaagataa tagagacagc 1800

gaaacactct atcatcaata tcgagacaat gatgagcaac aaactcagct gatcatggaa 1860

aacggtccat ggggatattc aagtatttat ccattagtca aaaatcatcc taaatttact 1920

gaccttatcc cctgtttacc tttttatttt ttataa 1956

<210> 29

<211> 1665

<212> DNA

<213> （基因pgm）

<400> 29

atggcacatg aacgcgccgg gcaactcgcc caaccagaag atctcatcga tgttgcggaa 60

ctggtcaccg catatttcac ccgcaagccg gacgtgaaca accctgatca gcaggtcgct 120

ttcggcacct ccggacaccg tggctccgcg ctggacagcg ctttcaacga ggaccacatc 180

ctggcaacca cccaggcgat cgtcgactac cgcaaccagc agccaaaaaa ctgggtcggc 240

ccgctgttta tcggccgcga tacgcacgcg ctgtccgaac cagcgatgat cagcgcgctt 300

gaggtcctca ttgccaacga cgtcgaagtg cttgtcgacg ccgacggccg ctacaccccg 360

acgcccgcag tgtcccacgc gatcctacga cacaacgatg gcatcatcct tggcaccgca 420

ggaccctccc gcccctacgc cgacggcatc gtgatcaccc catcccacaa ccctcctcgt 480

gatggcggat tcaaatacaa cccagccaac ggtggccctg cagataccga cgccaccgac 540

tggatcgcca accgcgccaa cgatattctg cgcggcgacc ttgcagacgt gaagcgagtt 600

ccagtttccg gtgtcctcga cgagcgcacc actgcctacg acttcaaggg catttacatc 660

gctgacctgc caaacgtggt caacatcgat gccatccgcg aagctggtgt tcgaatcggc 720

gcagacccaa tgggtggcgc atccgtggat tactggggtg ccatcgcaga aacccatggc 780

ctcaacctca ccgtggtcaa cccacacgtt gattccacct tccgcttcat gacattggac 840

accgacggca agatccgcat ggactgctcc agcccacacg caatggcatc gctgattgac 900

aaccgagaca agttcgatgt ggcaaccggc aacgacgccg acgccgaccg ccacggcatc 960

gtcaccccag acgctggctt gatgaacccc aaccactacc tcgcagtagc aattgagtac 1020

ctctttgctc accgcccagg ttggtccgca gataccgcag tgggcaaaac cctggtcagc 1080

tcctccatga tcgaccgcgt tgtggcgcag cttggccgca ccctcgttga ggttccagtc 1140

ggattcaagt ggtttgtccc aggtttgatc tccggcgaaa tcggattcgg tggtgaagaa 1200

tccgcaggtg catccttcct ccgcatggac ggcaccacct ggtccaccga caaggacggc 1260

ctcatccttg acctcctggc agctgagatc attgcagtaa ccggcaagac cccatcacag 1320

cgctacgcag aactcgccga agaattcggt gcacctgcct acgcccgcac cgatgcagaa 1380

gccaaccgag aacaaaaggc catcctgaag gcactgtccc cagaacaggt caccgccacc 1440

gaactagccg gcgaagcaat caccgctaag ctcaccgaag ctcccggcaa tggcgcagcc 1500

atcggaggac taaaagtgac caccgaaaac gcctggttcg cagcacgccc atccggcacc 1560

gaagacaagt acaagatcta cgcagaatcc ttcaagggcg aagagcacct cgcccaggtt 1620

cagaaggaag cccaagcgtt ggtcagcgaa gtactcggac agtaa 1665

<210> 30

<211> 924

<212> DNA

<213> （基因galU）

<400> 30

atgagtttgc caatagctca gcatcaaaat gctgtaaaaa ctgtcgtggt accagctgca 60

ggaatgggaa cacggttcct tcctgcaacg aagacaattc caaaggagct tcttcctgta 120

gttgataccc cgggtattga acttgttgcc aaagaggctg ctgatcttgg tgcaactcgg 180

ttagcaatta tcactgctcc gaacaaagac ggaattctta aacacttcga ggagttccct 240

gagcttgagg caactcttga ggctcgcggt aagactgatc aactgaataa agttcgagca 300

gctcgagaat tgattgcaac agttccagtg gttcaagaaa agccattggg gcttggtcac 360

gctgttggcc ttgctgagtc tgtgctcgat gatgatgaag atgttgtggc tgtcatgctg 420

ccagacgatt tggtgctgcc atttggtgtg accgagagaa tggcagaagt tcgcgctaag 480

tttggcggat ctgttcttgc agcaattgag gtggctgaag atgaagtctc aaattacgga 540

gtatttaagc tcggtgaact cgatgcagag tccgaaagtg aaggcattag gcgtgttgta 600

ggaatggttg aaaagcctgc gcctgaagat gcaccatcaa ggtttgccgc aacgggccgt 660

tatctacttg atcgagctat ttttgatgca ctgcgtcgaa ttgagcctgg tgctggtgga 720

gaactgcaat taacagatgc catcgcatta ttgatcgaag aaggccatcc ggtacacatt 780

gtggttcatg aaggaaagcg ccatgacctt ggtaatccag ctgggtacat tcctgctgtt 840

gtgtacttcg gacttcgtca tgcagagtac ggttccaaga ttcaccgtgc ggtgaaggaa 900

atactcgctg agtttgaatc ttaa 924

<210> 31

<211> 1344

<212> DNA

<213> （基因mrsA）

<400> 31

atgactcgac tatttggaac tgatggcgtc cgcggactag ccaatgaagt actcaccgca 60

cctttggcct tgaagctggg ggccgctgca gctcacgtac ttaccgcaga gaaacgggta 120

gatggacgtc gcccggttgc gatcgttggt agggatcctc gagtctctgg agagatgctc 180

gcggcagcac tttcagcagg catggccagc cagggtgttg atgtcattcg tgttggtgtc 240

atcccaaccc ctgctgttgc attcctcacc gatgattatg gcgctgacat gggcgtgatg 300

atttctgcat cccacaaccc aatgccggac aacggaatca agttcttctc tgcaggtgga 360

cacaagcttc cagaccatgt ggaagacgag attgagcgtg ttatggacag cttgccagca 420

gaaggcccaa cagggcatgg agttggccgt gtcatcgaag aagcaaccga tgcacaggac 480

cgttacctag agcacctgaa ggaagctgtt cctacgtcac ttgaaggcat caagattgtt 540

gtggatgcag ccaatggtgc ggcaagtgtt gtagctccaa cggcttatga ggctgcgggt 600

gcaactgtaa ttgctattca taacaagcca gactcataca acatcaacat ggactgcggt 660

tccacccaca ttgatcaggt gcaggcggca gtcctgaagc acggtgctga ccttggactc 720

gcgcatgacg gtgatgctga ccgttgtttg gctgtggaca aggatggcaa ccttgttgat 780

ggtgaccaaa tcatggcgct gttagccatt gcgatgaaag aaaacggcga gctgcgcaag 840

aacaccctcg tgggcactgt catgagcaac ctgggattga agattgctat ggatgaagcc 900

ggaattacac tgcgtaccac caaggtagga gaccgctacg tgctggaaga cctcaatgca 960

ggtggattca gcctgggcgg cgagcaatct ggccacattg ttcttccaga tcatggcacc 1020

actggcgatg gaactttgac tggtctttcc atcatggcgc gcatggctga aaccggaaag 1080

tccttgggcg agttggcaca agctatgacg gtgctgccac aggttctgat caatgtgcca 1140

gtttcggata agtccaccat cgtgagccac ccaagcgttg tggctgcgat cgcggaagca 1200

gaagctgagt tgggcgccac cggtcgcgtt cttcttcgtg cttctggcac cgaagagctt 1260

ttccgcgtga tggttgaggc tggagacaag gaacaagctc gtcgtatcgc gggacgtctt 1320

gctgcagtgg ttgcagaagt ctaa 1344

<210> 32

<211> 1623

<212> DNA

<213> （基因pgi）

<400> 32

atggcggaca tttcgaccac ccaggtttgg caagacctga ccgatcatta ctcaaacttc 60

caggcaacca ctctgcgtga acttttcaag gaagaaaacc gcgccgagaa gtacaccttc 120

tccgcggctg gcctccacgt cgacctgtcg aagaatctgc ttgacgacgc caccctcacc 180

aagctccttg cactgaccga agaatctggc cttcgcgaac gcattgacgc gatgtttgcc 240

ggtgaacacc tcaacaacac cgaagaccgc gctgtcctcc acaccgcgct gcgccttcct 300

gccgaagctg atctgtcagt agatggccaa gatgttgctg ctgatgtcca cgaagttttg 360

ggacgcatgc gtgacttcgc tactgcgctg cgctcaggca actggttggg acacaccggc 420

cacacgatca agaagatcgt caacattggt atcggtggct ctgacctcgg accagccatg 480

gctacgaagg ctctgcgtgc atacgcgacc gctggtatct cagcagaatt cgtctccaac 540

gtcgacccag cagacctcgt ttctgtgttg gaagacctcg atgcagaatc cacattgttc 600

gtgatcgctt cgaaaacttt caccacccag gagacgctgt ccaacgctcg tgcagctcgt 660

gcttggctgg tagagaagct cggtgaagag gctgtcgcga agcacttcgt cgcagtgtcc 720

accaatgctg aaaaggtcgc agagttcggt atcgacacgg acaacatgtt cggcttctgg 780

gactgggtcg gaggtcgtta ctccgtggac tccgcagttg gtctttccct catggcagtg 840

atcggccctc gcgacttcat gcgtttcctc ggtggattcc acgcgatgga tgaacacttc 900

cgcaccacca agttcgaaga gaacgttcca atcttgatgg ctctgctcgg tgtctggtac 960

tccgatttct atggtgcaga aacccacgct gtcctacctt attccgagga tctcagccgt 1020

tttgctgctt acctccagca gctgaccatg gaatcaaatg gcaagtcagt ccaccgcgac 1080

ggctcccctg tttccactgg cactggcgaa atttactggg gtgagcctgg cacaaatggc 1140

cagcacgctt tcttccagct gatccaccag ggcactcgcc ttgttccagc tgatttcatt 1200

ggtttcgctc gtccaaagca ggatcttcct gccggtgagc gcaccatgca tgaccttttg 1260

atgagcaact tcttcgcaca gaccaaggtt ttggctttcg gtaagaacgc tgaagagatc 1320

gctgcggaag gtgtcgcacc tgagctggtc aaccacaagg tcatgccagg taatcgccca 1380

accaccacca ttttggcgga ggaacttacc ccttctattc tcggtgcgtt gatcgctttg 1440

tacgaacaca tcgtgatggt tcagggcgtg atttgggaca tcaactcctt cgaccaatgg 1500

ggtgttgaac tgggcaaaca gcaggcaaat gacctcgctc cggctgtctc tggtgaagag 1560

gatgttgact cgggagattc ttccactgat tcactgatta agtggtaccg cgcaaatagg 1620

tag 1623

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物XbaI-pgm-F）

<400> 33

gctctagaaa ggaggatata catatggcac atgaacgcgc cgggcaact 49

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> （引物XbaI-pgm-R）

<400> 34

gctctagatt actgtccgag tacttcgctg accaacg 37

<210> 35

<211> 51

<212> DNA

<213> （引物XbaI-galU-F）

<400> 35

gctctagaaa ggaggatata catatgagtt tgccaatagc tcagcatcaa a 51

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> （引物XbaI-galU-R）

<400> 36

gctctagatt aagattcaaa ctcagcgagt att 33

<210> 37

<211> 48

<212> DNA

<213> （引物XbaI-pgi-F）

<400> 37

gctctagaaa ggaggatata catatggcgg acatttcgac cacccagg 48

<210> 38

<211> 34

<212> DNA

<213> （引物XbaI-pgi-R）

<400> 38

gctctagact acctatttgc gcggtaccac ttaa 34

<210> 39

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物XbaI-mrsA-F）

<400> 39

gctctagaaa ggaggatata catatgactc gactatttgg aactgatgg 49

<210> 40

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物XbaI-mrsA-R）

<400> 40

gctctagatt agacttctgc aaccactgca gc 32

<210> 41

<211> 51

<212> DNA

<213> （引物SbfI-PmHS1-F）

<400> 41

gcctgcagga aggaggatat acatatgagc ttatttaaac gtgctactga g 51

<210> 42

<211> 36

<212> DNA

<213> （引物SbfI-PmHS1-R）

<400> 42

gcctgcaggt tactcgttat aaaaagataa acacgg 36

<210> 43

<211> 50

<212> DNA

<213> （引物SbfI-PmHS2-F）

<400> 43

gcctgcagga aggaggatat acatatgaag ggaaaaaaag agatgactca 50

<210> 44

<211> 37

<212> DNA

<213> （引物SbfI-PmHS2-R）

<400> 44

gcctgcaggt tataaaaaat aaaaaggtaa acagggg 37

Claims (13)

1.一种产heparosan的基因工程菌，其为含有heparosan合成酶基因的谷氨酸棒状杆菌；

所述产heparosan的基因工程菌中还共表达了heparosan合成途径的关键基因；所述heparosan合成途径的关键基因包括UDP-GlcA合成基因模块；所述UDP-GlcA合成基因模块包含以下基因：hasB和kfiD；

所述产heparosan的基因工程菌中还含有产生低分子量heparosan的裂解酶基因；其能够特异性的酶解heparosan，直接合成分子量为2-10 kD的低分子量heparosan；所述裂解酶基因编码裂解酶；所述裂解酶为肝素酶II和肝素酶III中的至少一种；

所述heparosan合成酶基因包括来源于E.coli K5的糖基转移酶基因kfiA和kfiC。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述heparosan合成酶基因还包括源于巴斯德菌的heparosan合成酶基因PmHS1和/或PmHS2。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述产heparosan的基因工程菌为经过底盘微生物改造的产heparosan的基因工程菌；所述底盘微生物改造包括竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化；所述竞争代谢途径相关基因包括糖酵解途径相关基因、磷酸戊糖途径相关基因和乳酸途径相关基因。

4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产heparosan的基因工程菌为经过底盘微生物改造的产heparosan的基因工程菌；所述底盘微生物改造包括竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化；所述竞争代谢途径相关基因包括糖酵解途径相关基因、磷酸戊糖途径相关基因和乳酸途径相关基因。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中的heparosan合成酶经过了产生低分子量heparosan的酶活调控；所述调控的手段包括RBS调控策略和/或者酶修饰。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌所合成的heparosan存在于胞内和/或胞外。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌所合成的heparosan存在于胞内。

8.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中还含有将胞内产物转运至胞外的heparosan转运系统。

9.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中还含有将胞内产物转运至胞外的heparosan转运系统。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的基因工程菌在制备heparosan中的应用，所述heparosan为低分子量heparosan；低分子量heparosan的分子量为2-10 kD。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌进行发酵培养，制备heparosan；发酵诱导条件为：IPTG诱导浓度为0.4-2.0mM；和/或，诱导温度为24-34℃。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，发酵诱导条件为：IPTG诱导浓度为0.8-1.2 mM；和/或，诱导温度为28-32℃。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，诱导温度为30-32℃。

Images