CN114107152B

CN114107152B - 一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN114107152B
Application number: CN202111404385.4A
Authority: CN
Inventors: 沐万孟; 张文立; 陈耕; 朱莺莺; 吴昊
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-11-24
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-11-24
Also published as: CN114107152A

Abstract

本发明公开了一种高产3‑岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明通过筛选高效的α‑1,3‑岩藻糖基转移酶基因，并通过组合调控3‑岩藻糖基乳糖合成途径中manC、manB、wcaG和gmd在大肠杆菌中的表达，使大肠杆菌拥有生产3‑岩藻糖基乳糖的合成能力，并能够精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力。在摇瓶实验中，大肠杆菌生产3‑岩藻糖基乳糖的能力为2.01g/L，在3L发酵罐中，3‑岩藻糖基乳糖的产量达到20.3g/L，具备良好工业应用的前景。

Description

一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术

母乳寡糖对婴幼儿的智力发育、肠道健康、促进免疫力等方面起着重要的作用，其中被岩藻糖基化修饰的中性母乳寡糖占比最高，主要包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)。大量文献集中报道这两种岩藻糖基乳糖对婴幼儿的健康具有明显的促进作用，因此受到广泛关注，具备应用于婴幼儿产品的广泛前景。3-FL的合成研究对HMO的商业化应用至关重要，尤其是寻找到高效率、低成本、绿色环保的合成路线。近年来，3-FL的生物制备研究发展迅速，并体现出优于化学合成路线的诸多特性。因此3-FL的高效生产的方法急需开发，为生成更多有价值的母乳寡糖的合成奠定重要基础。

目前针对3-FL合成的研究主要为化学合成，酶法和微生物合成方法均较少。化学法合成通常需要引入保护基团，步骤繁冗，且存在保护不到位，后续脱除不彻底及发生其他副反应的问题，而且常需要使用有毒有害试剂。相比之下，生物法合成由于酶与底物的特异性高，底物廉价，合成步骤简化，副产物少，产率大大提高，更适合大规模的工业化生产。目前主要是采用微生物发酵法来合成3-岩藻糖基乳糖。微生物发酵法合成3-岩藻糖基乳糖需要一个关键的能催化前体乳糖和GDP-L-岩藻糖转化的α-1,3-岩藻糖基转移酶。目前α-1,3-岩藻糖基转移酶大多来自幽门螺旋杆菌，来源较为单一，且可溶性表达较弱。目前使用的微生物方法合成的3-岩藻糖基乳糖产量均较低，目前已报道的α-1,3-岩藻糖基转移酶的来源可能是一个限制因素，都不能达到工业化大规模生产的要求，因此，为了解决目前微生物生产的瓶颈，筛选出其他来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶是解决3-岩藻糖基乳糖产量问题的一个重要步骤。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，发明人筛选到了一种来源于Bacteroidesgallinaceum的α-1,3-岩藻糖基转移酶，此酶在其他报道里只是提到这是个糖基转移酶，而还未发现其是3-岩藻糖基转移酶，本申请通过研究之后发现此酶以乳糖和GDP-L-岩藻糖为底物，生产3-岩藻糖基乳糖，可显著提升3-岩藻糖基乳糖的产量。

本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌表达了来源于Bacteroidesgallinaceum的α-1,3-岩藻糖基转移酶，表达磷酸甘露糖变位酶的基因，表达甘露糖-6-磷酸异构酶的基因，表达GDP-L-岩藻糖合成酶的基因，表达GDP-D-甘露糖脱氢酶；并且敲除编码β-半乳糖苷酶的基因、编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因。

在一种实施方式中，编码所述磷酸甘露糖变位酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在一种实施方式中，编码所述甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

在一种实施方式中，编码所述GDP-L-岩藻糖合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

在一种实施方式中，编码所述GDP-D-甘露糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1、pRSFDuet-1，或pETDuet-1载体表达编码α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因；利用pCDFDuet-1、pRSFDuet-1，或pETDuet-1载体共同表达编码磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、GDP-D-甘露糖脱氢酶的基因。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供了一种生产3-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法是利用所述重组大肠杆菌发酵生产3-岩藻糖基乳糖。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌在35～40℃、180～220rpm培养得到种子液，将种子液按体积比2％～5％量加入含有甘油的发酵体系中，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG和乳糖，使得IPTG和乳糖在反应体系中的浓度分别为0.1～0.5mM、3～5g/L，在22～28℃下诱导培养不少于72h。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌在35～40℃、180～220rpm培养得到种子液，将种子液按体积比5～10％的量加入发酵体系中，培养至OD₆₀₀为15±3，加入IPTG和乳糖，使得IPTG和乳糖在反应体系中的浓度分别为0.1～0.5mM、5～10g/L，在22～28℃下诱导培养不少于33h。

在一种实施方式中，培养时间不少于38h，或不少于45h，或不少于52h。

在一种实施方式中，反应过程中补加乳糖和甘油，以维持甘油浓度不低于10g/L，乳糖浓度不低于5g/L。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的α-1,3-岩藻糖基转移酶在制备3-岩藻糖基乳糖及其衍生物中的应用。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的α-1,3-岩藻糖基转移酶在制备含有3-岩藻糖基乳糖的产品或是含有3-岩藻糖基乳糖衍生物的产品中的应用。

在一种实施方式中，以乳糖和GDP-L-岩藻糖为底物，利用所述α-1,3-岩藻糖基转移酶，生产3-岩藻糖基乳糖及其衍生物。

本发明提供了所述重组大肠杆菌在食品、化工、医药领域中的应用。

本发明提供了所述重组大肠杆菌在制备3-岩藻糖基乳糖及其衍生产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明从目前报道的具有岩藻糖基转移酶功能的9个酶中筛选到一株能够高效生产的α-1,3-岩藻糖基乳糖的酶，并应用于发酵生产3-岩藻糖基乳糖。在敲除了UDP-葡萄糖脂质载体转移酶和β-半乳糖苷酶编码基因的大肠杆菌宿主基础上，过表达筛选的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2和manC、manB、gmd和wcaG基因，高效生产3-岩藻糖基乳糖。在摇瓶实验中，大肠杆菌生产3-岩藻糖基乳糖的能力为2.01g/L，在3-L发酵罐中，3-岩藻糖基乳糖的产量达到20.3g/L，具备工业应用的前景。

附图说明

图1为3-岩藻糖基乳糖代谢通路图；

图2为3-岩藻糖基转移酶胞内筛选图；

图3为代谢通路在不同拷贝数质粒调节下的3-岩藻糖基乳糖的产量图；

图4为产物3-岩藻糖基乳糖标样和产物样品液相图和质谱图；

图5为代谢通路在不同诱导剂IPTG添加量和诱导温度下的3-岩藻糖基乳糖的产量图；

图6为3L发酵罐中3-岩藻糖基乳糖的发酵产量结果图。

具体实施方式

1、以下实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2、菌落PCR，核酸琼脂糖凝胶电泳，蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳，热击转化，电转化和感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition)进行。

3、质粒和DNA产物的测序工作交予上海生工生物工程公司完成。

4、大肠杆菌感受态的制备：TAKARA试剂盒。

5、3-岩藻糖基乳糖发酵过程及检测：

(1)LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

(2)LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉。

(3)甘油限定培养基中含有13.5g/L KH₂PO₄、4.0g/L(NH4)₂HPO₄、1.7g/L柠檬酸、1.4g/L MgSO₄·7H₂O和10mL/L微量元素溶液，该培养基pH为6.8。

(4)发酵培养基：20g/L葡萄糖，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。

(5)3-岩藻糖基乳糖发酵过程：将构建的菌株接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，将种子液以2mL/100mL的接种量接入25ml发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.2mM IPTG，同时加入5g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养96h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。

(6)HPLC检测条件：高效液相色谱；色谱柱：Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)(300x7.8mm)；检测器：示差检测器；流动相：5mM硫酸；进样量：10μL。

实施例1：α1,3-FucT的胞内筛选

以已报道的α1,3-岩藻糖基转移酶(α1,3-FucT)为查询依据，使用BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)进行基因序列查询，对查询结果进行选择，共选择9个同源性大于20％的假定编码α1,3-FucT的基因序列初步筛选得到的9个编码α1,3-FucT的基因序列。

将上述基因序列连接至pETDuet载体，再转入大肠杆菌BL21中，分别得到工程菌株B-A1、B-J1、B-J2、B-M1、B-M2、B-H1、B-H4、B-D1、B-D2，将得到的工程菌株将工程大肠杆菌细胞在37℃、4mL LB培养基中过夜预培养，然后以2％(v/v)的接种量将其作为种子液接种到25mL的限定培养基中，并在37℃和200rpm下培养，当细胞密度(OD₆₀₀)达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM、5g/L的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)和乳糖。此外，在25℃、200rpm的条件下进一步培养。按照按上述培养条件进行培养，分别在24h、48h和72h对发酵液进行取样，采用紫外分光光度合计对其OD进行检测，通过质谱法对产物3-FL进行定性分析，样品通过8000r/min 3min离心收集，上清通过高效液相色谱色谱柱Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)(300x7.8mm)，对产物3-FL定量。根据不同酶的3-FL产量对选择的酶进行筛选，结果如图2所示，选择产量高的M2来进行3-FL的生产。

实施例2：重组载体的构建

重组表达载体构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：

(1)futM2基因片段的获得以及质粒pCD-futM2，pET-futM2和pRSF-futM2的构建：

以鸡拟杆菌(Bacteroides gallinaceum)futM2基因序列(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)为模板，以pET-FutM2-F/R为引物，PCR扩增出futM2基因片段，胶回收DNA片段；以pET-FutM2-V-F/R为引物，分别以pRSFDuet-1，pETDuet-1和pCDFDuet-1载体为模板，扩增出相应的载体片段，胶回收DNA片段。

将上述扩增得到的futM2基因片段和对应的载体片段通过Gibson试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，分别获得质粒pCD-futM2，pET-futM2和pRSF-futM2。

(2)质粒pCD-CBGW的构建

分别以表达磷酸甘露糖变位酶ManB的基因manB，表达甘露糖-6-磷酸异构酶ManC的基因manC，表达GDP-L-岩藻糖合成酶WcaG的基因wcaG，表达GDP-D-甘露糖脱氢酶Gmd的基因gmd为模板，以pCD-manB-F/R、pCD-manC-F/R、pCD-wcaG-F/R、pCD-gmd-F/R为引物，PCR扩增出manB、manC、wcaG、gmd基因片段，胶回收DNA片段，以pCD-CBGW-V-F/R为引物，PCR扩增出载体片段，胶回收DNA片段。

将上述扩增得到的manB、manC、wcaG和gmd基因片段和对应的载体片段通过Gibson试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，获得质粒pCD-CBGW。

(3)质粒pET-CBGW和pRSF-CBGW的构建

以质粒pCD-CBGW为模板，分别以pET-CBGW-F/R、pRSF-CBGW-F/R为引物，分别PCR扩增出片段manB-manC-wcaG-gmd，胶回收DNA片段；以pRSFDuet-1，pETDuet-1为模板，以pET-CBGW-V-F/R、pRSF-CBGW-V-F/R为引物，分别PCR扩增出载体片段，胶回收DNA片段。

将扩增得到的片段manB-manC-wcaG-gmd与扩增得到的相应的载体片段，采用Gibson组装法构建得到，获得质粒pET-CBGW和pRSF-CBGW。

表1质粒构建引物

实施例3：重组菌株的构建

敲除大肠杆菌BL21中编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶wcaJ(NCBI序列号为CAD6004140.1)的基因wcaJ以及编码β-半乳糖苷酶LacZ(NCBI序列号为NP_414878.1)的基因lacZ，基因的敲除方法具体参见公开号为CN111979168A的专利，构建得到重组菌。

在上述重组菌的基础上，将实施例1所构建得到的重组质粒转入上述敲除了基因wcaJ，lacZ的大肠杆菌重组菌中，组合表达3-岩藻糖基乳糖基因，得到了6个不同的工程菌，分别表示为E01～06。构建得到的重组菌如表2所示。

实施例4：重组菌发酵生产3-岩藻糖基乳糖

质粒pRSFDuet-1具有较高的拷贝数，质粒pETDuet-1有中等的拷贝数，而质粒pCDFDuet-1具有较低拷贝数。其中RSF，ColE1和CDF分别是表达质粒pRSFDuet-1，pETDuet-1和pCDFDuet-1的复制子，代表不同的拷贝数，三者的拷贝数分别为100，40和20-40。

将实施例2中构建的菌株分别接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，将种子液以2mL/100mL的接种量接入25mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.2mM IPTG，同时加入5g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养96h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。

结果如表2所示：发酵后不同工程菌株3-岩藻糖基乳糖的产量分别为0.47g/L，0.08g/L，2.01g/L，0.13g/L，0.76g/L和0.09g/L。其中含有重组质粒pCD-CBGW和pET-futM2的工程菌(即菌株E03)获得了2.01g/L的最高产量(各工程菌株3-岩藻糖基乳糖产量参见图3)。因此，表达相对较低的基因剂量的manB-manC和wcaG-gmd基因簇同时相对较高基因剂量的基因futM2可以有更高的3-岩藻糖基乳糖产量。

表2各工程菌摇瓶发酵详细信息

实施例5：高效生产工程菌发酵罐生产3-岩藻糖基乳糖

IPTG浓度和诱导温度对工程菌株E3合成3-FL的影响。将重组大肠杆菌细胞在37℃、4mL LB培养基中过夜预培养，然后以2％(v/v)的接种量将其作为种子液接种到25mL的甘油限定培养基中，并在37℃和200rpm下培养；当OD₆₀₀到达0.6，添加最终浓度5g/L的乳糖，IPTG添加不同浓度从0.05mM到1mM，诱导温度从22℃～28℃，72小时后的菌体培养液通过离心收集，之后通过液相色谱进行3-FL定量，从而确定3-FL生物合成的最佳诱导条件。结果如图5所示：在IPTG添加量为0.2mM时，在22～28℃下诱导后，3-FL的产量可达到2.66g/L。

将重组大肠杆菌E03种子液以10％(v/v)的接种量接种到工作体积为1L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度37℃，搅拌转速800r/min，通气量1vvm，pH 7.0(补加氨水自动控制)。发酵9.5h(OD₆₀₀约为15.4)，加入终浓度为10g/L乳糖和终浓度为0.2mM的IPTG，在25℃下培养。发酵期间手动补料甘油和乳糖：当反应体系中甘油浓度低于10g/L的时补加30mL母液(母液甘油浓度600g/L)，乳糖浓度低于5g/L时进补加20mL母液(母液乳糖浓度300g/L)，以维持菌体的生长以及3-岩藻糖基乳糖的合成。培养整个过程达到52h后，菌体OD₆₀₀达到60，3-岩藻糖基乳糖的产量达到最高，达到20.3g/L(图6)。

表3发酵过程中菌和3-岩藻糖基乳糖合成量动态变化表

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用

<130> BAA211387A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> Bacteroides gallinaceum

<400> 1

atgaaatccc tgaaaatcaa attcgttgac ttctggccgg gcttcaaccc gaacgacaac 60

ttcatcacca acgcgctgaa aggctacgaa atcgtgatca ccgacacccc ggattacctg 120

ttcttcagca tcttcggcta ctcccacctg aaatacaact gcgtgaaaat catgttcgtt 180

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aacttcggcg accgttacat gcgtctgccg ctgttcctga tttgcgacaa cttcaaagaa 300

ctgagcgtta ccaaagattt ctctccgaaa cgtatgctga accgcaaatt ctgcagcatc 360

gttgtttcta acgcgcaggt tagcaacccg atccgtgaac gtttcttccg tctgctgagc 420

gaatacaaac aggtggacag cggtggccgt ctgtggaaca acgtgggcgg cccggtggcg 480

gataaacaga aattcatcag cggttacaaa ttcaacatcg cgttcgaaaa cagcgcggtt 540

ctgggttaca ccaccgaaaa aatcatggac gcgatgaccg cgaacaccct gccgatctac 600

tggggcaacc cgtgggttgg tcgtgacttc aacaaacgca gcttcgttaa cgttaactcc 660

ttcgctagcc tggaaaaagc ggttgaatac attgttgacc tggacaccaa cgacgaacgt 720

tacctggaaa tgatgcagga accgtgggtt aacgatgtta gcatcttcga ctgggaagat 780

aaactgtgcg cattcctggc gcacatcgtt gaaaaaccgt tcgcggaagc gcagtacctg 840

gtggatgacg gcatgcagaa actgtacaaa cagaacatga aaaccctggc gttcgttaac 900

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tctactagcg cagcttaa 1038

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> Bacteroides gallinaceum

<400> 2

Met Lys Ser Leu Lys Ile Lys Phe Val Asp Phe Trp Pro Gly Phe Asn

1 5 10 15

Pro Asn Asp Asn Phe Ile Thr Asn Ala Leu Lys Gly Tyr Glu Ile Val

20 25 30

Ile Thr Asp Thr Pro Asp Tyr Leu Phe Phe Ser Ile Phe Gly Tyr Ser

35 40 45

His Leu Lys Tyr Asn Cys Val Lys Ile Met Phe Val Gly Glu Asn Ile

50 55 60

Val Pro Asp Phe Asn Leu Cys Asp Tyr Ala Met Gly Phe Asp Phe Leu

65 70 75 80

Asn Phe Gly Asp Arg Tyr Met Arg Leu Pro Leu Phe Leu Ile Cys Asp

85 90 95

Asn Phe Lys Glu Leu Ser Val Thr Lys Asp Phe Ser Pro Lys Arg Met

100 105 110

Leu Asn Arg Lys Phe Cys Ser Ile Val Val Ser Asn Ala Gln Val Ser

115 120 125

Asn Pro Ile Arg Glu Arg Phe Phe Arg Leu Leu Ser Glu Tyr Lys Gln

130 135 140

Val Asp Ser Gly Gly Arg Leu Trp Asn Asn Val Gly Gly Pro Val Ala

145 150 155 160

Asp Lys Gln Lys Phe Ile Ser Gly Tyr Lys Phe Asn Ile Ala Phe Glu

165 170 175

Asn Ser Ala Val Leu Gly Tyr Thr Thr Glu Lys Ile Met Asp Ala Met

180 185 190

Thr Ala Asn Thr Leu Pro Ile Tyr Trp Gly Asn Pro Trp Val Gly Arg

195 200 205

Asp Phe Asn Lys Arg Ser Phe Val Asn Val Asn Ser Phe Ala Ser Leu

210 215 220

Glu Lys Ala Val Glu Tyr Ile Val Asp Leu Asp Thr Asn Asp Glu Arg

225 230 235 240

Tyr Leu Glu Met Met Gln Glu Pro Trp Val Asn Asp Val Ser Ile Phe

245 250 255

Asp Trp Glu Asp Lys Leu Cys Ala Phe Leu Ala His Ile Val Glu Lys

260 265 270

Pro Phe Ala Glu Ala Gln Tyr Leu Val Asp Asp Gly Met Gln Lys Leu

275 280 285

Tyr Lys Gln Asn Met Lys Thr Leu Ala Phe Val Asn Glu Lys Leu Lys

290 295 300

Val Pro Arg Leu Ile Ser Ala Tyr Lys Lys Leu Ser Asn Gly Lys Tyr

305 310 315 320

Lys Leu Glu Ser Gly Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

325 330 335

His Met Asp Ser Ser Thr Ser Ala Ala

340 345

<210> 3

<211> 1437

<212> DNA

<213> Escherichia coli K-12

<400> 3

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ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120

ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180

aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag 240

aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300

gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat 360

gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa 420

gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat 480

attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag caggatatgg tggcctttga agtggcgcag 540

tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600

tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660

cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat 720

tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780

gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt 840

ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900

ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc 960

accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc 1020

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attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180

ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240

tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300

ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360

accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420

accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480

ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540

gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600

gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660

ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720

ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780

attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840

gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900

ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960

gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020

tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080

acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140

agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200

gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260

ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320

ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371

<210> 5

<211> 1122

<212> DNA

<213> Escherichia coli K-12

<400> 5

atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240

gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300

tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122

<210> 6

<211> 966

<212> DNA

<213> Escherichia coli K-12

<400> 6

atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc cgccatcagg 60

cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120

ctgctggaca gccgcgccgt gcatgatttc tttgccagcg aacgtattga ccaggtctat 180

ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gccaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240

taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300

aaactgctgt ttctcggatc gtcctgcatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360

gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420

atcgccggga tcaaactgtg cgaatcatac aaccgccagt acggacgcga ttaccgctca 480

gtcatgccga ccaacctgta cgggccacac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540

atcccagcat tgctgcgtcg cttccacgag gcgacggcac agaatgcgcc ggacgtggtg 600

gtatggggca gcggtacacc gatgcgcgaa tttctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660

agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgttg 720

tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcactatcc gcgagctggc gcaaaccatc 780

gccaaagtgg tgggttacaa aggccgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggcacg 840

ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900

ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960

gggtaa 966

Claims

1. 一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了来源于Bacteroides gallinaceum的α-1,3-岩藻糖基转移酶，同时表达了来源于大肠杆菌的磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、GDP-D-甘露糖脱氢酶的基因；并敲除了UDP-葡萄糖脂质载体转移酶和β-半乳糖苷酶；所述α-1,3-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述磷酸甘露糖变位酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述GDP-L-岩藻糖合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述GDP-D-甘露糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用pCDFDuet-1、pRSFDuet-1，或pETDuet-1载体表达编码α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因；利用pCDFDuet-1、pRSFDuet-1，或pETDuet-1载体共同表达编码磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、GDP-D-甘露糖脱氢酶的基因。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

4.一种生产3-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，利用权利要求1~3任一所述重组大肠杆菌发酵生产3-岩藻糖基乳糖。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在35~40℃、180~220rpm培养得到种子液，将种子液按体积比2~5%量加入含有甘油的发酵体系中，培养至OD₆₀₀为0.6~0.8，加入IPTG和乳糖，使得IPTG和乳糖在反应体系中的浓度分别为0.1~0.5 mM、3~5g/L，在22~28℃下诱导培养不少于72 h。

6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在35~40℃、180~220rpm培养得到种子液，将种子液按5~10%的量加入发酵体系中，培养至OD₆₀₀为15±3，加入IPTG和乳糖，使得IPTG和乳糖在反应体系中的浓度分别为0.1~0.5 mM、5~10 g/L，诱导培养不少于33 h。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应过程中补加乳糖和甘油，以维持甘油浓度不低于10 g/L，乳糖浓度不低于5 g/L。

8.权利要求1~3任一所述重组大肠杆菌在制备3-岩藻糖基乳糖中的应用。