KR101544184B1

KR101544184B1 - 2-푸코실락토오스 생산 변이 미생물 및 이를 이용한 2-푸코실락토오스의 제조방법

Info

Publication number: KR101544184B1
Application number: KR1020150040879A
Authority: KR
Inventors: 서진호; 진영욱; 김지영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2015-08-21

Abstract

본 발명은 2-푸코실락토오스를 생산하기 위한 변이 미생물 및 이를 이용한 2-푸코실락토오스의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 lacZ가 변형 또는 제거된 오페론 도입 및 FucT2 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자, G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 GSK (guanosine-inosine kinase)를 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 변이 미생물 및 이를 이용하여 2-푸코실락토오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

2-푸코실락토오스 생산 변이 미생물 및 이를 이용한 2-푸코실락토오스의 제조방법 {Variant Microorganism for Producing 2-Fucosyllactose and Method of Producing 2-Fucosyllactose by Using the Same}

본 발명은 2-푸코실락토오스 생산 변이 미생물 및 이를 이용한 2-푸코실락토오스의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 lacZ가 변형 또는 제거된 lac 오페론을 도입시킨 미생물에 α-1,2 푸코오스 전이효소 (α-1,2 fucosyltransferase), 이의 변이체를 코딩하는 외래 유전자, G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 GSK (guanosine-inosine kinase)를 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 도입 또는 증폭되어 있는 변이 미생물 및 이를 이용하여 2-푸코실락토오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

사람의 모유에는 200여종 이상의 독특한 구조를 가지는 올리고당 (human milk oligosaccharides, HMO)이 다른 포유류의 젖에 비해 상당히 높은 농도 (5~15 g/L)로 존재한다. HMO는 장내 유산균의 생육을 돕는 프리바이오틱 (prebiotic) 효과, 병원균 감염 예방 및 면역시스템 조절과 같이 사람의 건강에 영향을 미치는 다양한 생물학적 활성을 제공하는 기능성을 가지고 있다.

HMO는 D-glucose (Glc), D-galactose (Gal), N-acetylglucosamine (GlcNAc), L-fucose (Fuc)와 sialic acid (Sia; N-acetyl neuraminic acid [Neu5Ac])로 구성되어 있다. HMO의 구조는 매우 다양하고 복잡하여 다른 잔기와 글리코실 결합을 가지는 200개 정도의 이성질체가 서로 다른 중합도(DP 3-20)를 가질 수 있다. 구조적 복잡성에도 불구하고, HMO는 몇 가지 공통적인 구조를 가진다. 대부분의 HMO는 환원말단에 락토오스 (Galβ1-4Glc) 잔기를 가진다. 락토오스의 Gal은 α-(2,3)-과 α-(2,6)-결합으로 각각 3-시알릴락토오스 (3-sialyllactose) 또는 6-시알릴락토오스 (6-sialyllactose)의 형태로 시알화되거나, α-(1,2)-과 α-(1,3)-결합으로 각각 2-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose, 2-FL) 또는 3-푸코실락토오스(3'-fucosyllactose)의 형태로 푸코실화 (fucosylation) 될 수 있다. 약 200개의 다른 복합 올리고당이 모유에서 발견되었는데, 가장 함량이 많은 올리고당 3가지를 포함하여 137개가 푸코실화되어 그 비율은 거의 77%이고, 남은 올리고당은 대부분 시알화된 것(39개)으로 약 28%에 해당한다. 이 중, 특히 2-푸코실락토오스는 앞서 언급한 다양한 생물학적 활성에 관여하는 주요 HMO인 것으로 보고되었으며, 모유에 함유된 올리고당 중에 가장 풍부한 것으로 알려져 유아용 분유 및 노인용 건강기능식품의 소재 및 의약품의 소재로의 이용가능성으로 주목을 받게 되었다. 그러나 현재 2-푸코실락토오스는 산업적으로 대량생산이 어렵기 때문에, 2-푸코실락토오스를 대신하여 갈락토올리고당 (galactooligosaccharide) 또는 프럭토올리고당 (fructooligosaccharide)을 이유식에 첨가하여 유사한 효과를 기대하고 있는 실정이다.

2-푸코실락토오스의 생산방법으로는 직접 모유로부터 추출하는 방법과 화학적 또는 효소적 방법으로 합성하는 방법이 있다. 하지만 직접 추출하는 방법은 모유수급의 한계와 낮은 생산성이 문제였고, 화학적 합성법은 고가의 기질, 낮은 이성체 선택성(stereo-selectivity)과 생산수율, 독성시약의 사용 등의 문제가 있었다. 또한 효소적 합성법은 푸코스의 공여체(donor)로 이용되는 GDP-L-fucose가 매우 고가라는 점과 푸코스전이효소의 정제비용이 많이 든다는 문제점이 있었다. 따라서 이러한 문제들로 인해 직접추출, 화학적 또는 효소적 생산법은 산업적 대량생산에 적용이 불가능하였다. 반면, 미생물을 이용한 생물공학적 생산방법은 단순한 공정을 통해 값싼 기질로부터 2-푸코실락토오스를 대량으로 생산이 가능하다는 측면에서, 화학적 합성이나 효소적 합성과 같은 다른 시스템에 비해 산업적 대량생산에 적합하기 때문에 각광받고 있다.

미생물을 이용한 HMO 생산과 관련된 이전 연구에서, 콜라닌산 (colanic acid) 생합성에 대한 양성 조절자 RcsA를 과발현시키고, 콜라닌산 생합성을 위해 GDP-L-fucose를 이용하는 효소인 WcaJ를 불성활성시킴으로써, 설계된 E. coli의 세포외에서 2-푸코실락토오스를 생산하려는 시도가 있었다. 그러나, 2-푸코실락토오스의 생산 농도 및 생산성이 낮다는 문제가 있었다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 종래와 달리, lacZ가 변형 또는 제거된 lac 오페론 도입; α-1,2-fucosyltransferase 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자 및 G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 GSK (guanosine-inosine kinase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 변이 미생물을 이용함으로써 높은 수율로 2-푸코실락토오스를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

기존에 개발된 재조합 대장균으로 2-푸코실락토오스(2-Fucosyllactose, 2-FL)를 생산하는 데에는 두 가지 문제점이 있었다. 첫번째는 모균주로 E. coli JM107 또는 JM109을 이용하는데, 이 균주들은 바이오 필름과 아세트산을 과량생성하므로, 고농도 세포배양을 하기가 어렵다는 점이고, 두번째는 기존 연구에서 이용되었던 Helicobacter pylori유래의 1,2-fucosyltransferase는 과발현시 inclusion body를 형성하기 때문에 역가가 제한적이라는 점이다. 본 발명의 목적은 이러한 기존기술의 문제점을 인식하고, HMO를 효율적으로 생산하면서도 최종농도, 수율 및 생산성을 개선시킬 수 있는 변이 미생물 및 이를 이용하여 HMO를 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 또한, 고농도 세포배양 및 푸코스 전이효소의 발현수준향상을 통하여 최종적으로 2-푸코실락토스를 기존기술보다 고농도로 생산할 수 있는 기술을 개발하여 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 2-푸코실락토오스 (2-Fucosyllactose, 2-FL)를 생산하는 대사회로를 가지는 미생물에서, (a) 내인성 lac 오페론이 제거되고, lacZ가 변형 또는 제거된 lac 오페론이 도입; 및 (b) α-1,2-fucosyltransferase 또는 이의 변이체, (c) G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 (d) GSK (guanosine-inosine kinase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 변이 미생물에 관한 것이다.

상기 변이체는 α-1,2 fucosyltransferase의 N-말단에 아스파테이트(aspartate) 반복서열 또는 infB (translation initiation factor)의 1~7번째 아미노산을 코딩하는 유전자를 태그로 결합시킨 것일 수 있다.

본 발명은 상기 변이 미생물을 배양하여 2-푸코실락토오스를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 2-푸코실락토오스를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-푸코실락토오스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 변이 미생물 및 이를 이용한 제조방법에 따르면, 생산 수율이 낮아 산업적 측면에서 적용이 불가능하던 종래기술의 제약을 극복하고, 매우 우수한 수율로 락토오스로부터 2-푸코실락토오스를 생산할 수 있다. 이를 통해 산업화를 위한 대량 생산을 용이하게 함으로써, 식품 또는 제약 산업에 적합하게 적용할 수 있다.

도 1은 2-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose, 2-FL)의 구조적 조성을 나타낸 것이다.
도 2a는 내인성 lac 오페론을 파쇄하고 lacZ가 부분파쇄된 lac 오페론(lacZΔM15)을 도입시킨 재조합 대장균에서, GDP-L-fucose 및 2-푸코실락토오스를 생합성 하기 위한 de novo 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 2b는 내인성 lac 오페론을 파쇄하고 lacZ가 완전파쇄된 lac 오페론(lacYA)을 도입시킨 재조합 대장균에서, GDP-L-fucose 및 2-푸코실락토오스를 생합성 하기 위한 de novo 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 lac 오페론을 조작한 재조합 대장균 균주를 구축하기 위한 과정을 나타낸 모식도이다[(a) 야생형 대장균 - BL21star(DE3), (b) lac 오페론을 제거한 대장균 - △L, (c) lac△M15를 도입한 대장균 - △L M15, (d) lacYA를 도입한 대장균 - △L YA].
도 4는 재조합 대장균 균주들의 회분배양 결과를 나타낸 것으로, 광학밀도(OD₆₀₀)가 약 0.8에 도달하면, IPTG와 락토오스를 최종 농도가 각각 0.1mM 및 20 g/L(수직선)이 되도록 첨가하였다: (a) BL21star(DE3) BCGW-F, (b) △L BCGW-F, (c) △L M15 BCGW-F. 그래프 중 기호는 다음과 같으며, 도 4 중 기호는 3개의 독립적 회분배양의 대표값을 나타낸다: ●: 건조세포중량, ■: 락토오스, ▲: 2-푸코실락토오스.
도 5a-도 5f는 재조합 대장균 균주들의 유가식 배양결과를 나타낸 것으로, 초기에 투입한 20 g/L 글리세롤이 모두 소모된 후, 글리세롤을 pH-stat으로 공급하기 시작하였고, IPTG와 락토오스를 동시에 추가하였다(큰 화살표). 락토오스 고갈 후 200 g/L 락토오스 용액을 추가로 투입하였고(작은 화살표), 건조 세포 중량이 약 60에 도달한 후 글리세롤 공급 모드를 수동 모드로 변경하였다 (수직선). 도 5 중 기호는 다음과 같다: ●: 건조세포중량, ■: 락토오스, ▲: 2-푸코실락토오스, ◆: 글리세롤:
도 5a는 △L M15 BCGW-F 재조합 대장균의 유가식 배양결과를 나타낸 것이고,
도 5b는 △L M15 BCGW-Fz 재조합 대장균의 유가식 배양결과를 나타낸 것이고,
도 5c는 △L M15 BCGW-Fg 재조합 대장균의 유가식 배양결과를 나타낸 것이고,
도 5d는 △L M15 BCGW-D3F 재조합 대장균의 유가식 배양결과를 나타낸 것이고,
도 5e는 △L M15 BCGW-infBF 재조합 대장균의 유가식 배양결과를 나타낸 것이고,
도 5f는 △L M15 BCGW-W 재조합 대장균의 유가식 배양결과를 나타낸 것이고,
도 5g는 △L YA BCGW-W 재조합 대장균의 유가식 배양결과를 나타낸 것이다.
도 6은 △L M15/pmBCGW+pHwcfB의 배양액을 LC-MS/MS분석을 통해 2-푸코실락토오스의 생산을 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 2-푸코실락토오스 (2-Fucosyllactose, 2-FL)를 생산하는 대사회로를 가지는 미생물에서, (a) 내인성 lac 오페론이 제거되고, lacZ가 변형 또는 제거된 lac 오페론이 도입; 및 (b) α-1,2-fucosyltransferase 또는 이의 변이체, (c) G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 (d) GSK (guanosine-inosine kinase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 변이 미생물에 관한 것이다.

고농도 배양 및 외래단백질 발현에 적합한 대장균인 BL21star(DE3)를 2-푸코실락토오스 생산용 균주로 이용하기 위하여 락토오스분해효소 (β-galactosidase, LacZ)의 역가를 감소 또는 제거시킨 BL21star(DE3) 균주를 구축하였다. 이를 위해 (a) 야생형 BL21star(DE3)의 내인성 lac오페론을 파쇄하고, lacZ가 변형 또는 제거된 변이 lac 오페론을 도입하여 락토오스분해효소 (β-galactosidase)의 역가를 크게 감소 또는 제거시킴으로써 세포 내로 들어온 대부분의 락토오스(lactose)가 세포생장이 아닌 2-푸코실락토오스의 생산에 이용되도록 대사의 흐름을 전환시켰다.

(b) GDP-L-fucose 생합성 효소를 코딩하는 유전자(gmd, wcaG, manB, manC) 및 α-1,2 fucosyltransferase를 코딩하는 유전자(fucT2 또는 wcfB)를 도입하거나, 이의 변이체 예를 들어 α-1,2-푸코스전이효소의 푸코실화 활성도를 향상시키기 위해 N-말단에 아스파테이트 (aspartate) 반복서열 또는 infB (translation initiation factor)의 1~7번째 아미노산을 태그형태로 결합시켜 도입할 수 있다.

(c) GDP-L-fucose 생합성 효소를 코딩하는 유전자(gmd, wcaG, manB, manC)를 과발현시키고, G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및/또는 Gsk (guanosine-inosine kinase)를 코딩하는 유전자(zwf, gsk)를 도입시킴으로써 푸코스의 공여체인 GDP-L-fucose의 공급을 향상시킬 수 있다.

또한, (d) 기존의 H. pylori 유래의 α-1,2-푸코스전이효소보다 활성형으로 발현이 잘되는 Bacteroides fragilis 유래의 α-1,2-푸코스전이효소를 코딩하는 유전자(wcfB)를 발굴 및 도입시킨 재조합 대장균을 구축할 수 있다.

상기 2-푸코실락토오스를 생산하는 대사회로를 가지는 미생물은 박테리아일 수 있으며, 바람직하게 E. coli BL21star(DE3)일 수 있다. 종래 JM107 및 JM109 (E. coli K-12 변이체)과 같은 JM 균주는 F'플라스미드를 가지고 있기 때문에 과량의 바이오필름(biofilm)을 생성하고, 높은 세포 밀도에서 자라면 생산물 형성 비율을 증가시키기 위해 세포 성장이 억제될 수 있다. 세포 성장 억제는 높은 수준의 아세테이트 축적에 의해 유발되는 것으로 판단된다. JM 균주에 반해, E. coli BL21 균주는 F' 플라스미드를 가지고 있지 않고, 활발한 당 대사로 인해 세포 성장도 빠르고, 아세테이트 축적량도 적으며, 글루코스 이용률이 더 우수하다는 장점이 있다. 또한, BL21 균주는 다량의 재조합 단백질을 생산함에 있어 야기되는 대사 스트레스에 덜 민감하다. 종래 BL21star(DE3)에서 2-푸코실락토오스의 생산을 시도하여 세포 내에 GDP-L-fucose가 축적되었으나, 2-푸코실락토오스를 생산하는 대신 락토오스를 동화시킴으로써, 미량의 2-푸코실락토오스 만을 생산하였다. 이는 야생형 BL21star(DE3)의 락토오스 분해효소(β-galactosidase)의 활성도가 너무 높았기 때문인 것으로 사료되었기에 본 발명에서는 락토오스의 대사흐름이 세포생장 쪽으로 가기 보다는 2-푸코실락토오스의 생산에 이용되게 하기 위해서 lac 오페론의 교체를 통하여 락토오스 분해효소(β-galactosidase)의 활성을 기존 효소에 비해 3% 수준까지 저하 또는 제거시켰다.

본 발명에 따른 변이 미생물은 (a) 내인성 lac 오페론이 제거되고, lacZ가 변형 또는 제거된 lac 오페론이 도입되어 있다. 락토오스 동화 속도를 늦춘 본 발명에 따른 변이미생물 제작 결과, 내인성 lac 오페론을 lacZ가 변형 또는 제거된 lac 오페론으로 교체하는 것이 2-푸코실락토오스 생산에 효과적임을 확인하였다.

하나의 실시예에서, 상기 lacZ가 변형된 lac 오페론은 β-galactosidase를 코딩하는 아미노산 중 11~42번째 아미노산을 코딩하는 유전자가 결실된 것일 수 있으며, lacZΔM15로 표기될 수 있다. lacZΔM15에서 상기 11~42번째 아미노산을 코딩하는 유전자는 93 bp 길이의 염기서열로, 해당 부분의 염기서열이 결실된 것일 수 있다.

상기 lacZΔM15를 포함하는 lac 오페론은 E. coli K-12 균주 유래, 예를 들어 E. coli JM109 유래일 수 있는데, 본 출원의 발명자들은 E. coli JM109 균주가 락토오스만을 흡수할 뿐 동화시키지 않음을 확인하고, 미생물 내의 내인성 lac 오페론을 E. coli JM109 유래 lacZΔM15을 포함하는 lac 오페론으로 교체한 결과, 야생형 균주에 비해, 2-푸코실락토오스 생산 수율이 약 3배 이상 향상될 수 있음을 확인하였다. 락토오스 동화 속도를 늦춘 본 발명에 따른 변이미생물 제작 결과, 내인성 lac 오페론을 lacZΔM15을 포함하는 lac 오페론으로 교체하는 것이 2-푸코실락토오스 생산에 효과적임을 확인하였다.

추가로, BL21star(DE3)처럼 DE3와 같은 용원균(lysogen)이 있는 경우, lacZΔM15과 함께 작용하여, LacZ의 활성도가 부분적으로 되살아나는 α-complementation현상이 일어나므로 lacZΔM15을 완전히 제거시킨 ΔL YA균주도 구축하였고, 남아있던 3%의 LacZ활성도가 완전히 제거된 것을 확인하였다.

이를 기반으로, 또 다른 실시예에서, 상기 lacZ가 제거된 lac 오페론을 구축하였다. 상기 lacZ가 제거된 lac 오페론은 lacY 및 lacA로 구성된 것일 수 있으며, lacYA로 표기될 수 있다. lacYA는 lacZ를 완전히 제거한 lac 오페론을 의미한다.

락토오스 동화 속도를 늦춘 본 발명에 따른 변이미생물 제작 결과, 내인성 lac 오페론을 lacZΔM15 또는 lacYA를 포함하는 lac 오페론으로 교체하는 것이 2-푸코실락토오스 생산에 효과적임을 확인하였다.

본 발명에 따른 변이 미생물에는 또한, (b) α-1,2 fucosyltransferase를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있다. 상기 유전자는 예를 들어, Helicobacter pylori, Bacteroides fragilis, Dyadobacter fermentans, Enterococcus faecium DO, Escherichia coli O128:B12, Helicobacter hepaticus, Lactococcus lactis subsp. Cremoris, Silicibacter pomeroyi, Pedobacter heparinus 또는 Pedobacter saltans 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 최종 산물인 2-푸코실락토오스 생산에 적합한 활성도를 고려하여, 바람직하게 Helicobacter pylori 유래의 fucT2 또는 Bacteroides fragilis 유래의 wcfB 유전자가 도입 또는 증폭될 수 있다.

선행연구에서는 Candida antarctica 유래의 리파아제(lipase)를 대장균에서 발현시킬 시에 insoluble하게 발현되어 활성도가 낮은 문제가 있었는데, 말단부위에 1~10개의 비교적 짧은 아미노산을 태그형태로 부착시키면 단백질의 활성도를 향상시키는데 효과가 있다고 보고한 바 있다 [Jung et al. (2011) Bioprocess and Biosystems Engineering]. 또한, 다른 그룹의 선행연구에 따르면, translation initiation factorⅡ를 코딩하는 infB 유전자의1~21번째 서열을 Green fluorescent protein (GFP) N-말단에 부착하였을 경우, 활성도가 향상된다고 보고한 바 있다 [Hansted et al. (2011) Journal of Biotechnology 155(3):275-283]. 본 발명에서는 2-푸코실락토오스의 생산에 관한 선행연구들에서 발현에 문제가 있었던 H. pylori유래의 α-1,2-푸코스전이효소에 아미노산 태그를 부착시키는 방법을 적용하였다. 하나의 실시예에서, 상기 변이체는 α-1,2 fucosyltransferase의 N-말단에 아스파테이트(aspartate) 반복서열 또는 infB (translation initiation factor)의 1~7번째 아미노산을 코딩하는 유전자를 태그로 결합시킨 것일 수 있다.

본 발명에 따른 변이 미생물은 (c) G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및/또는 GSK (guanosine-inosine kinase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있다. 본 출원의 발명자들은 상기 G6PDH를 코딩하는 유전자인 zwf 및/또는 GSK를 코딩하는 유전자 gsk가 도입 또는 증폭된 변이 미생물은 2-푸코실락토오스 생산에 효과적임을 확인하였다.

상기 zwf 유전자는 예를 들어, Escherichia coli (strain K-12), Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli O6:H1, Leuconostoc mesenteroides, Saccharomyces cerevisiae, Dictyostelium discoideum, Pseudomonas aeruginosa, Nostoc sp., Mycobacterium smegmatis, Rhizobium meliloti, Streptococcus pneumoniae serotype 4, Zymomonas mobilis subsp. Mobilis, Bacillus subtilis, Chlamydia pneumonia, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Arabidopsis thaliana, Synechococcus elongates, Dickeya dadantii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Borrelia burgdorferi, Buchnera aphidicola subsp. Acyrthosiphon pisum, Buchnera aphidicola subsp. Schizaphis graminum, Buchnera aphidicola subsp. Baizongia pistaciae, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachomatis, Haemophilus influenza, Nostoc punctiforme, Synechocystis sp., Thermotoga maritime, Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Encephalitozoon cuniculi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Bacillus thuringiensis, Solanum tuberosum, Takifugu rubripes, 또는 Macropus robustus 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 Escherichia coli K-12 유래일 수 있다.

상기 gsk 유전자는 예를 들어, Escherichia coli (strain K12), Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli O6:H1, Exiguobacterium acetylicum 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 Escherichia coli K-12 유래일 수 있다.

L-푸코오스는 HMO와 진핵생물의 당단백질 및 당지질의 글리코실화 잔기에 존재하는 당으로, 다양한 유형의 생화학적 인식 과정에서 중요한 역할을 한다. 푸코실락토오스를 생합성하기 위해서는 L-푸코오스가 공여체인 GDP-푸코오스를 통하여 수용체인 락토오스에 당전이시키는 반응을 거친다. 이러한 푸코실락토오스를 생합성하는 경로는 2가지로, salvage 생합성 경로 및 de novo 생합성 경로가 있다.

Salvage 합성법은 L-푸코오스가 세포내부에서 ATP를 소비하면서 L-fucose kinase (fkp)에 의해 인산화되어 L-fucose-1-phosphate가 되고, L-fucose-1-phosphate guanylyl-transferase에 의해 guanosine triphosphate (GTP)와 함께 결합하여 GDP-fucose가 된 후 푸코스전이효소를를 통해 락토오스로부터 푸코실락토오스를 생산한다.

De novo 합성법은 해당작용의 중간체인 fructose-6-phosphate가 mannose-6-phosphate isomerase (ManA)와 phosphomannomutase (ManB)에 의해 mannose-1-phosphate로 대사되고, mannose-1-phosphate guanyltransferase (ManC)에 의해 GTP와 함께 결합하여 GDP-D-mannose를 형성한다. 이후, GDP-D-mannose 4,6-dehydratase (Gmd)는 GDP-D-mannose로부터 물 분자를 제거하고 GDP-L-fucose synthase (WcaG)은 GDP-4-keto-6-deoxymannose의 C4 위치에 있는 keto 그룹의 환원을 촉진하고 여기에 환원된 NADPH는 환원력을 제공하여 GDP-L-fucose가 제조된 후 fucosyltransferase를 통해 락토오스로부터 푸코실락토오스를 생산한다 (도 2).

이와 관련하여, 본 발명에 따른 변이 미생물은 de novo 생합성 경로를 거쳐 푸코실락토오스를 합성할 수 있다. 이에 따라, 도 2에 나타낸 바와 같이 ManA (mannose-6-phosphate isomerase), ManB (phosphomannomutase), ManC (mannose-1-phosphate guanyltransferase), Gmd (GDP-D-mannose dehydratase) 및 WcaG (GDP-fucose synthase)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭될 수 있다.

본 발명에 따른 변이 미생물에 도입되는 재조합 벡터 (플라스미드)는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, 플라스미드와 혼용될 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들어, (a) 내지 (c)의 유전자 및 manA, manB, manC, gmd, wcaG 유전자를 포함하며, 예를 들어 pGRG36+lacZ△M15, pGRG36+lacYA, pETDuet-1 + manC-manB + gmd-wcaG, pCOLADuet-1 + fucT2, pCOLADuet-1 + fucT2 + zwf, pCOLADuet-1 + fucT2 + gsk, pCOLADuet-1 + D3fucT2, pCOLADuet-1 + infBfucT2 또는 pCOLADuet-1 + wcfB 벡터일 수 있다.

상기 재조합 벡터 (플라스미드)는 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 특정한 재조합 미생물에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 프로모터는 재조합 미생물에 천연, 동종, 외래 또는 이종일 수 있다.

"작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 성분의 병렬을 지칭하고, 이 때 상기 성분은 의도된 방식으로 작용하도록 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 연결된 서열의 전사를 제어하거나 조절하도록 작용하는 경우, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 상기 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 이 때 분비 리더/신호 서열 및 인접하고 리딩 프레임 내에 있는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 2개 이상을 접합시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "도입"은 원형질체 제작과 세포벽 재생산이 후속되는 원형질체의 형질전환과 관련된 과정에 의하여 수행된 것일 수 있다. 원형질체 내에 삽입된 DNA는 숙주세포의 염색체 안으로 삽입된다. 삽입된 DNA 서열은 세포내에서 안정하게 유지된다. DNA는 통상적으로 염색체 내 상동성, 비상동성 부위로 삽입될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "증폭"은 DNA 서열의 카피수를 증가시키기 위한 과정을 의미하며, 예를 들어 증폭은 Polymerase Chain Reaction (PCR)을 통해 수행될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 변이 미생물을 배양하여 2-푸코실락토오스를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 2-푸코실락토오스를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-푸코실락토오스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 변이 미생물의 배양 및 회수과정은 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 사용된 특정 배지 및 특정 배양방법 이외에도 타 성분의 배지를 사용할 수 있고, 글리세롤과 락토오스를 함께 이용한 유가식 배양 (fed-batch fermentation), 회분식 배양 (batch fermentation), 또는 연속식 배양 등 다양한 방법을 사용할 수 있다. 글리세롤과 락토오스는 동시에 이용될 수 있는데, 이는 두 가지 당이 비당류 인산화를 촉매하는 시스템 (non-phosphotransferase system)을 통해 세포 내로 운반되기 때문이다. GDP-L-fucose의 생합성뿐 아니라, 세포 성장을 위해 락토오스를 추가하여 글리세롤 유가배양을 실시할 수 있다. 이를 통해 아세테이트 축적을 방지하면서도, 글리세롤과 락토오스의 동시 동화를 통해 세포 성장이 유지되면서 2-푸코실락토오스의 생산성 역시 개선될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 재조합 균주 및 플라스미드 제작

유전자 조작 및 2-푸코실락토오스 생산을 위해 E. coli TOP10 및 E. coli BL21star(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 각각 사용하였다. GDP-L-fucose 생합성 효소 (ManB, ManC, Gmd 및 WcaG) 및 Helicobacter pylori 유래 α-1,2 푸코오스 전이효소(α-1,2 fucosyltransferase: FucT2)의 과발현을 위해 플라스미드 pmBCGW 및 pHfucT2를 각각 이용하였다. G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 또는 GSK (guanosine-inosine kinase)를 추가로 발현시키기 위해 pHfucT2zwf와 pHfucT2gsk를 제작하였고, H. pylori유래의 α-1,2-푸코스전이효소의 N-말단에 아스파테이트(aspartate) 반복서열 또는 infB (translation initiation factor)의 1~7번째 아미노산을 태그형태로 결합시키기 위해 pHD3fucT2와 pHinfBfucT2를 제작하였으며, 신규 α-1,2-푸코스전이효소인 Bacteroides fragilis 유래의 WcfB의 과발현을 위해 플라스미드 pHwcfB를 제작하였다. 실시예 중 사용된 유전자 서열은 다음 표 1과 같다.

[표 1]

유전자 zwf 및 gsk를 PCR을 통해 표 3의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 E. coli K-12 (ATCC10798)의 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 증폭된 유전자를 표 2의 제한효소 및 연결효소를 처리하여 pHfucT2 플라스미드에 클로닝하였으며, 각각 pHfucT2zwf 및 pHfucT2gsk를 제작하였다. pGlacZ△M15를 제작하기 위해, 2쌍의 프라이머 P1_M15 lac/ P2_M15 lac 와 P3_M15 lac/P4_M15 lac을 사용하여 E. coli K-12 게놈 DNA로부터 2개의 DNA 단편을 증폭하였다.

또한 pGlacYA를 제작하기 위해, 2쌍의 프라이머 P1_M15 lac/P2_lacYA와 P3_lacYA/P4_M15 lac를 사용하여 2개의 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편들을 In-Fusion HD Cloning Kit (TAKARA, Japan)을 사용하여 각각 pGRG36에 클로닝 하였고, 그 결과, pGlacZ△M15과 pGlacYA가 구축되었다. 모든 구조체는 제한효소 처리 및 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.

플라스미드 pKD46, pKD13 및 pCP20을 사용하는 λ-red mediated deletion 방법[Datsenko et al. (2000) Proceedings of the National Academy of Sciences 97(12):6640]을 통해 대장균 염색체상의 내인성 lac 오페론을 결실시켰다. 또한, 트랜스포존을 이용하여 게놈염색체 상으로 lacZ△M15를 삽입하는 과정은 McKenzie et al. (2006) BMC microbiology 6(1):39을 참조하였다. 사용된 모든 균주, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드를 표 2 및 3에 기재하였다.

[표 2] 균주 및 플라스미드

[표 3] 사용된 프라이머

* 이탤릭체로 표시된 서열은 E. coli 염색체에서 lac 오페론의 상동 재조합 부위를 의미함

* 밑줄 표시 서열은 특정 제한효소의 인지 부위를 나타냄

* 진하게 표시된 서열은 아미노산 태그를 의미함

[실시예 2] 배양조건 및 방법

종균배양, 전배양 및 회분식 배양에는 적절한 항생제 (ampicillin 50 μg/mL 및 kanamycin 50 μg/mL)가 포함된 LB (Luria-Bertani) 배지 (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride)를 이용하였으며, 종균배양에는 시험관을 이용하였고, 전배양 및 회분식 배양에는 100 mL의 LB배지가 담긴 500 mL들이의 플라스크 (baffled flask)에서 25℃, 교반 속도를 250 rpm으로 유지하며 배양하였다. 회분식 배양시에는 광학밀도(OD₆₀₀)가 0.8에 도달하면, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 및 락토오스 최종 농도가 각각 0.1 mM 및 20 g/L이 되도록 첨가하였다. 고농도 세포배양을 위한 유가식 배양은 20 g/L 의 글리세롤 및 적절한 항생제를 포함하는 1.0 L의 최소배지 [13.5 g/L KH₂PO₄, 4.0 g/L (NH₄)₂HPO₄, 1.7 g/L citric acid, 1.4 g/L MgSO₄·7H₂O, 10 ml/L 미량 원소 용액 (10 g/L Fe(III) citrate, 2.25 g/L ZnSO₄·7H₂O, 1.0 g/L CuSO₄·5H₂O, 0.35 g/L MnSO₄·H₂O, 0.23 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O, 0.11 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄, 2.0 g/L CaCl2·2H₂O), pH6.8]를 포함하는 2.5 L bioreactor (Kobiotech, Incheon, Korea)에서 실시하였다. 초기에 첨가한 글리세롤이 완전히 고갈된 후, 800 g/L의 글리세롤 및 20 g/L MgSO₄·7H₂O를 포함하는 유입용액(feeding solution)을 pH-stat방법으로 공급하였다. 동시에, T7 프로모터-매개 유전자 발현을 유도하기 위해 IPTG 및 락토오스를 최종 농도가 0.1 mM 및 20 g/L가 되도록 추가하여 2-푸코실락토오스를 생산하였다. pH-stat 방법을 위해, pH가 글리세롤 고갈로 set-point보다 더 높아지면, 반응기 중에서 적정량의 유입용액이 자동으로 공급되도록 하였다. 또한 배지의 pH가 set-point보다 더 낮아지면 28% NH₄OH가 자동으로 첨가되어 pH가 일정범위 내(pH6.78~6.82)에서 유지되도록 하였다. 배지의 pH는 pH 전극 (Mettler Toledo, USA)을 사용하여 실시간으로 측정되었다. 건조균체량(dry cell weight, DCW)가 약 60에 도달한 후, 글리세롤 공급 속도를 수동으로 조절하였다. 교반 속도는 용해된 산소 결핍을 방지하기 위하여 초기 1000 rpm에서 최대 1,200 rpm까지 증가시키고, 통기속도는 전 배양시간 동안 2 vvm으로 유지하였다.

[실시예 3] 세포 및 세포외 대사산물 농도 결정

광학밀도 및 미리 측정한 변환 상수 0.36을 통해 건조균체량을 측정하였다. 광학밀도는 샘플을 희석하여 광학밀도를 0.1-0.5 사이로 유지한 후에 spectrophotometer (Ultrospec 2000, Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 사용하여 600 nm 흡광도에서 측정하였다. 2-푸코실락토오스, 락토오스, 글리세롤, 갈락토오스 및 아세트산의 농도는 Carbohydrate Analysis column (Rezex ROA-organic acid, Phenomenex, USA) 및 RI (refractive index) 검출기가 장착된 HPLC (high performance liquid chromatography) (Agilent 1100LC, USA)를 통해 측정하였다. 60℃에서 가열된 컬럼을 적용하여 10배 희석된 20 ㎕의 배양 배지를 분석하였다. 0.6 mL/min 유속으로 5 mM의 H₂SO₄ 용액을 이동상으로 사용하였다.

[시험예 1] 재조합 대장균에서 lac오페론의 변형이 2-푸코실락토오스 생산에 미치는 영향 평가

세포 내로 공급되는 락토오스는 재조합 대장균에서 2-푸코실락토오스(2'-fucosyllactose, 2-FL)의 효율적 생합성을 위한 필수 요소 중 하나이다. 도 2a에 도시한 바와 같이, lacZ유전자에 의해 코딩되는 β-galactosidase는 락토오스가 세포생장에 이용될 수 있도록 포도당 및 갈락토오스로 분해시키는 효소이다. 야생형 대장균에서는 대부분 세포생장에 이용되던 락토오스의 대사흐름(metabolic flux)을 2-푸코실락토오스의 생합성 경로 쪽으로 전환시키기 위해 BL21star(DE3)에서 lacZ의 일부를 결실시키는 것을 시도하였으나, 이 균주에서는 2-푸코실락토오스의 생산이 관찰되지 않았다. 이는 락토오스를 세포 내로 운반하는 lacY가 lacZ와 하나의 오페론을 이루고 있기 때문에 프레임시프트(frame-shift)에 의해 lacY가 발현되지 못한 것으로 사료된다.

한편, JM109균주는 락토오스를 세포 내로 흡수만 할 뿐 세포생장에 이용하지 못하므로, BL21star(DE3)의 내인성 lac 오페론을 JM109 유래의 lacZ△M15 포함하는 lac오페론 또는 lacYA만 포함하는 lac 오페론으로 교체 (도 2b의 생합성 경로)를 시도하였다.

도 3은 BL21star(DE3) 균주에서 내인성 lac 오페론을 결실시키고, 새로운 lac 오페론을 각각 도입하는 과정을 나타내는 모식도이다. 먼저, lacI의 20 bp 상류(upstream)로부터 lacA 40 bp 하류(downstream)까지의 내인성 lac 오페론 부위를 λ-red recombination에 의해 결실시켜, △L 균주(lac오페론 결핍 균주)을 제조하였다. 두 번째로, lacZ△M15 또는 lacYA를 포함하는 신규 오페론 단편을 Tn7 기판 트랜스포존에 의해 glmS유전자 부위에 삽입하였으며, 이를 통해 △L M15 균주(lacZ△M15 knock-in 균주)와 △L YA균주(lacYA knock-in균주)를 제작하였다.

lac 오페론의 변이가 2-푸코실락토오스의 생산에 미치는 영향을 pmBCGW와 pHfucT2 플라스미드를 포함하는 야생형 BL21star(DE3), △L 및 △L M15의 3가지 균주를 회분식으로 배양함으로써 평가하였다. 대조군 균주인 야생형 BL21star(DE3)는 75시간 이내에 초기 락토오스의 대부분을 소비하였고, 0.03 g 2-FL/g lactose의 수율로 0.58 g/L의 2-FL을 생산하였다 (도 4a). 다른 균주들과 비교하여 최종 건조균체량이 가장 많았기 때문에 소비된 락토오스는 대부분 세포 생장을 위해 사용되었을 것으로 사료된다. 반면, △L균주는 극소량의 락토오스(0.06 g/L) 만을 소비하고 0.04 g/L의 2-푸코실락토오스 (도 4b)를 생산하였는데, 이는 소량의 락토오스가 단순 확산을 통해 세포로 이동하였기 때문일 것으로 사료된다. △L M15균주는 1.65 g/L 락토오스를 소비하였고, 0.15 g/L의 2-FL을 축적하였다. 그러나, △L M15 균주에서 0.09 g 2-FL/g lactose의 수율은 대조군 균주와 비교하여 3.3배 증가하였다 (도 4c). 결과적으로, BL21star(DE3)균주의 락토오스 동화 속도를 크게 낮추었으며, 이는 내인성 lac 오페론을 변형된 오페론으로 교체하는 것이 2-푸코실락토오스 생산에 효과적임을 나타낸다. 회분식 배양 결과는 표 4에 요약하였다.

[표 4]

[시험예 2] G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 또는 GSK (guanosine-inosine kinase)의 공동발현이 2-푸코실락토오스의 생산에 미치는 영향 평가

NADPH와 같은 보조인자(cofactor) 생성 관련 효소의 추가 과발현이 2-푸코실락토오스의 생산에도 영향을 주는지를 평가하기 위해, △L M15에 2-FL 생합성 효소 (ManB, ManC, Gmd, WcaG 및 FucT2)를 과발현시킨 균주와 이 균주에 각각 G6PDH (glucose 6-phosphate dehydrogenase) 또는 GSK (guanosine-inosine kinase)를 추가발현 시킨 균주들을 2.5 L 생물반응기에서 유가식으로 배양하였다. 도 5a에서 나타낸 바와 같이, 대조군 균주인 △L M15에 2-FL 생합성 효소만 과발현시킨 균주에서는 최종 건조균체량이 73.1 g/L를 나타내었고, 최종농도 2.56 g/L의 2-푸코실락토오스를 0.064 g 2-푸코실락토오스/g 락토오스의 수율로 수득하였다. 또한, 도 5b와 5c에서 볼 수 있듯이, 2-FL 생합성 효소와 함께 G6PDH 또는 GSK를 과발현하는 재조합 대장균 △L M15 균주는 전 배양 공정 동안 대조군과 비교하여 유사한 성장 패턴을 보여주었다. 또한, 아세테이트 축적은 유가배양 둘 다에서 관찰되지 않았다. G6PDH를 과발현하는 재조합 대장균의 유가 배양에서 0.095 g 2-FL/g lactose의 수율로 3.45 g/L의 2-푸코실락토오스를 수득하였으며, 이는 대조군 균주와 비교하여 2-푸코실락토오스의 농도 및 수율에서 각각 35% 및 48% 향상된 것이다. GSK가 과발현된 재조합 대장균 배양에서 0.085 g 2-FL/g lactose 의 수율로 3.52 g/L 의 2-푸코실락토오스를 수득하였으며, 이는 대조군 균주와 비교하여 2-푸코실락토오스의 농도 및 수율 각각에서 38% 및 33% 향상된 것이다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, G6PDH 또는 GSK의 추가 발현은 세포내 GDP-L-fucose 생산 뿐 아니라, 2-푸코실락토오스의 생산에도 중요한 요소로 작용할 수 있음을 의미한다. 유가 배양의 결과는 표 5에 나타내었다.

[시험예 3] α-1,2-푸코스전이효소의 N-말단에 삽입한 아미노산 단편이 2-푸코실락토오스의 생산에 미치는 영향

2-푸코실락토오스의 생산에 관한 선행연구들에서 발현에 문제가 있었던 H. pylori유래의 α-1,2-푸코스전이효소에 아미노산 태그를 부착시키는 방법을 적용해서, 이것이 2-푸코실락토오스의 생산에 어떤 영향을 미치는지를 알아보고자 하였다. 먼저, FucT2의 개시코돈(ATG)과 뒤따르는 서열 사이에 아스파테이트(aspartate) 및 아르기닌(arginine) 등의 아미노산 서열을 다양한 길이로 부착시킨 융합 α-1,2-푸코스전이효소 라이브러리를 구축하였다. 또한, infB의 1~21번째 서열을 말단에 부착시킨 변이 α-1,2-푸코스전이효소를 도입한 균주도 구축을 하였다. 구축한 재조합 대장균들을 플라스크 수준의 회분식 배양으로 확인한 결과, N-말단에 아스파테이트 3개(GATGATGAT)를 결합시킨 것과 infB의 1~21번째 서열(ATGACAGATGTAACGATTAAA)을 결합시킨 변이 α-1,2-푸코스전이효소를 도입한 균주에서 2-푸코실락토오스가 생성됨을 확인할 수 있었다. 도 5d와 5e는 각각 △L M15/pmBCGW+pHD3fucT2와 △L M15/pmBCGW+pHinfBfucT2를 유가식 공정으로 배양한 결과를 나타내고 있다. 발효 약 22시간에 IPTG, 락토오스를 첨가하면서 글리세롤 공급을 시작한 이후로 단백질 발현이 유도되면서 세포생장 및 2-푸코실락토오스의 생산은 지속적으로 증가하였다. 건조 균체량은 각각 71.1 g/L와 73.0 g/L까지 증가하였고, 2-푸코실락토오스는 각각 6.4 g/L와 6.1 g/L까지 증가하였다(태그를 부착하지 않은 경우보다 약 2.5배와 2.4배 증가). 이는 아스파테이트와 infB 태그의 부착으로 인하여 α-1,2-푸코스전이효소의 발현이 수월해지면서 활성도가 증대되었기 때문인 것으로 사료된다. 유가 배양의 결과는 표 5에 나타내었다.

[시험예 4] 신규 α-1,2-푸코스전이효소의 도입이 2-푸코실락토오스의 생산에 미치는 영향

선행연구들에서 이용되었던H. pylori 유래의 α-1,2-푸코스전이효소 (FucT2)는 대부분이 inclusion body를 형성하기 때문에 매우 낮은 수준의 활성도를 나타내는 문제점이 있었다. 따라서, H. pylori 유래의 fucT2 보다 활성형으로 발현이 잘되는 유전자를 찾기 위해 서로 다른 유래의 α-1,2-푸코스전이효소로 추정되는 11종의 유전자들을 각각 △L M15균주에 pmBCGW플라스미드와 함께 도입하여 유전자 라이브러리를 구축한 후, 유가식 배양을 통해 2-푸코실락토오스의 생산성능을 테스트하였다. 그 중에서 유일하게 Bacteroides fragilis유래의 wcfB를 도입한 재조합 대장균에서만 2-푸코실락토오스가 생성됨을 확인할 수 있었다. 도 5f에서 보여주듯이, 유가식 배양에서는 최종 건조균체량이 62.0 g/L까지 생장하였고, 2-푸코실락토오스를 최종농도 13.8 g/L로 수득할 수 있었다. 이는 H. pylori유래의 fucT2를 이용했을 때보다 5.4배 향상된 수치인데, 이는 wcfB가 fucT2 보다 푸코실화 활성도(fucosylation activity)가 더 높기 때문에 세포 내로 유입된 락토오스의 푸코실화가 더 빠르게 진행되었기 때문으로 사료된다. 유가 배양의 결과는 표 5에 나타내었다.

[시험예 5] LacZ의 잔여 활성도 제거가 2-푸코실락토오스의 생산에 미치는 영향

BL21star(DE3)처럼 DE3와 같은 용원균(lysogen)이 있는 균주의 경우, lacZΔM15을 도입하였을때, β-galactosidase의 활성도가 부분적으로 되살아나는 α-complementation현상이 관찰되었다. 이것은 DE3에 포함된 lacZ의 일부분에서 β-galactosidase의 α-peptide가 생성되고, lacZΔM15에서 ω-peptide 가 생성되므로 일어나는 현상으로 사료되었다. 따라서, ΔL M15균주에서 lacZΔM15을 제거시킴으로써, 남아있는 LacZ활성도를 완전히 없앤 ΔL YA균주를 구축하였고, 이것이 2-푸코실락토오스의 생산에 미치는 영향을 유가식 배양으로 확인하여 보았다(도 5g). ΔL YA/pmBCGW+pHwcfB균주의 유가식 배양 결과, 배양 46시간째에 건조균체량은 57.6 g/L에 도달하였고, 2-푸코실락토오스의 농도는 15.4 g/L, 수율은 0.858 g 2-FL/g lactose이며, 시간당 0.530 g/L의 생산성을 나타내었다. 이러한 수치는 β-galactosidase의 활성도가 일부 남아있던 △L M15/pmBCGW+pHwcfB균주와 비교하였을 때, 2-푸코실락토오스의 수율과 생산성 측면에서 각각 약 2.2배와 2.0배가 향상된 수치이다. 유가 배양의 결과는 표 5에 나타내었다.

[표 5]

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seoul National University R&Db Foundation <120> Variant Microorganism for Producing 2-Fucosyllactose and Method of Producing 2-Fucosyllactose by Using the Same <130> P14-B265 <150> KR 14/0184661 <151> 2014-12-19 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> E. coli K-12 ATCC10798 <400> 1 atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60 tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120 accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180 cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240 gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300 tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360 ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420 caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480 aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540 aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600 atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660 atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720 ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780 cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840 gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900 ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960 ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020 gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080 aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122 <210> 2 <211> 968 <212> DNA <213> E. coli K-12 ATCC10798 <400> 2 gcatgagtaa acaacgagtt tttattgctg gtcatcgcgg gatggtcggt tccgccatca 60 ggcggcagct cgaacagcgc ggtgatgtgg aactggtatt acgcacccgc gacgagctga 120 acctgctgga cagccgcgcc gtgcatgatt tctttgccag cgaacgtatt gaccaggtct 180 atctggcggc ggcgaaagtg ggcggcattg ttgccaacaa cacctatccg gcggatttca 240 tctaccagaa catgatgatt gagagcaaca tcattcacgc cgcgcatcag aacgacgtga 300 acaaactgct gtttctcgga tcgtcctgca tctacccgaa actggcaaaa cagccgatgg 360 cagaaagcga gttgttgcag ggcacgctgg agccgactaa cgagccttat gctattgcca 420 aaatcgccgg gatcaaactg tgcgaatcat acaaccgcca gtacggacgc gattaccgct 480 cagtcatgcc gaccaacctg tacgggccac acgacaactt ccacccgagt aattcgcatg 540 tgatcccagc attgctgcgt cgcttccacg aggcgacggc acagaatgcg ccggacgtgg 600 tggtatgggg cagcggtaca ccgatgcgcg aatttctgca cgtcgatgat atggcggcgg 660 cgagcattca tgtcatggag ctggcgcatg aagtctggct ggagaacacc cagccgatgt 720 tgtcgcacat taacgtcggc acgggcgttg actgcactat ccgcgagctg gcgcaaacca 780 tcgccaaagt ggtgggttac aaaggccggg tggtttttga tgccagcaaa ccggatggca 840 cgccgcgcaa actgctggat gtgacgcgcc tgcatcagct tggctggtat cacgaaatct 900 cactggaagc ggggcttgcc agcacttacc agtggttcct tgagaatcaa gaccgctttc 960 gggggtaa 968 <210> 3 <211> 1437 <212> DNA <213> E. coli K-12 ATCC10798 <400> 3 atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60 ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120 ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180 aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag 240 aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300 gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat 360 gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa 420 gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat 480 attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag caggatatgg tggcctttga agtggcgcag 540 tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600 tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660 cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat 720 tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780 gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt 840 ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900 ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc 960 accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc 1020 gaccgtaacg cggtacagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080 catgagcatc gggtgcatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140 gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200 cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtggttgtcg cgggaacggc aaaagtcacc 1260 attgatggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320 acgcattgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcgctccggc 1380 tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgt ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437 <210> 4 <211> 1475 <212> DNA <213> E. coli K-12 ATCC10798 <400> 4 acgtcgcatc aggcaatgaa tgcgaaaccg cggtgtaaat aacgacaaaa ataaaattgg 60 ccgcttcggt cagggccaac tattgcctga aaaagggtaa cgatatgaaa aaattaacct 120 gctttaaagc ctatgatatt cgcgggaaat taggcgaaga actgaatgaa gatatcgcct 180 ggcgcattgg tcgcgcctat ggcgaatttc tcaaaccgaa aaccattgtg ttaggcggtg 240 atgtccgcct caccagcgaa accttaaaac tggcgctggc gaaaggttta caggatgcgg 300 gcgttgacgt gctggatatt ggtatgtccg gcaccgaaga gatctatttc gccacgttcc 360 atctcggcgt ggatggcggc attgaagtta ccgccagcca taatccgatg gattataacg 420 gcatgaagct ggttcgcgag ggggctcgcc cgatcagcgg agataccgga ctgcgcgacg 480 tccagcgtct ggctgaagcc aacgactttc ctcccgtcga tgaaaccaaa cgcggtcgct 540 atcagcaaat caacctgcgt gacgcttacg ttgatcacct gttcggttat atcaatgtca 600 aaaacctcac gccgctcaag ctggtgatca actccgggaa cggcgcagcg ggtccggtgg 660 tggacgccat tgaagcccgc tttaaagccc tcggcgcgcc cgtggaatta atcaaagtgc 720 acaacacgcc ggacggcaat ttccccaacg gtattcctaa cccactactg ccggaatgcc 780 gcgacgacac ccgcaatgcg gtcatcaaac acggcgcgga tatgggcatt gcttttgatg 840 gcgattttga ccgctgtttc ctgtttgacg aaaaagggca gtttattgag ggctactaca 900 ttgtcggcct gttggcagaa gcattcctcg aaaaaaatcc cggcgcgaag atcatccacg 960 atccacgtct ctcctggaac accgttgatg tggtgactgc cgcaggtggc acgccggtaa 1020 tgtcgaaaac cggacacgcc tttattaaag aacgtatgcg caaggaagac gccatctatg 1080 gtggcgaaat gagcgcccac cattacttcc gtgatttcgc ttactgcgac agcggcatga 1140 tcccgtggct gctggtcgcc gaactggtgt gcctgaaaga taaaacgctg ggcgaactgg 1200 tacgcgaccg gatggcggcg tttccggcaa gcggtgagat caacagcaaa ctggcgcaac 1260 ccgttgaggc gattaaccgc gtggaacagc attttagccg tgaggcgctg gcggtggatc 1320 gcaccgatgg catcagcatg acctttgccg actggcgctt taacctgcgc acctccaata 1380 ccgaaccggt ggtgcgcctg aatgtggaat cgcgcggtga tgtgccgctg atggaagcgc 1440 gaacgcgaac tctgctgacg ttgctgaacg agtaa 1475 <210> 5 <211> 903 <212> DNA <213> H. pylori26695 ATCC700392 <400> 5 atggctttta aggtggtgca aatttgcgga gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60 ttcgctaaaa gtttgcaaaa acactctaat acgcctgtgc tgttagatat cacttctttt 120 gattggagcg ataggaaaat gcaattagaa cttttcccta ttgatttgcc ctatgcgagc 180 gcgaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agacgcgctc 240 aaatgcatgg gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgttt ttgaatacga gcctaaattg 300 ctaaagccaa gccgcttgac ttattttttt ggctatttcc aagatccacg atactttgat 360 gctatatccc ctttaatcaa gcaaaccttc actctacccc ccccccccga aaataataag 420 aataataata aaaaagagga agaatatcag tgcaagcttt ctttgatttt agccgctaaa 480 aacagcgtgt ttgtgcatat aagaagaggg gattatgtgg ggattggctg tcagcttggt 540 attgactatc aaaaaaaggc gcttgagtat atggcaaagc gcgtgccaaa catggagctt 600 tttgtgtttt gcgaagactt agaattcacg caaaatcttg atcttggcta cccttttatg 660 gacatgacca ctagggataa agaagaagag gcgtattggg acatgctgct catgcaatct 720 tgtcagcatg gcattatcgc taatagcact tatagctggt gggcggccta tttgatagaa 780 aatccagaaa aaatcattat tggccccaaa cactggcttt ttgggcatga gaatatcctt 840 tgtaaggagt gggtgaaaat agaatcccat tttgaggtaa aatcccaaaa gtataacgct 900 taa 903 <210> 6 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D3fucT2 <400> 6 atggatgatg atgcttttaa ggtggtgcaa atttgcggag ggcttgggaa tcaaatgttt 60 caatacgctt tcgctaaaag tttgcaaaaa cactctaata cgcctgtgct gttagatatc 120 acttcttttg attggagcga taggaaaatg caattagaac ttttccctat tgatttgccc 180 tatgcgagcg cgaaagaaat cgctatagct aaaatgcaac acctccccaa gctagtaaga 240 gacgcgctca aatgcatggg atttgatagg gtgagtcaag aaatcgtttt tgaatacgag 300 cctaaattgc taaagccaag ccgcttgact tatttttttg gctatttcca agatccacga 360 tactttgatg ctatatcccc tttaatcaag caaaccttca ctctaccccc cccccccgaa 420 aataataaga ataataataa aaaagaggaa gaatatcagt gcaagctttc tttgatttta 480 gccgctaaaa acagcgtgtt tgtgcatata agaagagggg attatgtggg gattggctgt 540 cagcttggta ttgactatca aaaaaaggcg cttgagtata tggcaaagcg cgtgccaaac 600 atggagcttt ttgtgttttg cgaagactta gaattcacgc aaaatcttga tcttggctac 660 ccttttatgg acatgaccac tagggataaa gaagaagagg cgtattggga catgctgctc 720 atgcaatctt gtcagcatgc cattatcgct aatagcactt atagctggtg ggcggcctat 780 ttgatagaaa atccagaaaa aatcattatt ggccccaaac actggctttt tgggcatgag 840 aatatccttt gtaaggagtg ggtgaaaata gaatcccatt ttgaggtaaa atcccaaaag 900 tataacgctt aa 912 <210> 7 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> infBfucT2 <400> 7 atgacagatg taacgattaa agcttttaag gtggtgcaaa tttgcggagg gcttgggaat 60 caaatgtttc aatacgcttt cgctaaaagt ttgcaaaaac actctaatac gcctgtgctg 120 ttagatatca cttcttttga ttggagcgat aggaaaatgc aattagaact tttccctatt 180 gatttgccct atgcgagcgc gaaagaaatc gctatagcta aaatgcaaca cctccccaag 240 ctagtaagag acgcgctcaa atgcatggga tttgataggg tgagtcaaga aatcgttttt 300 gaatacgagc ctaaattgct aaagccaagc cgcttgactt atttttttgg ctatttccaa 360 gatccacgat actttgatgc tatatcccct ttaatcaagc aaaccttcac tctacccccc 420 ccccccgaaa ataataagaa taataataaa aaagaggaag aatatcagtg caagctttct 480 ttgattttag ccgctaaaaa cagcgtgttt gtgcatataa gaagagggga ttatgtgggg 540 attggctgtc agcttggtat tgactatcaa aaaaaggcgc ttgagtatat ggcaaagcgc 600 gtgccaaaca tggagctttt tgtgttttgc gaagacttag aattcacgca aaatcttgat 660 cttggctacc cttttatgga catgaccact agggataaag aagaagaggc gtattgggac 720 atgctgctca tgcaatcttg tcagcatgcc attatcgcta atagcactta tagctggtgg 780 gcggcctatt tgatagaaaa tccagaaaaa atcattattg gccccaaaca ctggcttttt 840 gggcatgaga atatcctttg taaggagtgg gtgaaaatag aatcccattt tgaggtaaaa 900 tcccaaaagt ataacgctta a 921 <210> 8 <211> 1476 <212> DNA <213> E. coli K-12 ATCC10798 <400> 8 atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60 cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120 ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180 gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240 accctgagtg cacgtctgga tttttgtaat ctcgatgtca atgacactgc tgcattcagc 300 cgtctcggcg cgatgctgga tcaaaaaaat cgtatcacca ttaactactt tgccatgccg 360 cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420 gcacgcgtag tcatggagaa accgctgggg acgtcgctgg cgacctcgca ggaaatcaat 480 gatcaggttg gcgaatactt cgaggagtgc caggtttacc gtatcgacca ctatcttggt 540 aaagaaacgg tgctgaacct gttggcgctg cgttttgcta actccctgtt tgtgaataac 600 tgggacaatc gcaccattga tcatgttgag attaccgtgg cagaagaagt ggggatcgaa 660 gggcgctggg gctattttga taaagccggt cagatgcgcg acatgatcca gaaccacctg 720 ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780 cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840 gaaaaaaccg tacgcgggca atatactgcg ggcttcgccc agggcaaaaa agtgccggga 900 tatctggaag aagagggcgc gaacaagagc agcaatacag aaactttcgt ggcgatccgc 960 gtcgacattg ataactggcg ctgggccggt gtgccattct acctgcgtac tggtaaacgt 1020 ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080 aaagaatcgt ggcaggatct gccgcagaat aaactgacta tccgtctgca acctgatgaa 1140 ggcgtggata tccaggtact gaataaagtt cctggccttg accacaaaca taacctgcaa 1200 atcaccaagc tggatctgag ctattcagaa acctttaatc agacgcatct ggcggatgcc 1260 tatgaacgtt tgctgctgga aaccatgcgt ggtattcagg cactgtttgt acgtcgcgac 1320 gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380 gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440 acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476 <210> 9 <211> 1305 <212> DNA <213> E. coli K-12 ATCC10798 <400> 9 atgaaatttc ccggtaaacg taaatccaaa cattacttcc ccgtaaacgc acgcgatccg 60 ctgcttcagc aattccagcc agaaaacgaa accagcgctg cctgggtagt gggtatcgat 120 caaacgctgg tcgatattga agcgaaagtg gatgatgaat ttattgagcg ttatggatta 180 agcgccgggc attcactggt gattgaggat gatgtagccg aagcgcttta tcaggaacta 240 aaacagaaaa acctgattac ccatcagttt gcgggtggca ccattggtaa caccatgcac 300 aactactcgg tgctcgcgga cgaccgttcg gtgctgctgg gcgtcatgtg cagcaatatt 360 gaaattggca gttatgccta tcgttacctg tgtaacactt ccagccgtac cgatcttaac 420 tatctacaag gcgtggatgg cccgattggt cgttgcttta cgctgattgg cgagtccggg 480 gaacgtacct ttgctatcag tccaggccac atgaaccagc tgcgggctga aagcattccg 540 gaagatgtga ttgccggagc ctcggcactg gttctcacct catatctggt gcgttgcaag 600 ccgggtgaac ccatgccgga agcaaccatg aaagccattg agtacgcgaa gaaatataac 660 gtaccggtgg tgctgacgct gggcaccaag tttgtcattg ccgagaatcc gcagtggtgg 720 cagcaattcc tcaaagatca cgtctctatc cttgcgatga acgaagatga agccgaagcg 780 ttgaccggag aaagcgatcc gttgttggca tctgacaagg cgctggactg ggtagatctg 840 gtgctgtgca ccgccgggcc aatcggcttg tatatggcgg gctttaccga agacgaagcg 900 aaacgtaaaa cccagcatcc gctgctgccg ggcgctatag cggaattcaa ccagtatgag 960 tttagccgcg ccatgcgcca caaggattgc cagaatccgc tgcgtgtata ttcgcacatt 1020 gcgccgtaca tgggcgggcc ggaaaaaatc atgaacacta atggagcggg ggatggcgca 1080 ttggcagcgt tgctgcatga cattaccgcc aacagctacc atcgtagcaa cgtaccaaac 1140 tccagcaaac ataaattcac ctggttaact tattcatcgt tagcgcaggt gtgtaaatat 1200 gctaaccgtg tgagctatca ggtactgaac cagcattcac ctcgtttaac gcgcggcttg 1260 ccggagcgtg aagacagcct ggaagagtct tactgggatc gttaa 1305 <210> 10 <211> 864 <212> DNA <213> Bacteroides fragilesATCC25285 <400> 10 atgttatatg taattttacg tggacgatta ggtaataatc tttttcagat agcaactgcc 60 gcttcgttga ctcagaattt tatattttgt acagtaaata aggaccaaga gagacaggtc 120 cttttgtata aggattcttt ttttaaaaat ataaaagtta tgaagggggt tcctgatggc 180 ataccatatt acaaagaacc attccatgaa tttagcagaa ttccttatga agaaggaaag 240 gatctcatta ttgatggata tttccaatca gaaaagtact ttaaaagaag tgtcgtatta 300 gatctttata gaataactga tgagctaagg aagaaaatat ggaatatttg tggaaatatt 360 ttagaaaagg gagaaactgt gagtattcat gttagaagag gtgattactt gaagctgcca 420 catgcattac cattttgtgg aaagtcatac tataagaatg ctattcaata tattggtgag 480 gataaaatat tcattatttg tagtgatgat atcgattggt gtaaaaaaaa ctttatagga 540 aaaagatatt acttcataga gaacactact cctttactag atttatatat ccaatccttg 600 tgcactcaca atattataag taatagctct tttagttggt ggggagcatg gcttaatgaa 660 aatagtaata aaattgttat tgcacctcaa atgtggtttg gcatttctgt gaagttgggt 720 gttagtgatt tattgcctgt cagttgggtt cgacttccta ataattatac tttaggaaga 780 tattgttttg ctctatataa agtagttgag gactatttat taaatattct gcgattaata 840 tggaaaagaa agaagaatat gtga 864 <210> 11 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_del_lac primer <400> 11 cgaatggcgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga gtgtaggctg 60 gagctgcttc g 71 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_del_lac primer <400> 12 tcctgcgctt tgttcatgcc ggatgcggct aatgtagatc gctgaacttg attccgggga 60 tccgtcgacc 70 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1_M15 lac primer <400> 13 aattaatcag atcccgggac catcgaatgg cgcaaaacct ttc 43 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2_M15 lac primer <400> 14 ggtgcgggcc acgacggcca gtgaatccgt aatca 35 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3_M15 lac primer <400> 15 tggccgtcgt ggcccgcacc gatcgcc 27 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_M15 lac primer <400> 16 ggccgctatt gacccggggc tgtgggtcaa agaggcatga tg 42 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_NdeI_gsk primer <400> 17 ggaattccat atgaaatttc ccggtaaacg taa 33 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_PacI_gsk primer <400> 18 cttaattaat taacgatccc agtaagactc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_NdeI_zwf primer <400> 19 ggaattccat atggcggtaa cgcaaacagc 30 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_PacI_zwf primer <400> 20 cttaattaat tactcaaact cattccagga acg 33 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_ NdeI_D3fucT2 primer <400> 21 ggaattccat atggatgatg atgcttttaa 30 <210> 22 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_ NdeI_infBfucT2 primer <400> 22 ggaattcata tgacagatgt aacgattaaa gcttttaagg tggtgcaaat ttgc 54 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_KpnI_fucT2 primer <400> 23 gggtaccatt aagcgttata cttttgggat tttacct 37 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_ NdeI_wcfB primer <400> 24 ggaattcata tgttatatgt aattttacgt ggacgattag g 41 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_KpnI_wcfB primer <400> 25 gggtacctca catattcttc tttcttttcc atattaatcg c 41 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacYA Primer <400> 26 tggatttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcc 39 <210> 27 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacYA Primer <400> 27 aatttcacac aggaaatcca ttatgtacta tttaaaaaac acaaactttt gg 52 <210> 28 <211> 6169 <212> DNA <213> E. coli K-12 ATCC10798 <400> 28 gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60 tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120 gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180 tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240 gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300 cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 360 gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 420 actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 480 ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag 540 caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc 600 tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 660 agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact 720 gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc 780 gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 840 tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 900 gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 960 gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 1020 gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 1080 tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 1140 tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 1200 cagctatgac catgattacg gattcactgg ccgtcgtggc ccgcaccgat cgcccttccc 1260 aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg 1320 tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa 1380 actggcagat gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg 1440 tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg 1500 ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc gttaactcgg 1560 cgtttcatct gtggtgcaac gggcgctggg tcggttacgg ccaggacagt cgtttgccgt 1620 ctgaatttga cctgagcgca tttttacgcg ccggagaaaa ccgcctcgcg gtgatggtgc 1680 tgcgctggag tgacggcagt tatctggaag atcaggatat gtggcggatg agcggcattt 1740 tccgtgacgt ctcgttgctg cataaaccga ctacacaaat cagcgatttc catgttgcca 1800 ctcgctttaa tgatgatttc agccgcgctg tactggaggc tgaagttcag atgtgcggcg 1860 agttgcgtga ctacctacgg gtaacagttt ctttatggca gggtgaaacg caggtcgcca 1920 gcggcaccgc gcctttcggc ggtgaaatta tcgatgagcg tggtggttat gccgatcgcg 1980 tcacactacg tctgaacgtc gaaaacccga aactgtggag cgccgaaatc ccgaatctct 2040 atcgtgcggt ggttgaactg cacaccgccg acggcacgct gattgaagca gaagcctgcg 2100 atgtcggttt ccgcgaggtg cggattgaaa atggtctgct gctgctgaac ggcaagccgt 2160 tgctgattcg aggcgttaac cgtcacgagc atcatcctct gcatggtcag gtcatggatg 2220 agcagacgat ggtgcaggat atcctgctga tgaagcagaa caactttaac gccgtgcgct 2280 gttcgcatta tccgaaccat ccgctgtggt acacgctgtg cgaccgctac ggcctgtatg 2340 tggtggatga agccaatatt gaaacccacg gcatggtgcc aatgaatcgt ctgaccgatg 2400 atccgcgctg gctaccggcg atgagcgaac gcgtaacgcg aatggtgcag cgcgatcgta 2460 atcacccgag tgtgatcatc tggtcgctgg ggaatgaatc aggccacggc gctaatcacg 2520 acgcgctgta tcgctggatc aaatctgtcg atccttcccg cccggtgcag tatgaaggcg 2580 gcggagccga caccacggcc accgatatta tttgcccgat gtacgcgcgc gtggatgaag 2640 accagccctt cccggctgtg 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agtgaagcga cccgcattga ccctaacgcc tgggtcgaac 3540 gctggaaggc ggcgggccat taccaggccg aagcagcgtt gttgcagtgc acggcagata 3600 cacttgctga tgcggtgctg attacgaccg ctcacgcgtg gcagcatcag gggaaaacct 3660 tatttatcag ccggaaaacc taccggattg atggtagtgg tcaaatggcg attaccgttg 3720 atgttgaagt ggcgagcgat acaccgcatc cggcgcggat tggcctgaac tgccagctgg 3780 cgcaggtagc agagcgggta aactggctcg gattagggcc gcaagaaaac tatcccgacc 3840 gccttactgc cgcctgtttt gaccgctggg atctgccatt gtcagacatg tataccccgt 3900 acgtcttccc gagcgaaaac ggtctgcgct gcgggacgcg cgaattgaat tatggcccac 3960 accagtggcg cggcgacttc cagttcaaca tcagccgcta cagtcaacag caactgatgg 4020 aaaccagcca tcgccatctg ctgcacgcgg aagaaggcac atggctgaat atcgacggtt 4080 tccatatggg gattggtggc gacgactcct ggagcccgtc agtatcggcg gaattccagc 4140 tgagcgccgg tcgctaccat taccagttgg tctggtgtca aaaataataa taaccgggca 4200 ggccatgtct gcccgtattt cgcgtaagga aatccattat gtactattta aaaaacacaa 4260 acttttggat gttcggttta ttctttttct tttacttttt tatcatggga gcctacttcc 4320 cgtttttccc gatttggcta catgacatca accatatcag caaaagtgat acgggtatta 4380 tttttgccgc tatttctctg ttctcgctat tattccaacc gctgtttggt ctgctttctg 4440 acaaactcgg gctgcgcaaa tacctgctgt ggattattac cggcatgtta gtgatgtttg 4500 cgccgttctt tatttttatc ttcgggccac tgttacaata caacatttta gtaggatcga 4560 ttgttggtgg tatttatcta ggcttttgtt ttaacgccgg tgcgccagca gtagaggcat 4620 ttattgagaa agtcagccgt cgcagtaatt tcgaatttgg tcgcgcgcgg atgtttggct 4680 gtgttggctg ggcgctgtgt gcctcgattg tcggcatcat gttcaccatc aataatcagt 4740 ttgttttctg gctgggctct ggctgtgcac tcatcctcgc cgttttactc tttttcgcca 4800 aaacggatgc gccctcttct gccacggttg ccaatgcggt aggtgccaac cattcggcat 4860 ttagccttaa gctggcactg gaactgttca gacagccaaa actgtggttt ttgtcactgt 4920 atgttattgg cgtttcctgc acctacgatg tttttgacca acagtttgct aatttcttta 4980 cttcgttctt tgctaccggt gaacagggta cgcgggtatt tggctacgta acgacaatgg 5040 gcgaattact taacgcctcg attatgttct ttgcgccact gatcattaat cgcatcggtg 5100 ggaaaaacgc cctgctgctg gctggcacta ttatgtctgt acgtattatt ggctcatcgt 5160 tcgccacctc agcgctggaa gtggttattc tgaaaacgct gcatatgttt gaagtaccgt 5220 tcctgctggt gggctgcttt aaatatatta ccagccagtt tgaagtgcgt ttttcagcga 5280 cgatttatct ggtctgtttc tgcttcttta agcaactggc gatgattttt atgtctgtac 5340 tggcgggcaa tatgtatgaa agcatcggtt tccagggcgc ttatctggtg ctgggtctgg 5400 tggcgctggg cttcacctta atttccgtgt tcacgcttag cggccccggc ccgctttccc 5460 tgctgcgtcg tcaggtgaat gaagtcgctt aagcaatcaa tgtcggatgc ggcgcgagcg 5520 ccttatccga ccaacatatc ataacggagt gatcgcattg aacatgccaa tgaccgaaag 5580 aataagagca ggcaagctat ttaccgatat gtgcgaaggc ttaccggaaa aaagacttcg 5640 tgggaaaacg ttaatgtatg agtttaatca ctcgcatcca tcagaagttg aaaaaagaga 5700 aagcctgatt aaagaaatgt ttgccacggt aggggaaaac gcctgggtag aaccgcctgt 5760 ctatttctct tacggttcca acatccatat aggccgcaat ttttatgcaa atttcaattt 5820 aaccattgtc gatgactaca cggtaacaat cggtgataac gtactgattg cacccaacgt 5880 tactctttcc gttacgggac accctgtaca ccatgaattg agaaaaaacg gcgagatgta 5940 ctcttttccg ataacgattg gcaataacgt ctggatcgga agtcatgtgg ttattaatcc 6000 aggcgtcacc atcggggata 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1500 ttacaataca acattttagt aggatcgatt gttggtggta tttatctagg cttttgtttt 1560 aacgccggtg cgccagcagt agaggcattt attgagaaag tcagccgtcg cagtaatttc 1620 gaatttggtc gcgcgcggat gtttggctgt gttggctggg cgctgtgtgc ctcgattgtc 1680 ggcatcatgt tcaccatcaa taatcagttt gttttctggc tgggctctgg ctgtgcactc 1740 atcctcgccg ttttactctt tttcgccaaa acggatgcgc cctcttctgc cacggttgcc 1800 aatgcggtag gtgccaacca ttcggcattt agccttaagc tggcactgga actgttcaga 1860 cagccaaaac tgtggttttt gtcactgtat gttattggcg tttcctgcac ctacgatgtt 1920 tttgaccaac agtttgctaa tttctttact tcgttctttg ctaccggtga acagggtacg 1980 cgggtatttg gctacgtaac gacaatgggc gaattactta acgcctcgat tatgttcttt 2040 gcgccactga tcattaatcg catcggtggg aaaaacgccc tgctgctggc tggcactatt 2100 atgtctgtac gtattattgg ctcatcgttc gccacctcag cgctggaagt ggttattctg 2160 aaaacgctgc atatgtttga agtaccgttc ctgctggtgg gctgctttaa atatattacc 2220 agccagtttg aagtgcgttt ttcagcgacg atttatctgg tctgtttctg cttctttaag 2280 caactggcga tgatttttat gtctgtactg gcgggcaata tgtatgaaag catcggtttc 2340 cagggcgctt atctggtgct gggtctggtg gcgctgggct tcaccttaat ttccgtgttc 2400 acgcttagcg gccccggccc gctttccctg ctgcgtcgtc aggtgaatga agtcgcttaa 2460 gcaatcaatg tcggatgcgg cgcgagcgcc ttatccgacc aacatatcat aacggagtga 2520 tcgcattgaa catgccaatg accgaaagaa taagagcagg caagctattt accgatatgt 2580 gcgaaggctt accggaaaaa agacttcgtg ggaaaacgtt aatgtatgag tttaatcact 2640 cgcatccatc agaagttgaa aaaagagaaa gcctgattaa agaaatgttt gccacggtag 2700 gggaaaacgc ctgggtagaa ccgcctgtct atttctctta cggttccaac atccatatag 2760 gccgcaattt ttatgcaaat ttcaatttaa ccattgtcga tgactacacg gtaacaatcg 2820 gtgataacgt actgattgca cccaacgtta ctctttccgt tacgggacac cctgtacacc 2880 atgaattgag aaaaaacggc gagatgtact cttttccgat aacgattggc aataacgtct 2940 ggatcggaag tcatgtggtt attaatccag gcgtcaccat cggggataat tctgttattg 3000 gcgcgggtag tatcgtcaca aaagacattc caccaaacgt cgtggcggct ggcgttcctt 3060 gtcgggttat tcgcgaaata aacgaccggg ataagcacta ttatttcaaa gattataaag 3120 ttgaatcgtc agtttaa 3137

Claims

2-푸코실락토오스 (2-Fucosyllactose, 2-FL)를 생산하는 대사회로를 가지는 E. coli BL21 균주에서,
(a) 내인성 lac 오페론이 제거되고, 서열번호 28로 표시되는 lacZ 변형 lac 오페론 또는 서열번호 29로 표시되는 lacY 및 lacA로 구성된 lac 오페론이 염색체에 도입; 및
(b) α-1,2-fucosyltransferase를 코딩하는 서열번호 10의 Bacteroides fragilis 유래 wcfB 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
(c) G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) 및 (d) GSK (guanosine-inosine kinase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
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제2항에 있어서,
상기 G6PDH를 코딩하는 유전자는 Escherichia coli strain K12, Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli O6:H1, Leuconostoc mesenteroides, Saccharomyces cerevisiae, Dictyostelium discoideum, Pseudomonas aeruginosa, Nostoc sp., Mycobacterium smegmatis, Rhizobium meliloti, Streptococcus pneumoniae serotype 4, Zymomonas mobilis subsp. Mobilis, Bacillus subtilis, Chlamydia pneumonia, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Arabidopsis thaliana, Synechococcus elongates, Dickeya dadantii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Borrelia burgdorferi, Buchnera aphidicola subsp. Acyrthosiphon pisum, Buchnera aphidicola subsp. Schizaphis graminum, Buchnera aphidicola subsp. Baizongia pistaciae, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachomatis, Haemophilus influenza, Nostoc punctiforme, Synechocystis sp., Thermotoga maritime, Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Encephalitozoon cuniculi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Bacillus thuringiensis, Solanum tuberosum, Takifugu rubripes, 또는 Macropus robustus 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제2항에 있어서,
상기 G6PDH를 코딩하는 유전자는 zwf인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제2항에 있어서,
상기 GSK를 코딩하는 유전자는 Escherichia coli strain K-12, Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli O6:H1, Exiguobacterium acetylicum 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제2항에 있어서,
상기 GSK를 코딩하는 유전자는 gsk인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
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제1항에 있어서,
상기 2-푸코실락토오스는 de novo 합성 경로를 거쳐 합성되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
ManA (mannose-6-phosphate isomerase), ManB (phosphomannomutase), ManC (mannose-1-phosphate guanyltransferase), Gmd (GDP-D-mannose dehydratase) 및 WcaG (Nucleoside-diphosphate-sugar epimerases)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항, 제2항, 제6항 내지 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 배양하여 2-푸코실락토오스를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 2-푸코실락토오스를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-푸코실락토오스의 제조방법.
제17항에 있어서,
상기 배양은 글리세롤을 추가하는 유가배양인 것을 특징으로 하는 2-푸코실락토오스의 제조방법.