CN117004625A - 一种氧调控基因及其过表达突变株和用于维生素b12工业生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氧调控基因及其过表达突变株和用于维生素B₁₂工业生产中的应用，所述氧调控基因为黏着剑菌b12fla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过同源重组单交换的方法将在维生素B₁₂工业生产菌株黏着剑菌中发现的氧调控基因b12fla基因进行过表达，构建b12fla基因过表达突变株，达到对氧代谢进行扰动实现氧调控的目的。并通过摇瓶发酵实验证明了b12fla基因的过表达能够促进菌体的生长且对维生素B₁₂的合成有一定的正向作用。

Description

一种氧调控基因及其过表达突变株和用于维生素B12工业生产 中的应用

技术领域

本发明具体涉及一种氧调控基因及其过表达突变株和用于维生素B₁₂工业生产中的应用。

背景技术

维生素B₁₂是人类和动物的一种重要营养物质，在造血和维持神经系统健康方面发挥着关键作用。由于维生素B₁₂的分子结构极其复杂，其全化学合成路线涉及70多个反应步骤，并且成本昂贵，所以目前主要以微生物发酵的方式来生产维生素B₁₂。黏着剑菌(曾命名为脱氮假单胞菌)是维生素B₁₂好氧生物合成途径的典型菌株，由于其简单的发酵过程和相对简便的培养条件而被应用于工业生产。

氧限制是黏着剑菌发酵生产维生素B₁₂过程中过程控制的一个特征指标。黏着剑菌合成维生素B₁₂的过程中存在着强烈的氧调控机制，在发酵过程中，无论通过增加通气量或是提高搅拌桨转速，发酵罐中的溶解氧从发酵中期开始一直维持在零，菌体生长处于氧限制状态时，菌体开始启动维生素B₁₂的快速合成与积累。研究结果证实黏着剑菌对氧有极高的亲和力，其呼吸代谢随着供氧水平的变化出现快速的应激响应。这种氧调控现象与呼吸相关的酶量的增加或相关组成型酶对氧亲和力的改变有关。氧限制条件下维生素B₁₂的合成与积累机制的阐明以及相应的代谢调控一直是制约维生素B₁₂发酵生产效率提升的关键瓶颈。

几十年来，人们一直在努力改进维生素B₁₂生产菌株的生产性能。一些研究者尝试通过随机诱变和基因工程的手段来提高维生素B₁₂产量，另一些研究者试图研究培养基优化对维生素B₁₂生物合成的影响。然而，目前的工业发酵仍存在产量和葡萄糖消耗波动较大的问题，大量的工业生产数据证明了微生物的摄氧率(受供氧水平的影响)对维生素B₁₂的生产产生了重要影响。到目前为止，关于控制供氧条件以形成更具有成本效益和更稳定的黏着剑菌大规模发酵生产维生素B₁₂的方法的研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氧调控基因及其过表达突变株和用于维生素B₁₂工业生产中的应用，所述氧调控基因是黏着剑菌b12fla基因，本发明首次发现了黏着剑菌中的b12fla基因，提供了一种通过基因工程手段进行氧调控策略的方法，研究发现在黏着剑菌中对b12fla基因进行过表达能够加快菌体的生长速率，提高菌体的生物量，并且对维生素B₁₂的合成具有促进作用。b12fla基因的敲除对黏着剑菌菌体生长、产物合成及糖转化率产生了不同程度的抑制。

本发明的第一个目的在于提供黏着剑菌中的b12fla基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因全长1284bp，编码蛋白有428个氨基酸序列。

本发明的第二个目的提供了一种黏着剑菌b12fla基因过表达突变株，是将黏着剑菌的b12fla基因过表达而获得，所述b12fla基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，将黏着剑菌的b12fla基因过表达的过程为：通过黏着剑菌转录组数据分析，选用ORF的启动子作为b12fla基因过表达的启动子，克隆得到该启动子片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；在黏着剑菌基因组中克隆得到b12fla基因片段；通过XbaⅠ和HindⅢ限制性内切酶将pOJ260质粒双酶切得到线性化载体pOJ260；通过重组反应将上述的启动子片段、b12fla基因片段及酶切后的线性化载体pOJ260进行重组，将重组产物转化至DH5α感受态中进行扩增培养后进行验证；将成功构建的重组质粒pOJ260-b12fla电转至E.coli S17-1感受态细胞中，与黏着剑菌工业菌进行接合转移，即得到黏着剑菌b12fla基因过表达突变株。

本发明的第三个目的在于提供所述黏着剑菌b12fla基因过表达突变株用于生产维生素B₁₂的应用。

本发明的有益效果是：

本发明构建b12fla基因过表达突变株，达到对氧代谢进行扰动实现氧调控的目的。提供了一种提高黏着剑菌在发酵过程中的生长速率并提高生物量的方法，通过基因工程手段改变菌株氧摄取程度提高维生素B₁₂产量。本发明通过摇瓶发酵实验证明了b12fla基因的过表达能够促进菌体的生长且对维生素B₁₂的合成有一定的正向作用。

附图说明

图1是b12fla基因敲除型质粒的验证结果；

图2是b12fla基因敲除突变株的验证结果；

图3是b12fla基因过表达型质粒的验证结果；

图4是b12fla基因过表达型突变株的验证结果；

图5是野生型菌株与b12fla基因敲除型突变株在不同供氧水平下OD₇₀₀对比结果；

图6是野生型菌株与b12fla基因敲除型突变株在不同供氧水平下维生素B₁₂产量对比结果；

图7是野生型菌株与b12fla基因敲除型突变株在不同供氧水平下比产率对比结果；

图8是野生型菌株与b12fla基因敲除型突变株在不同供氧水平下糖转化率对比结果；

图9是野生型菌株、b12fla基因敲除及过表达突变株在发酵过程中的OD₆₀₀对比结果；

图10是野生型菌株、b12fla基因敲除及过表达突变株维生素B₁₂产量对比结果；

图11是总糖测定标准曲线结果；

图12是维生素B₁₂含量测定标准曲线。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：b12fla基因的发现。

通过全基因组数据分析及氨基酸同源性分析，在黏着剑菌全基因组序列中发现了一段与氧调控相关的基因，并将其命名为b12fla基因。该基因全长1284bp，编码蛋白有428个氨基酸序列。

实施例2：黏着剑菌b12fla基因敲除突变株的构建

选择自杀型质粒pOJ260，其带有阿普拉霉素抗性。首先构建b12fla基因敲除型质粒pOJ260-△b12fla，用sfla-A/sfla-S这对引物克隆得到含有左右同源臂的片段，大小为749bp，即为中间缺失b12fla基因的DNA片段sfla。

通过XbaⅠ和HindⅢ限制性内切酶将pOJ260质粒双酶切得到线性化载体pOJ260。将得到的sfla片段和酶切后的质粒(即线性化载体pOJ260)进行胶回收，线性化载体pOJ260与sfla基因片段按摩尔比为1︰3的比例加入重组反应体系(使用SOSO重组试剂盒)中，50℃热激45min。将重组产物转化至DH5α感受态中进行扩增培养，从重组平板上挑取单克隆接种至LB液体培养基试管中培养用于后续验证，添加Apr抗性至终浓度为50μg/mL。

用引物F1-S/F1-A进行验证，图1为重组质粒的PCR验证核酸电泳结果，6号泳道为阴性对照，1、2、3、5号泳道为阳性克隆，条带大小与预期一致，进一步测序验证，得到目的质粒pOJ260-△b12fla。

然后将构建好的质粒pOJ260-△b12fla通过接合转移的方式整合到黏着剑菌染色体上，构建黏着剑菌b12fla基因敲除突变株，具体操作如下：

将重组质粒pOJ260-△b12fla电转至E.coli S17-1感受态细胞中，与黏着剑菌工业菌进行接合转移。将受体菌黏着剑菌工业菌挑取单菌落至TSB液体培养基的试管，30℃培养24h后，离心浓缩至2mL。同时挑取转入重组质粒的供体菌E.coli S17-1单菌落至LB液体试管培养过夜，离心倒掉上清液并用新鲜的LB液体培养基洗涤2次，再用1mL培养基悬浮。将上述的供体菌与受体菌按体积比1︰1的量充分混合，涂布在玉米浆复合型培养基平板上，30℃培养16h后覆盖抗生素(Apr抗性终浓度为100μg/mL，Kan抗性终浓度为50μg/mL)，培养4天左右平板上长出接合子，挑取单克隆到含Apr和Kan抗性的TSB液体试管培养基中培养。设计外围引物VP-S/VP-A验证接合子基因型，PCR验证核酸电泳结果如图2所示，1号泳道为黏着剑菌工业菌对照，2-5号泳道为阳性克隆，通过测序验证确实通过同源重组单交换成功地敲除了b12fla基因。

所述引物序列如下：

sfla-S：TAAAACGACGGCCAGTGCCACACCCGACAGCAATACGACA

sfla-A：CGCGCGCGGCCGCGGATCCTCGGAACGGAAATCACGAAGA

F1-S：AGATGCGTAAGGAGAAAATA

F1-A：GACCTACACCGAACTGAGAT

VP-S：GAAGAACTCGTAATGGACCCG

VP-A：AGGATTCCCGTTGAGCACC

实施例3：黏着剑菌b12fla基因过表达突变株的构建

首先构建b12fla基因过表达型质粒pOJ260-b12fla，通过黏着剑菌转录组数据分析，选用一段转录水平较高的ORF的启动子作为b12fla基因过表达的启动子，用pro-A/pro-S这对引物克隆得到含有左右同源臂的片段即启动子片段，大小为664bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。用fla-A/fla-S这对引物从黏着剑菌基因组中克隆得到大小为1284bp的b12fla基因片段。

通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pOJ260质粒得到线性化载体pOJ260，将得到的启动子片段、b12fla基因片段和酶切后的载体pOJ260进行胶回收，线性化载体pOJ260与回收后的启动子片段、b12fla基因片段按摩尔比为1︰3︰3的比例加入重组反应体系(使用SOSO重组试剂盒)中，50℃热激45min。将重组产物转化至DH5α感受态中进行扩增培养，从重组平板上挑取单克隆接种至含50μg/mLApr抗性的LB液体培养基试管内进行培养，用引物F2-S/F2-A进行验证，PCR验证的核酸电泳结果如图3所示，1、2号泳道为阳性克隆，3号泳道为阴性对照，进一步测序验证，证实得到目的质粒pOJ260-b12fla。

将重组质粒pOJ260-b12fla电转至E.coli S17-1感受态细胞中，与黏着剑菌工业菌进行接合转移，接合转移步骤与构建b12fla基因敲除型菌株一致。培养4天后长出接合子，挑取单克隆到含Apr和Kan抗性的TSB液体培养基内。设计外围引物VerP-S/VerP-A及Verfla-S/Verfla-A验证接合子基因型，验证同源重组单交换发生的位置是在启动子片段上还是b12fla基因片段上。PCR验证结果如图4所示，4号泳道为对照黏着剑菌工业菌，1-3号泳道为阳性克隆，通过测序验证表明确实通过同源重组单交换将b12fla基因进行过表达，并且单交换发生的位置位于b12fla基因片段上。

所述引物序列如下：

pro-S：CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTTGTCCCAAATAGCCCCATG；

pro-A：AAATGCAGCCGGCAATTCATTTCTGACCTCCAGTCAAAAG；

b12fla-S：ATGAATTGCCGGCTGCATTT；

b12fla-A：TATGACATGATTACGAATTCTCAGGCTGCAATGAGTTCGT；

F2-S：CGATGTAGGAGGGCGTGGAT；

F2-A：CTGGAAAGCGGGCAGTGAGC；

VerP-S：CACAGATGCGTAAGGAGAAA；

VerP-A：CATACCAAAACGAAAAAACC；

Verfla-S：CGTTCCTGCTTCAGACCGTC；

Verfla-A：GCTCACTCATTAGGCACCCC。

实施例4：不同供氧水平对b12fla基因敲除突变株发酵特性的影响

考察b12fla基因的敲除对黏着剑菌菌体生长及维生素B₁₂合成的影响，对野生型菌株及b12fla敲除型菌株进行摇瓶发酵实验并检测发酵过程中的参数。通过设置不同培养基装液量来模拟不同供氧条件考察野生型菌株及b12fla敲除型菌株在维生素B₁₂发酵过程中发酵生理学特性的差异，进一步确定b12fla基因编码蛋白FHP在不同供氧水平下对于黏着剑菌菌体生长和产物合成的影响。

其中黏着剑菌一级种子培养基为糖蜜57.14g，蔗糖12.86g，CoCl₂·6H₂O0.01429g，DMBI 0.00714g，MgSO₄·7H₂O 1.07g，ZnSO₄·7H₂O 0.01429g，MnSO₄·H₂O 0.14g，(NH₄)₂SO₄0.5 g，(NH₃)₂HPO₄1.64 g，加自来水溶解，调pH 7.2-7.4，再用自来水定容至1L。黏着剑菌二级种子培养基：糖蜜83.0g，蔗糖20.8g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，MnSO₄·H₂O 0.156g，ZnSO₄·7H₂O 0.02g，(NH₄)₂SO₄ 2.3g，(NH₄)₂HPO₄0.7 g，CaCO₃2.95 g，甜菜碱4.2g，DMBI0.004g，CoCl₂·6H₂O 0.02g，加自来水溶解，调pH 7.2-7.4，再用自来水定容至1L。黏着剑菌发酵培养基：玉米浆55.0g，蔗糖80.0g，(NH₄)₂SO₄2.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.16g，MgO 0.58g，ZnSO₄·7H₂O 0.09g，尿素1.0g(灭菌后再加)，(NH₃)₂HPO₄0.58 g，甘油磷酸2.64g，K₂HPO₄0.88 g，FeCl₃0.7 g，甜菜碱20.9g，DMBI 0.058g，CoCl₂·6H₂O 0.088g，CaCO₃1.16 g，加自来水溶解，调pH 7.2-7.4，再用自来水定容至1L。

操作过程为在斜面培养基划线培养4-5天，刮取斜面上约1/3的菌体接种于一级种子培养基中，30℃，260rpm培养24h左右，再按1.5％的接种量接种于二级种子培养基中，30℃，260rpm培养20h左右，再按10％的接种量接种于发酵培养基中，32℃，260rpm培养168h。从48h开始，每隔24h，取样并用DNS显色法测残糖含量，补加葡萄糖和甜菜碱，使残糖控制在40g/L-50g/L。

本实验选用500mL锥形瓶，发酵培养基装液量分别设置为25mL、50mL、100mL和200mL，摇床转速设置为260rpm，温度设置为32℃。

b12fla敲除型菌株及野生型菌株在发酵终点(发酵144h)时的OD₇₀₀对比如图5所示。从图5可以看出，在25mL、50mL和100mL装液量条件下，b12fla敲除型菌株的生物量明显低于野生型菌株的生物量，相较于野生型菌株的实验效果，b12fla敲除型菌株的生物量分别降低了8.56％、7.90％和15.86％，推测b12fla基因编码蛋白的作用是结合氧，能加快氧在宿主中的传递速率及通量。

b12fla敲除型菌株及野生型菌株在发酵终点(发酵144h)时的维生素B₁₂产量对比如图6所示。对于产物合成来说，无论在何种供氧条件下，b12fla敲除型菌株维生素B₁₂的产量都要低于野生型菌株。在25mL、50mL、100mL及200mL装液量条件下，b12fla敲除型菌株维生素B₁₂的产量相较于野生型菌株分别降低了10.67％、17.57％、26.94％和21.70％。黏着剑菌生产维生素B₁₂属于高耗氧过程，发酵合成阶段形成卟啉环、合成低位配基并进行甲基化、氨基化以及钴离子螯合过程都需要大量NADPH和ATP参与。b12fla基因的敲除对需要大量氧气参与的关键步骤造成了一定的限制影响从而抑制了维生素B₁₂的合成。

b12fla敲除型菌株及野生型菌株在发酵终点(发酵144h)时的比产率对比如图7所示(比产率为单位菌体的产量，计算为维生素B₁₂的产量与OD₇₀₀的比值)。从图7可以发现，在25mL、50mL、100mL及200mL装液量条件下，b12fla敲除型菌株的比产率相比于野生型菌株分别降低了14.81％、12.44％、7.95％和15％。

b12fla敲除型菌株及野生型菌株在发酵终点时的糖转化率对比如图8所示。从糖转化率对比结果可以看出，在高供氧条件下，即装液量为25mL时，糖转化率是最低的，b12fla敲除型菌株的糖转化率都要低于野生型菌株，b12fla基因的敲除明显降低了细胞对底物的得率，对整个发酵过程产生不利的影响。在25mL、50mL、100mL和200mL的装液量条件下，b12fla敲除型菌株的糖转化率与野生型菌株相比，分别降低了15.31％、16.44％、24.26％和43.10％。总之，b12fla基因的敲除对菌体生长、产物合成及糖转化率都产生不同程度的抑制。

图6-图8中，WT表示野生型菌株，△b12fla表示b12fla敲除型菌株。

其中OD₇₀₀的测定：使用比浊法测定。取1mL发酵液，用去离子水稀释至合适倍数，震荡均匀后使用紫外可见分光光度计在相应波长处测吸光度，用吸光度值乘以稀释倍数。

总糖测定：取发酵液离心，稀释上清液至适当浓度，吸取1mL稀释后的发酵上清液至试管中，向试管加入6M HCl 0.75mL，置沸水浴中加热水解30min，待试管中的水解液冷却后，加入6M HCl 0.75mL，DNS试剂1.5mL，沸水浴5min，冷却后向试管中补加水至10mL，使用分光光度计测定在540nm处的吸光值，空白对照使用蒸馏水。根据标注曲线计算出总糖浓度。残糖标准曲线测定：将葡萄糖放置在80℃烘箱2-3h，得到无水葡萄糖。称取500mg无水葡萄糖于烧杯中，用去离子水溶解后，转移至1000mL容量瓶中定容，均匀混合配制成0.5g/L的葡萄糖标准溶液。分别吸取葡萄糖标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，补加去离子水至同等体积，按照残糖测定方法进行操作，用蒸馏水作为空白对照。标准曲线如图11所示。

维生素B₁₂液相检测方法：样品处理：取维生素B₁₂发酵液10mL，加入冰醋酸1mL，8％NaNO₂溶液1mL，加一滴消泡剂，水解30min。冷却至室温，加水稀释25mL，漏斗过滤，吸1.5mL滤液于液相小瓶中，用于样品检测。流动相配制：300mL甲醇+700mL水+2mL乙酸，以氨水调pH为7.0，真空抽滤，装入流动相瓶中，超声30min。色谱条件：色谱柱为Backman C18柱(5μm、4.6×250nm)；柱温为40℃；流速为1.0mL/min；检测波长为361nm；进样量为20μL。维生素B₁₂标准曲线测定：吸取1.2g/L的维生素B₁₂标品溶液1mL，补加去离子水分别稀释至维生素B₁₂含量分别为20mg/L、50mg/L、100mg/L、300mg/L、600mg/L，按照样品检测条件与方法测定标准曲线。标准曲线如图12所示。

实施例5：b12fla突变菌株发酵生理特性差异比较

通过摇瓶补料发酵，对b12fla基因敲除型、过表达型突变株及野生型菌株在条件一致的情况下进行培养，考察三种菌株在对维生素B₁₂的合成及发酵生理特性的差异。

其中黏着剑菌一级种子培养基为糖蜜57.14g，蔗糖12.86g，CoCl₂·6H₂O0.01429g，DMBI 0.00714g，MgSO₄·7H₂O 1.07g，ZnSO₄·7H₂O 0.01429g，MnSO₄·H₂O 0.14g，(NH₄)₂SO₄0.5 g，(NH₃)₂HPO₄1.64 g，加自来水溶解，调pH7.2-7.4，再用自来水定容至1L。黏着剑菌二级种子培养基：糖蜜83.0g，蔗糖20.8g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，MnSO₄·H₂O 0.156g，ZnSO₄·7H₂O 0.02g，(NH₄)₂SO₄2.3g，(NH₄)₂HPO₄0.7 g，CaCO₃2.95 g，甜菜碱4.2g，DMBI 0.004g，CoCl₂·6H₂O0.02g，加自来水溶解，调pH 7.2-7.4，再用自来水定容至1L。黏着剑菌发酵培养基：玉米浆55.0g，蔗糖80.0g，(NH₄)₂SO₄2.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.16g，MgO 0.58g，ZnSO₄·7H₂O0.09g，尿素1.0g(灭菌后再加)，(NH₃)₂HPO₄0.58 g，甘油磷酸2.64g，K₂HPO₄0.88 g，FeCl₃0.7g，甜菜碱20.9g，DMBI 0.058g，CoCl₂·6H₂O0.088g，CaCO₃1.16 g，加自来水溶解，调pH 7.2-7.4，再用自来水定容至1L。

首先在斜面培养基划线培养4-5天，刮取斜面上约1/3的菌体接种于一级种子培养基中，30℃，260rpm培养24h左右，再按1.5％的接种量接种于二级种子培养基中，30℃，260rpm培养20h左右，再按10％的接种量接种于发酵培养基中，32℃，260rpm培养168h。从48h开始，每隔24h，取样并用DNS显色法测残糖含量，补加葡萄糖和甜菜碱，使残糖控制在40g/L-50g/L。

野生型、b12fla敲除突变株及b12fla过表达突变株在发酵过程中的OD₇₀₀对比如图9所示。从图9可以发现，b12fla敲除突变株的生物量一直低于野生型菌株，推测b12fla基因的缺失使菌体对氧的亲和力下降，呼吸代谢强度减弱，氧化磷酸化水平降低导致菌体生长情况受到了一定的抑制。相反，b12fla过表达突变株的生物量一直高于野生型菌株，推测b12fla基因的过表达提高了菌体对氧的利用速率，单位菌体的氧消耗速率加快，呼吸强度增强，促进了菌体的生长。在发酵终点时，过表达型菌株生物量相比于敲除型菌株生物量提高了18.50％。

野生型、b12fla敲除突变株及b12fla过表达突变株在发酵终点时维生素B₁₂产量对比如图10所示。就产物合成而言，b12fla基因的敲除对维生素B₁₂的合成产生了不利的影响。黏着剑菌生产维生素B₁₂属于高耗氧过程，发酵合成阶段形成卟啉环、合成低位配基并进行甲基化、氨基化以及钴离子螯合过程都需要大量NADPH和ATP参与，因此，推测b12fla基因的敲除对需要大量氧气参与的关键步骤造成了一定的限制影响，从而影响了维生素B₁₂的合成，其效价降低了12.47％。相反，b12fla基因的过表达对维生素B₁₂的合成有一定的促进作用，b12fla过表型菌株的维生素B₁₂产量提高了8.09％，b12fla过表型菌株的维生素B₁₂产量相比于b12fla敲除型菌株提高了24.3％。总之，b12fla基因在黏着剑菌体内对于菌体的生长及维生素B₁₂的合成是有促进作用的。

图9-10中，WT表示野生型菌株，△b12fla表示b12fla敲除突变株，b12fla表示b12fla过表达突变株。

上述结果说明，可以通过基因工程的手段对黏着剑菌及进行氧调控，通过b12fla基因的过表达来提高黏着剑菌菌体的生长速率及维生素B₁₂的产量，具有实际应用潜力和前景。

Claims (4)

1.一种用于维生素B₁₂工业生产的氧调控基因，其特征在于，所述氧调控基因是黏着剑菌b12fla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种氧调控基因过表达突变株，其特征在于，是将黏着剑菌的b12fla基因过表达而获得，所述的b12fla基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的一种氧调控基因过表达突变株，其特征在于，将黏着剑菌的b12fla基因过表达的过程为：通过黏着剑菌转录组数据分析，选用ORF的启动子作为b12fla基因过表达的启动子，克隆得到该启动子片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；在黏着剑菌基因组中克隆得到b12fla基因片段；通过XbaⅠ和HindⅢ限制性内切酶将pOJ260质粒双酶切得到线性化载体pOJ260；

通过重组反应将上述的启动子片段、b12fla基因片段及酶切后的线性化载体pOJ260进行重组，将重组产物转化至DH5α感受态中进行扩增培养后进行验证；将成功构建的重组质粒pOJ260-b12fla电转至E.coli S17-1感受态细胞中，与黏着剑菌工业菌进行接合转移，即得到黏着剑菌b12fla基因过表达突变株。

4.如权利要求2所述的一种氧调控基因过表达突变株用于生产维生素B₁₂的应用。