CN116948928A - 种子培养基及无抗生素、无iptg诱导剂的2’-岩藻糖基乳糖的发酵生产方法 - Google Patents
种子培养基及无抗生素、无iptg诱导剂的2’-岩藻糖基乳糖的发酵生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种种子培养基及无抗生素、无IPTG诱导剂的2’‑岩藻糖基乳糖的发酵生产方法。本发明的培养基包含：10～12g/L蛋白胨、5～16g/L酵母提取物、10～12g/L氯化钠，还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/L甘油或1～10g/L的葡萄糖、0.01～0.15mol/L磷酸盐缓冲液、10～100mg/L酸性氨基酸和0.1～1.0mg/L维生素。通过本发明的培养基对本发明的重组大肠杆菌进行培养，能够得到生长状态良好、活力强的重组大肠杆菌种子液，从而在将该重组大肠杆菌种子液用于以甘油为碳源，乳糖为底物的摇瓶发酵或工业发酵时能够得到产量很高的2’‑岩藻糖基乳糖产物，具有很好的工业化生产前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，涉及一种种子培养基及无抗生素、无IPTG诱导剂的2’-岩藻糖基乳糖的发酵生产方法。
背景技术
母乳低聚糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)又称为人乳寡糖，是成熟人乳中含量最丰富的成分之一。其中，2’-岩藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose，2'-FL)又是人乳寡糖中含量最高的成分。2’-岩藻糖基乳糖能选择性地刺激双歧杆菌和乳杆菌等益生菌的生长，并通过形成受体类似物来抑制肠道致病菌对肠道的黏附，从而使婴儿的肠道不易受到肠道致病菌的感染。这些肠道致病菌包括大肠杆菌、霍乱弧菌和沙门氏菌等，因此，2’-岩藻糖基乳糖可以应用于婴幼儿食品中。
HMOs的一种制备方法为全细胞生物合成法。该方法将乳糖添加于未经基因敲除的大肠杆菌活细胞中，使活细胞以乳糖为原料合成HMOs。然而，活细胞能产生可分解乳糖的β-半乳糖苷酶，这会造成乳糖的损失，降低活细胞对乳糖的利用率，并最终影响HMOs的产量。因此，在HMOs生产时可以采用敲除或部分敲除了lacZ基因的大肠杆菌活细胞。由于lacZ基因是β-半乳糖苷酶的编码基因，如果在活细胞内的lacZ基因被敲除或部分敲除之后，活细胞内不存在有活性的β-半乳糖苷酶，或者活细胞内的β-半乳糖苷酶的活性有了大幅度地降低。这能够提高活细胞对乳糖的利用率，从而提高了HMOs的产量。然而，敲除或部分敲除了lacZ基因的活细胞在LB基础培养基中进行培养时初级种子的质量不高，从而影响到在扩大培养时或者在工业化种子培养时所产生的二级种子的质量，并最终影响到工业化发酵时2’-岩藻糖基乳糖的产量。
发明内容
针对lacZ基因敲除后的活细胞在LB基础培养基中的活力不高，从而导致2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)产量低的问题，本发明实施例提供一种培养基及其发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，解决了上述技术问题。
本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明第一方面提供一种培养基，所述培养基包含：10～12g/L蛋白胨、5～16g/L酵母提取物、10～12g/L氯化钠，还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/L甘油或1～10g/L的葡萄糖、0.01～0.15mol/L磷酸盐缓冲液、10～100mg/L酸性氨基酸和0.1～1.0mg/L维生素。
在某一较佳实施方案中，所述培养基包括10～12g/L蛋白胨、5～10g/L酵母提取物、10～12g/L氯化钠、1～20g/L甘油、2～3g/L KH2PO4或1.76～2.64g/LNaH2PO4、12～20g/LK2HPO4或9.78～16.3g/LNa2HPO4、30～80mg/L酸性氨基酸和0.1～0.5mg/L维生素。
在某一较佳实施方案中，所述培养基包括10g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、5g/L甘油、2.31g/L的KH2PO4或NaH2PO4、16.43g/L的K2HPO4或Na2HPO4、50mg/L的酸性氨基酸和0.1mg/L的维生素。
在某一较佳实施方案中，所述酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸中的一种或两种。
在某一较佳实施方案中，所述维生素选自VB1、VB2或VB12中的一种或多种。
在某一较佳实施方案中，所述培养基的pH值为6.0～7.0，例如为6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9。
本发明所述的培养基可为本领域常规目的使用，例如传代培养基、发酵培养基或种子培养基等。
在本发明具体实施方案中，所述培养基特别作为种子培养基，用于培养种子液使用。
在某一较佳实施方案中，所述培养基用于在例如总体积为150mL或250mL的培养容器中培养重组大肠杆菌，以得到重组大肠杆菌的种子液。该种子液可用于后继对种子的扩大化培养或者用作工业化发酵的种子液。所述重组大肠杆菌见下文本发明第二方面中所定义。
本发明第二方面提供一种重组大肠杆菌，其为lacZ基因部分失活，wacJ基因和pfkA基因缺失，lacY基因和fucT基因过表达的大肠杆菌BL21(λDE3)；进一步，所述重组大肠杆菌过表达manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因，所述重组大肠杆菌的fucK-fucI基因、araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因中的两种、三种、四种或五种缺失。
在某一较佳实施方案中，lacZ基因的部分失活指的是其编码产生的β-半乳糖苷酶的表达量相对于野生型大肠杆菌而言有了大幅度降低，但是仍然具有3％至5％的β-半乳糖苷酶的表达量。
在某一具体实施方案中，所述pfkA基因的登录号为CAQ34267.1。
在某一具体实施方案中，所述gmm基因的登录号为CAQ32463.1。
在某一具体实施方案中，所述nudK基因的登录号为CAQ32837.1。
在某一具体实施方案中，所述araA基因的登录号为CAQ30580.1。
在某一具体实施方案中，所述rhaA基因的登录号为CAQ34255.2。
在某一具体实施方案中，所述rcsA基因的登录号为WP_182557942.1。
在某一具体实施方案中，所述lacY基因的登录号为CAQ30818.2。
在某一具体实施方案中，所述manB基因的登录号为CAQ32460.1。
在某一具体实施方案中，所述manC基因的登录号为CAQ32461.1。
在某一具体实施方案中，所述gmd基因的登录号为CAQ32465.2。
在某一具体实施方案中，所述wcaG基因的登录号为CAQ32464.1。
在某一具体实施方案中，所述fucT基因的登录号为RTL12957.1。
在某一较佳实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
araA基因和nudK基因缺失；
rhaA基因和gmm基因缺失；
araA基因和rhaA基因缺失；
araA基因和gmm基因缺失；
rhaA基因和nudK基因缺失；
nudK基因和gmm基因缺失。
在某一较佳实施方案中，所述fucT基因构建于pET28a质粒上。
在某一较佳实施方案中，所述lacY基因的过表达是lacY基因整合入大肠杆菌基因组pfkA基因处实现。
在某一较佳实施方案中，所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC共表达质粒上。
在某一较佳实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
araA基因和gmm基因缺失；
rhaA基因和nudK基因缺失；
nudK基因和gmm基因缺失；
araA基因和nudK基因缺失；
rhaA基因和gmm基因缺失；
araA基因和rhaA基因缺失；
araA基因、rhaA基因和nudK基因缺失；
araA基因、nudK基因和gmm基因缺失；
araA基因、rhaA基因和gmm基因缺失；
araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因缺失。
在某一较佳实施方案中，LacY基因、fucT基因分别构建于pET28a质粒载体上。
在某一较佳实施方案中，LacY基因、fucT基因共同构建于pET28a质粒载体上。
在某一较佳实施方案中，所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC共表达质粒上。
在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsA基因，所述过表达rcsA基因是通过整合rcsA基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现。
在某一较佳实施方案中，rcsA基因整合入大肠杆菌基因组pfkA基因处。
本发明所述的araA基因与rhaA基因编码将L-岩藻糖转变为墨角藻糖的相关酶，本发明所述的rcsA基因、gmm基因和nudK基因为GDP-甘露糖降解相关的基因，所述pfkA基因为果糖-6-磷酸降解相关的基因，所述lacY基因编码乳糖透性酶LacY；所述rcsA基因为转录调控因子。
本发明涉及从头合成GDP-岩藻糖必需的四个酶：所述manB基因编码合成磷酸甘露糖变位酶，所述manC基因编码合成甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(mannose-1-phosphateguanosyltransferase)，所述gmd基因编码合成GDP-甘露糖-4,6-脱水酶，所述wcaG基因编码合成GDP-L-岩藻糖合酶。
本发明第三方面提供一种培养体系，其特征在于，所述培养体系包括如本发明第一方面所述的培养基以及本发明第二方面所述的重组大肠杆菌。
在某一较佳实施方案中，所述重组大肠杆菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(λDE3)。对该大肠杆菌BL21(λDE3)进行基因改造，得到整合了溶原性λDE3并且lacZ基因部分失活的大肠杆菌BL21(λDE3)lacZ(△M15)菌株。因为具有完整lacZ基因的野生型大肠杆菌BL21(λDE3)能够表达lacZ基因从而产生β-半乳糖苷酶，而大肠杆菌BL21(λDE3)lacZ(△M15)菌株的lacZ基因已部分失活或部分被敲除，但此类细胞中β-半乳糖苷酶保留了较少的活性，故大肠杆菌BL21(λDE3)lacZ(△M15)菌株只可产生微量可催化乳糖分解为葡萄糖和半乳糖的β-半乳糖苷酶。
在某一较佳实施方案中，重组大肠杆菌不含有可表达的fucK-fucI基因。
在某一较佳实施方案中，重组大肠杆菌不产生可催化L-岩藻糖生成墨角藻糖的L-岩藻糖异构酶(FucI)，并且不产生可催化墨角藻糖生成墨角藻糖-1-磷酸的墨角藻糖激酶(FucK)。
在某一较佳实施方案中，重组大肠杆菌不含有可表达的wacJ基因。
在某一较佳实施方案中，重组大肠杆菌不产生可催化GDP-岩藻糖生成可拉酸的尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖脂质载体转移酶(WcaJ)。
在某一较佳实施方案中，所述培养体系中，所述重组大肠杆菌来源于单菌落或菌液。
当所述重组大肠杆菌来源于菌液时，所述菌液体积占培养基体积的0.1％至10％(v/v)。例如可以为1％、2％、3％、5％、8％、9％或10％。
本发明第四方面提供一种本发明第三方面所述的重组大肠杆菌的培养方法，其通过如本发明第一方面所述的培养基对重组大肠杆菌进行培养。
在某一较佳实施方案中，所述培养方法包括如下步骤：
在某一较佳实施方案中，所述培养方法包括：将所述重组大肠杆菌接种入所述培养基中或以0.1％至10％(v/v)的菌液接种入所述培养基中，然后进行振荡培养。
在某一较佳实施方案中，接种量可以为0.30％、0.47％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
上述接种量代表重组大肠杆菌的菌液占培养基的体积百分比。
在某一较佳实施方案中，当振荡培养后的菌液的OD600达到0.6～2.5时终止培养。
在某一较佳实施方案中，当振荡培养后的菌液的OD600达到0.8～1.8时终止培养。如果用于扩大培养，则OD600达到0.6～0.8时终止培养并移种。如果用于发酵，则OD600达到1.8～2.0时终止培养并移入发酵罐中进行发酵。
在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的温度为35～38℃。
在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的速度为180～300rpm。
在某一较佳实施方案中，所述振荡培养的时间为6～10h。
本发明的重组大肠杆菌的培养方法，也可以由所述重组大肠杆菌存在于本发明第三方面所述的培养体系中，并对该培养体系进行发酵实现。
本发明第五方面提供一种种子发酵液，其通过如本发明第四方面所述的培养方法获得，或者通过对如本发明第三方面所述的培养体系进行发酵获得。
本发明第六方面提供一种发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，通过如本发明第五方面所述的种子发酵液与乳糖共同发酵生产2’-岩藻糖基乳糖。
在某一较佳实施方案中，所述方法包括：
(1)在36～37℃的初始温度下，将所述种子发酵液按照1％～10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，得到初始发酵体系；
(2)当所述初始发酵体系的溶解氧升至50％以上时，采用补料培养基对所述初始发酵体系进行补料，并控制补料后的发酵体系的溶解氧水平在30±3％的范围内以及其pH值为7.1～7.2；
(3)待所述补料后的发酵体系的OD600升至18～22时，将发酵温度降至25～27℃并维持该发酵温度，加入终浓度为5～30g/L的乳糖，发酵结束后得到含有2’-岩藻糖基乳糖的发酵液。
上述接种量表示种子发酵液占发酵培养基的体积百分比。
在某一较佳实施方案中，在发酵的过程中，每隔2～4h对乳糖进行补料，以将乳糖的终浓度调回5～30g/L(初始终浓度)，并控制pH值为7.0～7.2。
在某一较佳实施方案中，在进行所述接种后，通过通气和/或搅拌使所述初始发酵体系的溶解氧在30±3％。但是随着发酵过程的进行，溶解氧会无法控制在30±3％而逐渐升高，当溶解氧升至50％以上时，进入步骤(2)。
在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基包括：18～20g/L甘油、12～15g/L蛋白胨、8～10g/L酵母提取物以及12～15g/LNaCl；所述发酵培养基的pH值为7.1～7.2。
在某一较佳实施方案中，所述补料培养基包括：500～600g/L甘油、20～30g/L蛋白胨、10～20g/L酵母提取物以及15～20g/L NaCl。
在某一较佳实施方案中，所述补料培养基的补料速度为5～5.5mL/L/h。
在某一较佳实施方案中，在所述补料后的发酵体系的OD600升至20时降低所述发酵温度。
在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基还包括镁盐。
在某一较佳实施方案中，所述镁盐为硫酸镁，所述镁盐的含量为0.1～1g/L，例如0.24g/L。
在某一较佳实施方案中，在100～118h的发酵时间里可以取得较优的发酵效果，例如105h、108h、110h、112h或115h。
步骤(3)中，乳糖的终浓度指的是乳糖刚加入时的初始浓度，并非发酵过程中的浓度。因为随着发酵过程的进行，上述物质的实时浓度会有所变化。
在本发明的具体实施方案中，在步骤(2-3)中，发酵结束后得到的发酵液中，2’-岩藻糖基乳糖的含量可以为90～100g/L。
本发明第七方面提供一种如本发明第一方面所述的培养基或如本发明第三方面所述的培养体系在培养如本发明第二方面所述的重组大肠杆菌中的应用。
本发明第八方面一种如本发明第一方面所述的培养基、如本发明第二方面所述的重组大肠杆菌、如本发明第三方面所述的培养体系或如本发明第五方面所述的种子发酵液在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明以重组大肠杆菌作为目标菌株并对其培养基进行了优化，获得了适用于该重组大肠杆菌种子生长的培养基。该重组大肠杆菌与培养基的配合使用能够得到生长状态良好、活力强的重组大肠杆菌种子发酵液。在将该重组大肠杆菌种子发酵液用于以甘油为碳源，乳糖为底物的摇瓶发酵或工业发酵时，能够得到产量很高的2’-岩藻糖基乳糖产物，具有很好的工业化生产前景。
具体实施方式
为更进一步地阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合具体的实施例进行详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。以下的各个实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。在不违背本领域常识的基础上，以下的各个实施例可以任意组合，并形成其它的实施例。
本发明提供了一种培养基，特别用于对重组大肠杆菌进行培养的培养基。
在本发明的一些实施方案中，种子培养基包含：10～12g/L蛋白胨、5～16g/L酵母提取物、10～12g/L氯化钠，还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/L甘油或1～10g/L的葡萄糖、0.01～0.15mol/L磷酸盐缓冲液、10～100mg/L酸性氨基酸和0.1～1.0mg/L维生素。
其中，上述数值范围指的是各种组分在种子培养基中的终浓度。并且上述数值范围的含义是某一组分在对应数值范围内的任意一个数字均可以，而并不限于每个数值范围的端点值。例如，蛋白胨的终浓度可以为10、10.5、11、11.5或12g/L。酵母提取物(Yeastextract)又称酵母抽提物，其制备方法具体参见GB/T 20886.2-2021。酵母提取物的终浓度可以为5、5.2、5.3、5.5、5.6、5.8、5.9、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16g/L。酵母提取物既可以作为重组大肠杆菌生长时的氮源，也可以为其提供多种生长因子等。氯化钠的终浓度可以为10、10.5、11、11.5或12g/L。甘油主要用作重组大肠杆菌生长时的碳源，其终浓度可以为1、5、8、9、10、12、15、17、18或20g/L。葡萄糖终浓度可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10g/L。磷酸盐缓冲液可以为重组大肠杆菌的生长提供磷源(例如用于菌体本身核酸、磷脂等的合成，用于质粒的复制)等，也可以作为pH值的缓冲液以及维持重组大肠杆菌菌体细胞的渗透压等。磷酸盐缓冲液可以是KH2PO4和K2HPO4、或者NaH2PO4和Na2HPO4，KH2PO4的终浓度可以为2、2.1、2.2、2.3、2.31、2.5、2.8或3g/L，NaH2PO4的终浓度可以为1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.3、2.4、2.5、或2.6g/L。K2HPO4的终浓度可以为12、14、15、16、16.43、18、19或20g/L，Na2HPO4的终浓度可以为10、11、12、13、14、15或16g/L。酸性氨基酸的终浓度可以为10、20、30、40、50、60、80、90或100mg/L。维生素的终浓度可以为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9或1.0mg/L。
在本发明的一些实施方案中，10g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、5g/L甘油、2.31g/L的KH2PO4或NaH2PO4、16.43g/L的K2HPO4或Na2HPO4、50mg/L的酸性氨基酸和0.1mg/L的维生素。
在本发明的一些实施方案中，酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸中的一种或两种。
在本发明的一些实施方案中，维生素选自VB1、VB2或VB12中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，培养基的pH值为6.0～7.0。
在本发明的一些实施方案中，培养基用于在总体积为150mL或250mL的培养容器中培养重组大肠杆菌，以得到重组大肠杆菌的种子液。
本发明还提供一种重组大肠杆菌，其为lacZ基因部分失活，wacJ基因和pfkA基因缺失，lacY基因和fucT基因过表达的大肠杆菌BL21(λDE3)；进一步，所述重组大肠杆菌过表达manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因，所述重组大肠杆菌的fucK-fucI基因、araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因中的两种、三种、四种或五种缺失。
在本发明的一些实施方案中，lacZ基因的部分失活指的是其编码产生的β-半乳糖苷酶的表达量相对于野生型大肠杆菌而言有了大幅度降低，但是仍然具有3％至5％的β-半乳糖苷酶的表达量。
在本发明的一些实施方案中，所述pfkA基因的登录号为CAQ34267.1。
在本发明的一些实施方案中，所述gmm基因的登录号为CAQ32463.1。
在本发明的一些实施方案中，所述nudK基因的登录号为CAQ32837.1。
在本发明的一些实施方案中，所述araA基因的登录号为CAQ30580.1。
在本发明的一些实施方案中，所述rhaA基因的登录号为CAQ34255.2。
在本发明的一些实施方案中，所述rcsA基因的登录号为WP_182557942.1。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的登录号为CAQ30818.2。
在本发明的一些实施方案中，所述manB基因的登录号为CAQ32460.1。
在本发明的一些实施方案中，所述manC基因的登录号为CAQ32461.1。
在本发明的一些实施方案中，所述gmd基因的登录号为CAQ32465.2。
在本发明的一些实施方案中，所述wcaG基因的登录号为CAQ32464.1。
在本发明的一些实施方案中，所述fucT基因的登录号为RTL12957.1。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因和nudK基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaA基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因和rhaA基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaA基因和nudK基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过整合lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的nudK基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述fucT基因构建于pET28a-fucT表达质粒上。
在本发明的一些实施方案中，所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC共表达质粒上。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是通过将lacY基因整合入大肠杆菌基因组pfkA基因处来实现。
在本发明的一些实施方案中，所述重组大肠杆菌为：
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：lacY△araA△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：lacY△rhaA△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：lacY△araA△rhaA；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：lacY△araA△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：lacY△rhaA△nudK；
或，含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：lacY△nudK△gmm。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaA基因和nudK基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的nudK基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因和nudK基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的rhaA基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因和rhaA基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因、rhaA基因和nudK基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因、nudK基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因、rhaA基因和gmm基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组的araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因缺失。
在本发明的一些实施方案中，LacY基因、fucT基因分别构建于pET28a质粒载体上。
在本发明的一些实施方案中，LacY基因、fucT基因共同构建于pET28a质粒载体上。
在本发明的一些实施方案中，所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC共表达质粒上。
在本发明的一些实施方案中，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsA基因，所述rcsA基因是通过整合rcsA基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现。
在本发明的一些实施方案中，rcsA基因整合入大肠杆菌基因组pfkA基因处。
在本发明的一些实施方案中，所述重组大肠杆菌为
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△rhaA；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△rhaA△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△rhaA△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△nudK△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△rhaA△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△nudK△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△rhaA△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△rhaA△gmm△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△araA△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△rhaA△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△nudK△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△araA△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△rhaA△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△araA△rhaA；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△araA△rhaA△nudK；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△araA△nudK△gmm；
含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△araA△rhaA△gmm；
或，含有pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC和pET28a-fucT-LacY表达载体的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ△pfkA△araA△rhaA△gmm△nudK。
发明人在研究中发现，经过改造后的重组大肠杆菌与野生型的大肠杆菌相比，虽然在菌种层面上降低了副反应的发生，但是其在LB基础培养基中进行种子培养时所得到的初级种子(又称一级种子)的质量不高，故在转入更大体积的工业化发酵培养基中发酵时2’-岩藻糖基乳糖的产量也会受到影响，因此，本发明对种子培养基的成分也进行了优化。采用优化后的种子培养基对上述的重组大肠杆菌进行培养，会得到生长状态良好、活力强的重组大肠杆菌种子液，从而在将该重组大肠杆菌种子液用于工业发酵时能够得到产量很高的2’-岩藻糖基乳糖，具有很好的工业化生产前景。
本发明还提供一种培养体系，其包含本发明所述的培养基和本发明所述的重组大肠杆菌。
在本发明的一些实施方案中，所述培养体系中所述重组大肠杆菌来源于单菌落或菌液。
当所述重组大肠杆菌来源于菌液时，所述菌液体积占培养基体积的0.1％至10％(v/v)。例如可以为1％、2％、3％、5％、8％、9％或10％。本发明提供一种上述重组大肠杆菌的培养方法，其通过如本发明所述的培养基对重组大肠杆菌进行培养。
在本发明的具体实施方案中，所述培养方法为获得种子液的方法，其中所述培养基作为种子培养基使用。
在本发明的一些实施方案中，该方法包括如下步骤：
(1-1)将重组大肠杆菌接入种子培养基中，得到种子培养体系；
(1-2)对种子培养体系进行振荡培养，当种子培养体系的OD600达到0.6～2.5时终止培养，得到重组大肠杆菌的种子发酵液。
在本发明的一些实施方案中，重组大肠杆菌以菌液或单菌落的形式接入种子培养基中。若以菌液形式接入，则重组大肠杆菌的接种量为0.1％至10％(v/v)。在本申请一些实施例中，接种量可以为1％、2％、3％、5％、8％、9％或10％。
在本发明的一些实施方案中，振荡培养的温度为25～27℃。例如，可以为25℃、26℃或27℃。
在本发明的一些实施方案中，振荡培养的速度为180～240rpm。例如，可以为180rpm、200rpm、220rpm或240rpm。
在本发明的一些实施方案中，振荡培养的时间为6～10h。例如，可以为6h、7h、8h、9h或10h。
在本发明的一些实施方案中，当振荡培养后的菌液的OD600达到0.8～1.8时可以终止培养。例如，终止培养的OD可以为0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、1.8或2.0。
本发明的重组大肠杆菌的培养也可以由所述重组大肠杆菌存在于本发明所述的培养体系中，并对该培养体系进行发酵实现。
本发明还提供了一种种子发酵液，其通过如本发明所述的培养方法获得，或者通过对本发明所述的培养体系进行发酵获得。
本发明还提供了一种利用上述种子发酵液来发酵生产2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的方法。该方法包括如下步骤：
(2-1)在36～37℃的初始温度下，将重组大肠杆菌的种子发酵液按照1％～10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，得到初始发酵体系；
(2-2)当初始发酵体系的溶解氧升至50％以上时，采用补料培养基对发酵体系进行补料，并控制补料后的发酵体系的溶解氧水平在30±3％的范围内以及其pH值为7.1～7.2；
(2-3)待补料后的发酵体系的OD600升至18～22时，将发酵温度降至25～27℃并维持该发酵温度，加入终浓度为5～30g/L的乳糖，发酵结束后得到含有2’-岩藻糖基乳糖的发酵液。
其中，在步骤(2-1)中，通过通气和/或搅拌使初始发酵体系的溶解氧在30±3％。本申请中的溶解氧含量用空气饱和度百分数(％)来表示。
在步骤(2-1)中，发酵培养基包括：18～20g/L甘油、12～15g/L蛋白胨、8～10g/L酵母提取物、12～15g/LNaCl；发酵培养基的pH值为7.1～7.2。例如，发酵培养基包括：20g/L甘油、15g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、15g/L NaCl；优选地，所述发酵培养基还包括镁盐。
在本发明的一些实施方案中，所述镁盐为硫酸镁，所述镁盐的含量为0.1～1g/L，例如0.24g/L。
在步骤(2-2)中，补料培养基包括：500～600g/L甘油、20～30g/L蛋白胨、10～20g/L酵母提取物、15～20g/L NaCl。
在步骤(2-2)中，补料培养基的补料速度为5～5.5mL/L/h。例如，补料速度可以为5、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5mL/L/h。
在步骤(2-3)中，在发酵的过程中，每隔2～4小时对乳糖进行补料，以将乳糖的终浓度调回5～30g/L并控制pH值为7.1～7.2。
在步骤(2-3)中，乳糖的终浓度指的是这些物质刚加入时的初始浓度，并非发酵过程中的浓度。因为随着发酵过程的进行，上述物质的实时浓度会有所变化。
在步骤(2-3)中，在补料后的发酵体系的OD600升至20时再降低发酵温度。降低发酵温度指的是将发酵时的温度从36～37℃的初始温度降低9～12℃，从而将补料后的发酵体系的温度维持在25～27℃。
在步骤(2-3)中，发酵时间可以为但不限于115～120h。
在发酵过程中需要多次取样以监控发酵的情况，在加上发酵过程中发酵液的蒸发。因此，补料后的发酵体系的总体积一般不会超过发酵罐的总体积(如5L)。那么在本申请的任何一次补料中，补料后的体积未超过发酵罐的总体积时，则无需释放其中的发酵液。如果补料后的体积超过发酵罐的总体积，则从发酵罐中释放出一部分发酵液。
在步骤(2-3)中，发酵结束后得到的发酵液中，2’-岩藻糖基乳糖的含量可以为110～115g/L。
在本发明的一些实施方案中，在100～118h的发酵时间里可以取得较优的发酵效果，例如105h、108h、110h、112h或115h。
本发明还提供一种如本发明所述的培养基或如本发明所述的培养体系在培养本发明所述的重组大肠杆菌中的应用，所述重组大肠杆菌如上述内容所述。
本发明还提供了如本发明所述的培养基、所述的培养体系或所述的种子发酵液在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
本发明还提供了一种上述培养基在产生本发明所述的重组大肠杆菌的种子液中的应用。
本发明还提供了一种上述培养基在供本发明所述的重组大肠杆菌以乳糖为底物发酵生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，对具体实施例的描述不应被视为对本发明的保护范围的限制。
实施例1 lacZ基因的功能失活
研究发现，2'-岩藻糖基乳糖的生物合成以乳糖为受体，以GDP-L-岩藻糖为糖基供体。本实施例使用大肠杆菌BL21(λDE3)作为出发菌株，构建了lacZ基因功能部分失活的大肠杆菌。该大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的表达量相对于野生型大肠杆菌而言有了大幅度降低，但是仍然具有3％至5％的β-半乳糖苷酶的表达量。
本实施例中，BL21(λDE3)菌株购自Novagen公司，货号69450-M。pCas9质粒、pTargetF市售可得。无缝克隆试剂盒ClonExpress IIOne Step Cloning Kit购买自诺唯赞。pET28a/pCDFduet-1质粒购买自Novagen公司。乳糖购自国药试剂。LB液体培养基含有终浓度为10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠(NaCl)。卡那霉素抗性LB平板是在LB液体培养基的成分的基础上添加终浓度为20g/L的琼脂、50μg/mL的卡那霉素而制成。卡那霉素和壮观霉素抗性LB平板是在LB液体培养基的成分的基础上添加终浓度为20g/L的琼脂、50μg/mL的卡那霉素、50μg/mL的壮观霉素而制成。本发明各个实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆·布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
本实施例利用《一种lacZ失活的基因工程菌及其在人乳寡糖生产中的应用》的专利申请所记载的技术得到lacZ基因部分失活的BL21(λDE3)宿主细胞(即初始底盘细胞)，记为BL21(λDE3)lacZ(ΔM15)。该专利申请的申请号为202111422436.6，申请日为2021年11月26日。该专利申请的全文以引用的方式并入本申请文件中。用于使lacZ基因部分失活的N20序列如表1所示。
表1 lacZ基因部分失活的N20序列
| 序列名称 | 具体序列 | SEQ ID NO: |
| ΔM15 N20序列 | cgtcgtgactgggaaaaccc | 1 |
实施例2底盘细胞和相关载体的构建
(1)底盘细胞的构建
在实施例1的初始底盘细胞的基础上，敲除wacJ和fucK-fucI基因。采用ΔwacJN20序列敲除wacJ基因，采用ΔfucK/IN20序列敲除fucK-fucI基因。敲除wcaJ和fucK/I的相关序列见下表2。实验方法和技术参考实施例1。最终制得底盘细胞BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ。
表2敲除wcaJ和fucK/I的相关序列
| 序列名称 | 具体序列 | SEQ ID NO: |
| ΔwacJ N20序列 | gtggtgttccagatgttggg | 2 |
| ΔfucK/I N20序列 | ttgagttggtgcgtttgttg | 3 |
在底盘BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ基础上对基因rcsA、pfkA、gmm、nudK、LacY、araA与rhaA进行删除、替换或过表达，对将L-岩藻糖转变为墨角藻糖的araA与rhaA两个基因进行删除；对GDP-甘露糖降解相关的rcsA、gmm、nudK三个基因进行删除；对果糖-6-磷酸降解相关的基因pfkA进行删除或置换；对乳糖透性酶LacY过表达，对转录调控因子rcsA基因过表达。根据基因登陆号，查找基因序列，设计sgRNA(N20序列)，基因操作过程中所使用的sgRNA序列(N20序列)以及相关基因的登录号见表3，本轮实验共得到27种底盘细胞，底盘细胞详细信息见表4。
表3相关基因登录号以及N20序列
表4底盘细胞基因型信息
其中，pfkA：：rcsA表示采用rcsA替换掉pfkA基因，pfkA：：lacY表示采用pfkA替换掉lacY基因。△表示基因敲除或删除。
(2)重组质粒的构建
pBCGW重组质粒构建：将编码从头合成GDP-岩藻糖必需的四个酶的基因以NcoI和HindIII作为酶切位点插入到载体pCDFduet-1进行表达，四个酶分别为磷酸甘露糖变位酶(manB，GenBank CAQ32460.1)，甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(mannose-1-phosphateguanosyltransferase，manC，GenBankCAQ32461.1)，GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd，GenBankCAQ32465.2)，GDP-L-岩藻糖合酶(wcaG，GenBankCAQ32464.1)。以BL21(DE3)基因组为模板，利用引物对F1-for与F2-rev扩增出gmd与wcaG基因，为片段1，引物对F3-for与F4-rev扩增出manB与manC基因，为片段2；以pCDFduet-1质粒为模板，利用引物对F2-for与F3-rev扩增出片段3，F4-for与F1-rev引物对扩增出片段4。使用无缝克隆试剂盒，连接片段1、片段2、片段3、片段4，得到重组质粒pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC，简写为pBCGW。
fucT重组质粒构建：全合成NCBI上公开的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因fucT序列(GenBankRTL12957.1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)合成，所用酶切位点为Nde I、Hind III，克隆至pET28a载体，所得重组质粒命名为pET28a-fucT。简写为pfucT。
pET28a-fucT-LacY重组质粒构建：以BL21(DE3)基因组为模板，利用引物对F5-for与F6-rev扩增出LacY基因，为片段1；以上述pET28a-fucT为模板，利用引物对F6-for与F5-rev扩增出片段2，使用无缝克隆试剂盒连接片段1与片段2，得到重组质粒pET28a-fucT-LacY，简写为pfucT-LacY。上述各个片段、引物对的序列如表5所示。
表5引物序列
表6中的底盘细胞含有从头合成GDP-岩藻糖的各种酶。详述如下：若以葡萄糖为碳源，则葡萄糖在进入底盘细胞后会生成葡萄糖-6-磷酸，随后生成果糖-6磷酸。若以甘油为碳源，则甘油在进入底盘细胞后会生成甘油-3-磷酸，随后也转变为果糖-6-磷酸。果糖-6-磷酸在甘露糖6-磷酸异构酶(manA)作用下生成甘露糖-6-磷酸，甘露糖-6-磷酸在磷酸甘露糖变位酶(manB)作用下生成甘露糖-1-磷酸，甘露糖-1-磷酸在甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(manC)作用下生成GDP-甘露糖，GDP-甘露糖在GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)作用下生成GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖，GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖在GDP-L-岩藻糖合酶(wcaG)作用下生成GDP-L-岩藻糖。GDP-L-岩藻糖随后与乳糖反应产生2’-岩藻糖基乳糖。
实施例3重组大肠杆菌的构建及其菌液的生产
将实施例2中所构建的重组质粒pBCGW与pET28a-fucT共转至实施例2中得到的底盘22/23/24/25/26/27；将实施例2中所构建的重组质粒pBCGW与pfucT-LacY共转至实施例2中得到的底盘0/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/16/17/18/19/20/21以及对照底盘，涂布卡那霉素与壮观霉素双抗平板，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种50μg/mL卡那霉素与100μg/mL壮观霉素的LB基础培养基。在上述的培养过程结束后，从双抗平板上挑取单菌落，于甘油管中冻存。将单菌落接种于或者甘油管中的菌液以1％(v/v)的接种量接种于LB基础培养基中进行复苏，于37℃、220rpm的条件下培养8h得到用于接入摇瓶培养的菌液。
实施例4不同重组的大肠杆菌摇瓶发酵
LB基础培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠(NaCl)。
100mL发酵培养基：20g/L甘油、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl。
将实施例3所得的用于接入摇瓶培养的菌液按1％(v/v)的接种量接入到250mL三角瓶中(含有100mL LB基础培养基)。将该三角瓶于37℃、220rpm的条件下培养8h，得到能用于发酵的种子液。
为了检测该种子液的发酵效果，对该种子液进行摇瓶发酵实验，具体包括：将该种子液按1％接种量接种至100mL发酵培养基中，25℃、220r/min培养至瓶内菌液OD600＝0.8时，添加10g/L的乳糖，继续发酵37h，然后取样检测。取样的方法包括：将发酵液沸水浴20min，于12000rpm离心5min，弃去沉淀，取上清液稀释十倍，过滤后作为进样，并进行高效液相色谱分析。高效液相色谱分析的参数为：2’-FL的检测采用装备有视差检测器的高效液相色谱仪，使用的色谱柱型号为Sepax HP-Amide 250*4.6nm，5μm。柱温使用35℃。流动相：乙腈：水＝68：32。流速为1.4mL/min。浓度为1mg/mL。进样量为10μL。检测发酵液中的2-FL含量，结果如表6所示。
表6摇瓶发酵结果
由结果可知序号8、9、10、11、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27的发酵结果较好，可进行进一步的种子培养基条件的实验。以8号BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA：：rcsA△araA△rhaA△nudK为例做进一步的实验。
实施例5碳源对发酵结果的影响实验
本实施例涉及甘油(作为碳源)对发酵结果的影响。
实施例5-0：将实施例3所得的序号为8的用于接入摇瓶培养的菌液按1％(v/v)的接种量接入到250mL三角瓶中(含有100mL LB基础培养基，不添加葡萄糖和甘油)。将该三角瓶于37℃、220rpm的条件下培养8h，得到能用于发酵的种子液。
为了检测该种子液的发酵效果，对该种子液进行摇瓶发酵实验，具体包括：将该种子液按1％接种量接种至100mL发酵培养基中，25℃、220r/min培养至瓶内菌液OD600＝0.8时，添加10g/L的乳糖，继续发酵37h，然后取样检测。取样的方法包括：将发酵液沸水浴20min，于12000rpm离心5min，弃去沉淀，取上清液稀释十倍，过滤后作为进样，并进行高效液相色谱分析。高效液相色谱分析的参数为：2’-FL的检测采用装备有视差检测器的高效液相色谱仪，使用的色谱柱型号为Sepax HP-Amide 250*4.6nm，5μm。柱温使用35℃。流动相：乙腈：水＝68：32。流速为1.4mL/min。浓度为1mg/mL。进样量为10μL。
实施例5-1、5-2、5-3：与实施例5-0相比，不同的是：三个250mL三角瓶中还分别含有终浓度为1g/L、5g/L、10g/L的甘油。
实施例5-4：与实施例5-0相比，不同的是：250mL三角瓶中还含有终浓度为5g/L的葡萄糖。
经检测可知，实施例5-0(不添加额外碳源)的2’-FL的浓度为5.35g/L，实施例5-4(葡萄糖作为碳源)的2’-FL的浓度为6.43g/L，实施例5-1的2’-FL的浓度为4.86g/L，实施例5-2的2’-FL的浓度为7.29g/L，实施例5-3的2’-FL的浓度为7.25g/L。
由此可知，本发明实施例3所构建得到的重组大肠杆菌(携带共表达质粒pBCGW+pfucT-LacY的BL21(λDE3)lacZ(△M15)△fucK-fucI△wacJ pfkA::rcsA△araA△rhaA△nudK菌株)更容易利用甘油作为其碳源。另外，当培养基中甘油浓度为5g/L时，2’-FL的产量最高，说明此时菌株生长状况和代谢条件良好，能够产生更高产量的产物。另外，甘油也可以作为旁路代谢途径的抑制剂，起到分解代谢物阻遏作用，从而使该重组大肠杆菌能够充分利用乳糖合成2’-FL，从而提高底物的利用效率。
实施例6磷源对发酵结果的影响实验
本实施例涉及磷源对发酵结果的影响。
实施例6-1(不额外添加KH2PO4和K2HPO4)：将实施例3所得的序号为8的用于接入摇瓶培养的菌液按1％(v/v)的接种量接入到250mL三角瓶中(含有100mL LB种子培养基，并含有终浓度为5g/L的甘油)。将该三角瓶于37℃、220rpm的条件下培养8h，得到能用于发酵的种子液。为了检测该种子液的发酵效果，对该种子液进行摇瓶发酵实验，具体包括：将该种子液按1％接种量接种至100mL发酵培养基中，于25℃、220r/min培养至瓶内菌液OD600＝0.8时，添加终浓度为10g/L的乳糖，继续发酵37h，然后取样检测。
实施例6-2：与实施例6-1相比，不同的是：250mL三角瓶中还含有终浓度为2.31g/LKH2PO4、终浓度为16.43g/L K2HPO4。由此，三角瓶内的pH值为6.5。
经检测可知，实施例6-1的2’-FL的产量为7.30g/L，实施例6-2的2’-FL的产量为7.57g/L。相比于实施例6-1(未添加KH2PO4和K2HPO4)的发酵结果相比，实施例6-2的2’-FL的产量提高了3.7％。
实施例7天冬氨酸对发酵结果的影响实验
本实施例涉及天冬氨酸对发酵结果的影响。
实施例7-1(不额外添加天冬氨酸)：将实施例3所得序号为8的用于接入摇瓶培养的菌液按1％(v/v)的接种量接入到250mL三角瓶中(含有100mL LB种子培养基，并含有终浓度为5g/L的甘油，同时添加终浓度为2.31g/L KH2PO4、终浓度为16.43g/LK2HPO4)。将该三角瓶于37℃、220rpm的条件下培养8h，得到能用于发酵的种子液。为了检测该种子液的发酵效果，对该种子液进行摇瓶发酵实验，具体包括：将该种子液按1％接种量(v/v)接种至100mL发酵培养基中，于25℃、220r/min培养至瓶内菌液OD600＝0.8时，添加终浓度为10g/L的乳糖，继续发酵37h，然后取样检测。
实施例7-2、7-3、7-4：与实施例7-1相比，不同的是：三个250mL三角瓶中还分别含有终浓度为10mg/L、50mg/L、100mg/L的天冬氨酸。
经检测可知，实施例7-1的2’-FL的产量为7.58g/L，实施例7-2的2’-FL的产量为7.4，实施例7-3的2’-FL的产量为7.87g/L，实施例7-4的2’-FL的产量为6.99g/L。由此可知，当天冬氨酸的含量过低(10mg/L)或者过高(100mg/L)时，2’-FL的产量比不添加天冬氨酸反而有了下降，说明当添加了合适浓度的天冬氨酸(50mg/L)时，2’-FL的产量比不添加天冬氨酸(0mg/L)、添加少量的天冬氨酸(10mg/L)、添加过量的天冬氨酸(100mg/L)时有了大幅度的提高。添加终浓度50mg/L的天冬氨酸的2’-FL产量比不添加天冬氨酸的2’-FL产量提高了5.39％。
实施例8维生素B2(VB2)对发酵结果的影响实验
本实施例涉及维生素B2(VB2)对发酵结果的影响。
实施例8-1(不额外添加VB2)：将实施例3所得序号为8的用于接入摇瓶培养的菌液按1％(v/v)的接种量分别接入到250mL三角瓶中(含有100mL LB种子培养基，并含有终浓度为5g/L的甘油，同时添加终浓度为2.31g/L KH2PO4、终浓度为16.43g/LK2HPO4、终浓度为50mg/L的天冬氨酸)。将该三角瓶于37℃、220rpm的条件下培养8h，得到用于发酵的种子液。为了检测该种子液的发酵效果，对该种子液进行摇瓶发酵实验，具体包括：将该种子液按1％接种量接种至100mL发酵培养基中，于25℃、220r/min培养至瓶内菌液OD600＝0.8时，添加终浓度为10g/L的乳糖，继续发酵37h，然后取样检测。
实施例8-2、8-3、8-4：与实施例7-1相比，不同的是：三个250mL三角瓶中还分别含有终浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L VB2。
经检测可知，实施例7-1的2’-FL的产量为7.85g/L，实施例7-2的2’-FL的产量为8.81g/L，实施例7-3的2’-FL的产量为8.74g/L，实施例7-4的2’-FL的产量为8.15g/L。
根据上述结果可知，在添加了VB2之后，2’-FL的产量比不添加VB2有了大幅度的提高。但是如果VB2的添加量过高，则反而会起到抑制作用，因此，VB2的添加终浓度为0.1mg/L为宜。
实施例9酵母提取物的用量对发酵结果的影响实验
本实施例涉及酵母提取物的使用量对发酵结果的影响。
实施例9-1(除基础培养基中的酵母提取物外，不再额外添加酵母提取物)：将实施例3所得序号为8的用于接入摇瓶培养的菌液按1％(v/v)的接种量分别接入到250mL三角瓶中(含有100mL LB种子培养基，并含有终浓度为5g/L的甘油，同时添加终浓度为2.31g/LKH2PO4、终浓度为16.43g/L K2HPO4、终浓度为50mg/L的天冬氨酸、终浓度为0.1mg/L VB2)。将该三角瓶于37℃、220rpm的条件下培养8h，得到用于发酵的种子液。为了检测该种子液的发酵效果，对该种子液进行摇瓶发酵实验，具体包括：将该种子液按1％接种量接种至100mL发酵培养基中，于25℃、220r/min培养至瓶内菌液OD600＝0.8时，添加终浓度为10g/L的乳糖，继续发酵37h，然后取样检测。
实施例9-2、9-3、9-4：与实施例9-1相比，不同的是：三个250mL三角瓶中分别含有终浓度为6g/L、10g/L、15g/L的酵母提取物。
经检测可知，实施例9-1的2’-FL的产量为8.80g/L，实施例9-2的2’-FL的产量为10.15g/L，实施例9-3的2’-FL的产量为10.50g/L，实施例8-4的2’-FL的产量为9.18g/L。
根据上述结果可知，适量的酵母提取物能够提高实施例的菌种的2’-FL的产量，但是如果酵母提取物在种子培养基中的含量过高，2’-FL的产量反而会下降。因此，酵母提取物在种子培养基中的终浓度在6g/L至10g/L的范围内为宜。
实施例10
实施例10-1：将实施例3所得的序号为24的用于接入摇瓶培养的菌液按1％(v/v)的接种量分别接入到250mL三角瓶中(含有100mL LB种子培养基，并含有终浓度为5g/L的甘油，同时添加终浓度为2.31g/L KH2PO4、终浓度为16.43g/L K2HPO4、终浓度为50mg/L的天冬氨酸、终浓度为0.1mg/L VB2。额外添加酵母提取物至终浓度为10g/L)。将该三角瓶于37℃、220rpm的条件下培养8h，得到用于发酵的种子液。为了检测该种子液的发酵效果，对该种子液进行摇瓶发酵实验，具体包括：将该种子液按1％接种量接种至100mL发酵培养基中，于25℃、220r/min培养至瓶内菌液OD600＝0.8时，添加终浓度为10g/L的乳糖，继续发酵37h，然后取样检测。
实施例10-2：与实施例10-1相比，不同的是：250mL三角瓶中含有100mL LB种子培养基。
经检测可知，实施例10-1中2’-FL的产量为10.47g/L。实施例10-2中2’-FL的产量为5.34g/L。
实施例11 5L发酵罐生产2’-岩藻糖基乳糖
本实施例涉及对发酵用的种子液的发酵罐验证实验。本实施例所用的试剂如下：
5L罐发酵培养基(3L)：甘油20g/L、蛋白胨15g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 15g/L、消泡剂0.5g/L、硫酸镁0.24g/L。5L罐发酵培养基的配制方法如下：称取甘油、硫酸镁装入250mL锥形瓶，定容至100mL，单独灭菌。然后称取其余的物料，用水溶解并定容至消泡剂加入前体积2.6L，加入消泡剂(二甲基硅油和SiO2)并搅匀后用氢氧化钠(30％)调节pH至7.2左右，并定容至3L。
补料培养基：600g/L甘油，蛋白胨30g/L，酵母提取物20g/L，NaCl 20g/L。
实施例11-1：当实施例5-0得到的能用于发酵的种子液的OD600值至2.0时，按照1％(v/v)的接种量(30mL种子液)接入到5L发酵罐中(含有3L发酵培养基)。接种完毕后调节起始温度为37℃、通气量为2L/min、搅拌转速为200rpm，并检测5L发酵罐中溶解氧的值。逐步提升转速并调节通气量使溶解氧维持在30±3％。待溶解氧无法维持在30±3％而大幅度回升至50％以上时表明甘油耗尽。采用补料培养基按照5mL/L/h的速度进行补料，并继续搅拌以控制溶解氧水平恒定，同时控制pH值在7.2。待发酵液的OD600升至20后，先降温至25℃，后加入终浓度为10g/L的乳糖。之后每隔2h监测发酵液中乳糖的终浓度，在发酵液中补加300g/L的乳糖，以便将发酵液中乳糖的终浓度调回10g/L，并维持发酵温度为25℃。发酵118h后，取发酵液10mL沸水浴20min，于12000rpm离心5min，弃去沉淀，取上清液，稀释十倍后过滤，取稀释后的上清液10μL作为进样，采用高效液相色谱分析检测2’-FL含量。
实施例11-2：与实施例11-1不同的是，实施例11-2将实施例9-3得到的能用于发酵的种子液接入到5L发酵罐中。
实施例11-3：与实施例11-1不同的是，实施例11-3将实施例10-1得到的能用于发酵的种子液接入到5L发酵罐中。
实施例11-4：与实施例11-1不同的是，实施例11-4将实施例10-2得到的能用于发酵的种子液接入到5L发酵罐中。
经检测结果可知，实施例11-1的2’-岩藻糖基乳糖含量为64.4g/L，实施例11-2的2’-岩藻糖基乳糖含量为94.4g/L。实施例11-3的2’-岩藻糖基乳糖含量为91.4g/L，实施例11-4的2’-岩藻糖基乳糖含量为62.5g/L。由此可知，仅使用LB种子培养基培养实施例3所得的重组大肠杆菌，则该重组大肠杆菌种子的生长状态不佳，导致该种子在转入发酵罐后的发酵效果不好，最终发酵所得的2’-岩藻糖基乳糖含量较低。而使用优化后的种子培养基对实施例3所得的重组大肠杆菌进行种子培养，所得的重组大肠杆菌种子的质量很高，在转入发酵罐后2’-岩藻糖基乳糖含量提高了46.5％和46.2％。说明当种子培养基中含有终浓度为5g/L甘油、2.31g/L KH2PO4、16.43g/L K2HPO4、50mg/L天冬氨酸、0.1mg/L VB2、10g/L酵母提取物时，能够较大幅度地提升实施例3所得的重组大肠杆菌的种子液的质量，并且提高其在发酵罐中发酵时产2’-岩藻糖基乳糖的能力。
Claims (14)
1.一种培养基，其特征在于，所述培养基包含：10～12g/L蛋白胨、5～16g/L酵母提取物、10～12g/L氯化钠，还包含选自以下物质中的一个或多个的组分：1～20g/L甘油或1～10g/L的葡萄糖、0.01～0.15mol/L磷酸盐缓冲液、10～100mg/L酸性氨基酸和0.1～1.0mg/L维生素。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括10～12g/L蛋白胨、5～10g/L酵母提取物、10～12g/L氯化钠、1～20g/L甘油、2～3g/L KH2PO4或1.76～2.64g/LNaH2PO4、12～20g/L K2HPO4或9.78～16.3g/L Na2HPO4、30～80mg/L酸性氨基酸和0.1～0.5mg/L维生素；
较佳地，所述培养基包括10g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、5g/L甘油、2.31g/L的KH2PO4或2.04g/L的NaH2PO4、16.43g/L的K2HPO4或13.39g/L的Na2HPO4、50mg/L的酸性氨基酸和0.1mg/L的维生素；
更佳地：
所述酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸中的一种或两种；和/或，
所述维生素选自VB1、VB2或VB12中的一种或多种；和/或，
所述培养基的pH值为6.0～7.0。
3.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为lacZ基因部分失活，wacJ基因和pfkA基因缺失，lacY基因和fucT基因过表达的大肠杆菌BL21(λDE3)；
进一步，所述重组大肠杆菌过表达manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因，和/或，所述重组大肠杆菌的fucK-fucI基因、araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因中的两种、三种、四种或五种缺失；
优选地，所述fucT基因的登录号为RTL12957.1。
4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述lacY基因的过表达是通过整合所述lacY基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
araA基因和nudK基因缺失；
rhaA基因和gmm基因缺失；
araA基因和rhaA基因缺失；
araA基因和gmm基因缺失；
rhaA基因和nudK基因缺失；
nudK基因和gmm基因缺失；
优选地，所述fucT基因构建于pET28a质粒上；和/或，
所述lacY基因整合入大肠杆菌基因组的pfkA基因处；和/或，
所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC共表达质粒上。
5.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述lacY基因的过表达是将所述lacY基因构建于质粒载体，增加基因拷贝数的方式实现，所述fucK-fucI基因缺失，并且所述重组大肠杆菌的基因组满足以下任意一种条件：
araA基因和gmm基因缺失；
rhaA基因和nudK基因缺失；
nudK基因和gmm基因缺失；
araA基因和nudK基因缺失；
rhaA基因和gmm基因缺失；
araA基因和rhaA基因缺失；
araA基因、rhaA基因和nudK基因缺失；
araA基因、nudK基因和gmm基因缺失；
araA基因、rhaA基因和gmm基因缺失；
araA基因、rhaA基因、gmm基因和nudK基因缺失；
优选地，LacY基因、fucT基因分别构建于pET28a质粒载体上；和/或，
LacY基因、fucT基因共同构建于pET28a质粒载体上；和/或，
所述manB基因、manC基因、gmd基因和wcaG基因位于pCDFduet-gmd-wcaG-manB-manC共表达质粒上。
6.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌进一步过表达rcsA基因，所述过表达rcsA基因是通过整合所述rcsA基因到大肠杆菌基因组，增加基因拷贝数的方式实现；优选地，所述rcsA基因整合入大肠杆菌基因组的pfkA基因处。
7.一种培养体系，其特征在于，所述培养体系包括如权利要求1或2所述的培养基以及权利要求3～6任一项所述的重组大肠杆菌。
8.如权利要求3～6任一项所述的重组大肠杆菌的培养方法，其通过如权利要求1或2所述的培养基对重组大肠杆菌进行培养。
9.如权利要求8所述的培养方法，其特征在于，其包括：
所述培养方法在摇瓶或发酵罐中进行；和/或，
将所述重组大肠杆菌以单菌落接种入所述培养基中或以0.1％至10％(v/v)的菌液接种入所述培养基中，然后进行振荡培养；
较佳地，当振荡培养后的菌液的OD600达到0.6～2.5时终止培养；
更佳地，所述振荡培养的温度为35～38℃；和/或，所述振荡培养的速度为180～300rpm；和/或，所述振荡培养的时间为6～10h。
10.一种种子发酵液，其特征在于，所述种子发酵液通过如权利要求8或9所述的培养方法获得。
11.一种发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，通过如权利要求10所述的种子发酵液与乳糖共同发酵生产2’-岩藻糖基乳糖；
较佳地，
在36～37℃的初始温度下，将所述种子发酵液按照1％～10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，得到初始发酵体系；
当所述初始发酵体系的溶解氧升至50％以上时，采用补料培养基对所述初始发酵体系进行补料，并控制补料后的发酵体系的溶解氧水平在30±3％的范围内以及其pH值为7.1～7.2；
待补料后的发酵体系的OD600升至18～22时，将发酵温度降至25～27℃并维持该发酵温度，加入终浓度为5～30g/L的乳糖，发酵结束后得到含有2’-岩藻糖基乳糖的发酵液；
更佳地，在发酵的过程中，每隔2～4h对乳糖进行补料，以将乳糖的终浓度调回5～30g/L，并控制pH值为7.0～7.2。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在进行所述接种后，通过通气和/或搅拌使所述初始发酵体系的溶解氧在30±3％；和/或，
所述发酵培养基包括：18～20g/L甘油、12～15g/L蛋白胨、8～10g/L酵母提取物以及12～15g/L NaCl；所述发酵培养基的pH值为7.1～7.2；和/或，
所述补料培养基包括：500～600g/L甘油、20～30g/L蛋白胨、10～20g/L酵母提取物以及15～20g/L NaCl；和/或，
所述补料培养基的补料速度为5～5.5mL/L/h；和/或，
在补料后的发酵体系的OD600升至20时降低所述发酵温度；
优选地，所述发酵培养基还包括镁盐。
13.一种如权利要求1或2所述的培养基或如权利要求7所述的培养体系在培养如权利要求3～6任一项所述的重组大肠杆菌中的应用。
14.一种如权利要求1或2所述的培养基、如权利要求3～6任一项所述的重组大肠杆菌、如权利要求7所述的培养体系或如权利要求10所述的种子发酵液在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
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