CN107446944B - 提高红霉素生产菌的碳源利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高红霉素生产菌的碳源利用率从而改进红霉素合成效率的方法。本发明还提供了一种碳源利用率改进的红霉素生产菌。本发明还提出了在定量代谢流分析基础上，通过基因工程手段来改变不同碳源利用比例，进而改善红霉素合成效率的方法，为工业微生物菌株的选育提供了新的思路。

Description

提高红霉素生产菌的碳源利用率和转化效率从而改进红霉素 合成效率的方法

技术领域

本发明属于生物发酵工程领域，更具体地，本发明涉及提高红霉素生产菌的碳源利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法。

背景技术

红霉素是一种大环内酯类抗生素，在抗生素、抗癌药物和免疫抑制剂等领域中应用广泛。红霉素具有多种组分，其中红霉素A的抗菌活性最好，以它为原料药合成的第二、三代红霉素衍生物己广泛应用于临床。工业上，红霉素主要通过Saccharopolysporaerythraea发酵获得。为了提高红霉素产量，有许多研究从工艺优化和新菌种构建两方面着手。Zou等在初始培养基中添加玉米浆促进了菌体的前期生长，最终使红霉素效价提高了22.2％(Zou X等，Oxygen Uptake Rate Optimization with Nitrogen Regulation forErythromycin Production and Scale-up from 50L to 372M(3)Scale[J].BioresourTechnol，2009，100(3)：1406-1412)。El-Enshasy等采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖后结合补加正丙醇工艺使红霉素产量提高了33％(El-Enshasy H A等，Improvement of ErythromycinProduction by Saccharopolyspora Erythraea in Molasses Based Medium throughCultivation Medium Optimization[J].Bioresour Technol，2008，99(10)：4263-4268)。此外，Zou等通过比较不同补糖模式条件下的发酵过程参数，发现依据生理参数pH的补糖模式优于依据残糖浓度的补糖模式(Zou X等，Response Surface Methodology forOptimization of the Erythromycin Production by Fed-Batch Fermentation Usingan Inexpensive Biological Nitrogen Source[J].Chemical And BiochemicalEngineering Quarterly，2010，24(1)：95-100)。另一方面，通过将外源基因如S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因和透明颤菌血红蛋白基因(vhb)整合到S.erythraea染色体中，增加胞内甲基供体和氧的供应，也可以提高红霉素产量。

红霉素A由起始单位丙酰CoA与6个延伸单位(2S)-甲基丙二酰CoA经过6次缩合反应后形成6-脱氧红霉素内酯(6dEB)，6dEB经甲基化和羟基化后连接两个脱氧糖基而形成。外源正丙醇是红霉素前体丙酰CoA和甲基丙二酰CoA的重要供应来源。本发明人在前期研究中发现控制补加正丙醇和葡萄糖的比例能明显提高红霉素产量，但正丙醇并没有全部用于红霉素合成，有45％-77％正丙醇进入了TCA循环，用作菌体生长的碳源和能源，从而造成了高价值的正丙醇浪费(Chen Y等，Controlling the Feed Rate of Glucose and Propanolfor the Enhancement of Erythromycin Production and Exploration of PropanolMetabolism Fate by Quantitative Metabolic Flux Analysis[J].Bioprocess AndBiosystems Engineering，2013，36(10)：1445-1453)。

因此，本领域还有必要进一步研究提高红霉素生产菌的碳源利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法，以提高工业生产红霉素的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供提高红霉素生产菌的碳源利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法。

在本发明的第一方面，提供一种提高红霉素生产菌Saccharopolysporaerythraea HL3168E3对碳源的利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法，所述方法包括：以红霉素生产菌Saccharopolyspora erythraea HL3168E3为出发菌株，敲除其基因组中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的基因片段，从而获得红霉素合成效率改进的红霉素生产菌。

在一个优选例中，所述的碳源包括：葡萄糖，正丙醇，豆油，或它们的组合。

在另一优选例中，所述的方法还提高红霉素生产菌Saccharopolysporaerythraea HL3168E3的：

平均氧消耗速率，

丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA的生成速率，

总NADPH比生成速率，和/或

总ATP比生成速率。

在另一优选例中，通过同源重组的方法敲除红霉素生产菌Saccharopolysporaerythraea HL3168E3基因组中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。

在另一优选例中，通过同源重组的方法，将阿泊拉霉素(Apramycin)和硫链丝菌素(Thiostrepton)抗性基因替换Saccharopolyspora erythraea HL3168E3基因组中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌，该菌是以Saccharopolyspora erythraea HL3168E3为出发菌株，在该出发菌株的基因组中将SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的基因片段敲除而获得。

在一个优选例中，所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌的基因组中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列被抗性基因替换；较佳地，所述的抗性基因包括：硫链丝菌素(Thiostrepton)抗性基因和/或阿泊拉霉素(Apramycin)抗性基因。

在另一优选例中，所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌能利用更多氧气用于呼吸代谢，从而产生更多ATP用于产物合成。

在本发明的另一方面，提供所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌的用途，用于生产红霉素。

在本发明的另一方面，提供一种生产红霉素的方法，所述方法包括：培养所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌，从而生产红霉素。

在一个优选例中，培养所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌时，采用的碳源包括：淀粉，葡萄糖，正丙醇，豆油。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、重组菌S.erythraea HL3168E3-ΔSE_59(E3B)的构建。质粒pOJ260-ΔSE_59和S.erythraea HL3168E3(E3)之间在SE_59位置的双交换同源重组的示意图。

图2、PCR验证重组菌E3B的基因型。

Lane 1：DL 5000DNA Marker；

Lane 2：PCR产物(1333bp)，突变菌株S.erythraea HL3168E3-ΔSE_59的总DNA用作模板；

Lane 3：PCR产物(1930bp)野生型菌株S.erythraea HL3168E3的基因组DNA用作模板。

图3出发菌E3和重组菌E3B生理代谢参数变化。工业菌株E3和突变菌株E3B之间生长和红霉素生物合成的比较。

(a)5L生物反应器发酵时，随着时间变化的DCW曲线；

(b)5L生物反应器发酵时，随着时间变化的红霉素A(Er-A)含量变化；

(c)5L生物反应器发酵时，随着时间变化的红霉素(Er)含量变化。

图4、出发菌E3和重组菌E3B发酵过程中宏观生理参数变化曲线。

(a)出发菌E3和重组菌E3B的葡萄糖补料速率。

(b)出发菌E3和重组菌E3B的豆油补料速率。

(c)出发菌E3和重组菌E3B的正丙醇补料速率。

(d)出发菌E3和重组菌E3B的发酵液中剩余葡萄糖浓度。

(e)出发菌E3和重组菌E3B的发酵液中剩余正丙醇浓度。

(f)出发菌E3和重组菌E3B的单位体积平均氧消耗速率。

图5、稳定期(45-57h)出发菌E3(上)和重组菌E3B(下)的相对代谢通量分布。图中，分别将葡萄糖的比消耗速率作为100，以此为基准计算其他反应比速率的相对值。单位：mmol/mmol。

图6、快速产素期(45-57h)出发菌E3(上)和突变菌E3B(下)能量因子和还原力分布以及代谢通量分布的比较(mmol·g^-1·day^-1)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种提高红霉素生产菌Saccharopolysporaerythraea HL3168E3对碳源的利用率从而改进红霉素合成效率的方法，所述方法包括：以红霉素生产菌Saccharopolyspora erythraea HL3168E3为出发菌株，敲除其基因组中SEQID NO:1所示核苷酸序列的基因片段，从而获得红霉素合成效率改进的红霉素生产菌。同时，本发明中还提出了在定量代谢流分析基础上，通过基因工程手段来改变不同碳源(葡萄糖、豆油、正丙醇)利用比例，进而改善红霉素合成效率的方法，为工业微生物菌株的选育提供了新的思路。

如本文所用，所述的“敲除”或“删除”指将目标基因从基因组中删除或使其不再编码活性多肽的技术。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

本文利用代谢工程原理，在红霉素工业生产菌S.erythraea HL3168E3(E3)的基础上，构建了甲基丙二酰CoA变位酶基因SE_59失活的工程菌S.erythraea HL3168E3-ΔSE_59(E3B)。在工业生产培养基中，定量分析了基因敲除对细胞生理代谢及胞内代谢通量的影响，并探究了三种碳源基质(葡萄糖、豆油、正丙醇)利用比例的变化与红霉素合成之间的关系，从而为工业生产中实现红霉素产量提高奠定了基础。

本发明提供一种经过遗传改造的、碳源利用率改进的红霉素生产菌，该菌株中SEQID NO:1所示核苷酸序列的基因片段被敲除。

可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的基因片段从基因组中敲除，从而获得相应基因缺失的菌株。

在本发明的优选实施方式中，体外构建用于敲除目的基因的质粒，通过同源重组的方法，把SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的基因片段敲除。经抗性筛选，获得基因组中发生了同源重组的菌株。

作为本发明的更优选的方式，通过同源重组的方法，将阿泊拉霉素(Apramycin)和硫链丝菌素(Thiostrepton)抗性基因替换Saccharopolyspora erythraea HL3168E3基因组中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。抗性筛选时，利用阿普拉霉素和硫链丝菌素进行筛选。

应理解，可采用本领域熟知的多种转化技术将含有预敲除片段的构建物(如质粒)转入宿主菌中。在优选的实施例中，将质粒电转入宿主菌中。可采用本领域周知的方法鉴定所转化的宿主菌是否为所需的宿主菌。例如，可采用PCR方法进行鉴定。

在本发明的具体实施例中，获得了突变菌株E3-ΔSE_59(E3B)。在5L反应器中采用工业发酵培养基进行发酵，发现相比原始菌株，重组菌株对正丙醇和葡萄糖的摄取速率分别提高52.4％和39.8％，正丙醇作为前体进入红霉素合成途径的比例由24.3％增至66.9％，丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA的生成速率分别提高到2.02倍和1.89倍，红霉素化学效价提高了46.9％，达到12740.5μg/mL，主要活性物质红霉素A组份产量提高了64.9％，达到8094.4μg/mL。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

2.1.菌株、质粒、试剂、仪器和培养条件

本发明所用菌株和质粒见表1。

表1、本发明所用菌株或质粒

S.erythraea HL3168E3是一株红霉素工业生产菌(Wu J Q等，TowardImprovement of Erythromycin a Production in an Industrial SaccharopolysporaErythraea Strain Via Facilitation of Genetic Manipulation with an ArtificialAttb Site for Specific Recombination[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology，2011，77(21)：7508-7516)。

分子生物学工具酶、pMD19-T载体及DNA Markers购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；其余生化试剂为进口或国产分析纯试剂。

引物由上海生工生物工程有限公司合成，核酸序列测定由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司完成。

所用仪器：高效液相色谱(Agilent 1100系列)；凝胶成像仪FR-200A型(上海复日科技有限公司)。

S.erythraea生长所需的复合培养基为产孢培养基、种子培养基和发酵培养基(Chen Y等，Genetic Modulation of the Overexpression of Tailoring Genes Erykand Eryg Leading to the Improvement of Erythromycin a Purity and Productionin Saccharopolyspora Erythraea Fermentation[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology，2008，74(6)：1820-1828)。

Escherichia coli采用LB培养基在37℃下培养，抗生素使用浓度：氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL，氯霉素20μg/mL。

S.erythraea在34℃下培养，其中E3B需要添加硫链丝菌素5μg/mL。S.erythraea孢子用20％(v/v)甘油悬浮，储存于-80℃。

2.2.质粒和菌株构建

使用含阿普拉霉素和硫链丝菌素抗性基因筛选标记的穿梭载体pOJ260进行基因组上目的基因的失活，具体过程参见图1。首先，根据S.erythraea中SE_59基因序列设计两对引物。

A1引物：5’-GAA GAT CTT CAT CAC CGT CGA CGG CCT G-3’(SEQ ID NO:3)；

A2引物：5’-CCC AAG CTT GGG TGG TTG ACA TAC ATC GTC-3’(SEQ ID NO:4)；

B1引物：5’-CGG GAT CCC GTC GAG TCC GAC GTG-3’(SEQ ID NO:5)；

B2引物：5’-GGA ATT CCG TTG GCC GCG ATG CCG AG-3’(SEQ ID NO:6)。

用A1和A2这一对引物扩增出上游同源片段SE_59-uh，用B1和B2这一对引物扩增出下游同源片段SE_59-dh(图1)。同源片段扩增采用LA taq DNA聚合酶，以E3基因组DNA为模板。SE_59-uh和SE_59-dh的PCR产物经双酶切分别连接入载体pOJ260中的HindIII/BglII位点和EcoRI/BamHI位点内，获得重组质粒pOJ260-ΔSE_59，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选得到的阳性克隆进行序列测定。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

将构建好的重组质粒再次转化E.coli ET12567(pUZ8002)感受态细胞，进行去甲基化处理，然后通过接合转移法转化出发菌E3。接下来通过阿普拉霉素和硫链丝菌素共同作用，筛选发生一次同源重组的重组菌株，然后通过硫链丝菌素筛选获得发生两次同源重组的目的突变株E3B。

2.3.摇瓶和发酵罐发酵

孢子斜面培养基配方如下：

种子培养基配方如下：

发酵培养基配方如下：

种子摇瓶培养：

将适量斜面活化菌体接入含有50mL种子培养基的三角摇瓶中，在34℃，220rpm下振荡培养到对数生长期，菌浓达到15％(v/v)。

5L罐发酵培养：

接种量20％(v/v)，工作体积3L，温度控制在30℃，发酵过程中通过补加30％(w/v)葡萄糖溶液，使得细胞生理代谢产生有机酸来控制环境pH在7.0左右，同时通过搅拌转速和通气量的调节使发酵液中溶氧始终维持在30％以上。当pH第一次上升至7.5以上时开始补葡萄糖，补糖4h后开始补加50％(v/v)正丙醇和纯豆油。正丙醇和纯豆油补加策略为：

0-40h，0.15±0.01g/(h·L)；

41-120h，0.25±0.01g/(h·L)；

121-165h，0.18±0.01g/(h·L)。

发酵进行至40h左右开始取样，之后每隔12h或48h取样20mL样品进行发酵过程参数检测。

2.4.分析方法

生物量测定：培养基中含碳酸钙时，用0.25mol/L盐酸溶液处理发酵液。取10mL发酵液，3500rpm离心10min，量取上清液体积，同时离心后沉淀烘干48h，称重，计算细胞干重。

总糖(还原糖)浓度测定采用DNS法(Adrio J L等，Genetic Improvement ofProcesses Yielding Microbial Products[J].FEMS Microbiology Reviews，2006，30(2)：187-214)。

葡萄糖浓度测定采用试剂盒法(Chen Y等，The Glucose Rq-Feedback ControlLeading to Improved Erythromycin Production by a Recombinant StrainSaccharopolyspora Erythraea Zl1004and Its Scale-up to 372-M(3)Fermenter[J].Bioprocess And Biosystems Engineering，2015，38(1)：105-112)。

正丙醇浓度测定采用气相色谱法(Chen Y等，Genetic Modulation of theOverexpression of Tailoring Genes Eryk and Eryg Leading to the Improvement ofErythromycin a Purity and Production in Saccharopolyspora ErythraeaFermentation[J].Applied and Environmental Microbiology，2008，74(6)：1820-1828)。

红霉素化学效价测定采用硫酸显色法(Baltz R H.Molecular EngineeringApproaches to Peptide，Polyketide and Other Antibiotics[J].NatureBiotechnology，2006，24(12)：1533-1540)。

红霉素A产量通过HPLC测定(Chen Y等，Significant Decrease of BrothViscosity and Glucose Consumption in Erythromycin Fermentation by DynamicRegulation of Ammonium Sulfate and Phosphate[J].Bioresour Technol，2013，134：173-179)。

豆油含量通过低场核磁共振法测定(Liu T T W T，Yang Y Low Field NuclearMagnetic Resonance for Rapid Quantitation of Microalgae Lipid and ItsApplication in High Throughput Screening[J].Chin J Biotech，2016)。

2.5宏观代谢流分析

根据KEGG数据库上正丙醇代谢途径和陈勇等(Chen Y等，Genetic Modulation ofthe Overexpression of Tailoring Genes Eryk and Eryg Leading to theImprovement of Erythromycin a Purity and Production in SaccharopolysporaErythraea Fermentation[J].Applied and Environmental Microbiology，2008，74(6)：1820-1828)构建的代谢模型，红霉素合成的代谢网络可以简化为糖酵解途径(EMP)、磷酸戊糖途径(PPP)、三羧酸循环(TCA)及红霉素合成途径。代谢模型中测定葡萄糖、正丙醇、豆油消耗速率和红霉素合成速率、二氧化碳释放速率。化学计量学平衡方程可以用S●V＝b表示，其中S为化学计量矩阵，V为未知流量，b为代谢物净积累量、消耗量和代谢物输入输出量。

代谢模型中的生化反应如表2。

表2

计算模型如表3。

表3

实施例1、基因SE_59失活菌株E3B的构建

通过基因敲除的手段，获得了基因SE_59失活菌株E3B。即用硫链丝菌素抗性基因tsr(1086bp)替代甲基丙二酰CoA变位酶基因SE_59中间部分(1683bp)，使SE_59基因不能正常表达。

验证方法为：在SE_59基因的缺失片段上游和下游分别设计正向引物C1和反向引物C2，以出发菌株E3的总DNA为模板，扩增出大小为1.9kb的条带，而SE_59基因缺失重组菌E3B扩增出大小为1.3kb的条带(图2)，两个条带大小大约相差0.6kb，与预测值(1683-1086＝597bp)相符。

C1引物：5’-GTC AAG CCG CTC TAC ACC GA-3’(SEQ ID NO:7)；

C2引物：5’-CGA CAA CGA TCA TGA TGT CGG A-3’(SEQ ID NO:8)。

对PCR扩增得到的基因片段进行DNA测序，结果如SEQ ID NO:2(1333bp)，显示重组菌E3B确实为目的重组菌株。

实施例2、SE_59基因敲除对菌体生理代谢的影响

在5L罐中对两个菌株进行发酵培养，其结果如图3所示。从生长曲线来看，两者基本一致，表明SE_59基因的敲除对菌体生长几乎没有影响，如图3a。48h之前为菌体生长期，48h后菌体进入稳定期，而160h以后，菌浓开始略微下降(图3a)。相比之下两个菌株的红霉素整体化学效价和组分A的产量在30h前都差别不大，但是在30h后，突变菌株E3B的红霉素合成速率开始增大，至发酵结束时，其红霉素整体化学效价和有效组分A产量都远大于出发菌株E3，达到12740.5和8094.4μg/mL，分别提高了47.0％和64.9％，如图3b和c。此外，重组菌E3B的红霉素比生成速率提高了52.8％，表明敲除SE_59基因对单位菌体红霉素合成速率的提升是有利的。

整个发酵过程中，重组菌E3B对葡萄糖和正丙醇的利用速率分别提高了52.4％和39.8％，对豆油的利用速率变化不显著(表4)，表明SE_59基因的敲除提高了红色糖多孢菌对葡萄糖和正丙醇的摄取速率，这可能与SE_59基因的敲除增强菌体利用葡萄糖和正丙醇相关酶系活性有关。正丙醇能增强丙酸激酶活性，添加正丙醇后在摇瓶发酵中红霉素产量提高了49.3％(Jean Potvin P P.Influence of N-Propanol on Growth and AntibioticProduction by an Industrial Strain of Streptomyceserythreus under DifferentN-Utritional Conditions[J].Biotechnol Lett，1993)。此外，重组菌E3B的单位菌体平均氧消耗速率为27.2mmol/(g DCW·天)，是原始菌E3的1.7倍(图4f)，表明突变菌E3B能利用更多氧气用于呼吸代谢，从而产生更多ATP用于产物合成。

表4、5L罐发酵基质的比消耗速率和产物的比生成速率计算

a：Q_s1＝(ds1/dt)/x(mmol/g DCW/天)，s1＝葡萄糖，在0-165h，葡萄糖比消耗速率。

b：Q_s2＝(ds2/dt)/x(mmol/g DCW/天)，s2＝正丙醇，在0-155h，正丙醇比消耗速率。

c：Q_s3＝(ds3/dt)/x(mmol/g DCW/天)，s3＝豆油，在0-165h，豆油比消耗速率。

d：Q_p＝(dp/dt)/x(mmol/g DCW/天)，p＝红霉素，在0-165h，红霉素比生成速率。

另一方面，相比出发菌E3，重组菌E3B中产物红霉素对豆油和正丙醇的得率分别增大48.9％和3.3％，而对葡萄糖的得率减小了5.2％(表5)，表明正丙醇和豆油对产物红霉素的转化效率均有提高，而葡萄糖对产物红霉素的转化效率有所下降，这就说明重组菌E3B在正丙醇摄取速率增大的同时，红霉素对正丙醇的转化效率也有所提高，因此在一定程度上，从宏观代谢角度揭示了红霉素产量提高的原因。

表5、发酵细胞和产物得率系数计算

a：Y p/葡萄糖＝d(红霉素)/d(葡萄糖)(g/g)，红霉素对葡萄糖的得率系数(theyield coefficient of product erythromycin from glucose)；

b：Y p/正丙醇＝d(红霉素)/d(正丙醇)(g/g)，红霉素对正丙醇的得率系数(theyield coefficient of product erythromycin from propanol)；

c：Y p/豆油＝d(红霉素)/d(豆油)(g/g)，红霉素对豆油的得率系数(the yieldcoefficient of product erythromycin from soybean oil)；

d

实施例3、SE_59基因敲除对代谢通量的影响

正丙醇是红霉素合成重要前体的来源。正丙醇能促进红霉素的合成，但大部分的正丙醇通过前体甲基丙二酰CoA进入中心碳代谢途径，因此对S.erythraea菌体代谢通量分布进行定量分析是十分必要的。

从整个发酵过程来看，45-57h菌体处于红霉素快速合成期(图3b)，且两个菌株的碳原子回收率分别为96.7％(E3)和101.1％(E3B)(表6)，满足代谢流分析的物料守衡条件，因此本发明选取发酵过程的45-57h数据进行代谢通量分析。根据陈勇等提出的代谢模型生成化学计量矩阵方程，结合测量的胞外代谢速率数据，采用matlab软件计算出胞内各个反应的代谢通量，结果如图5所示。通过计算产生NADH和FADH₂的各代谢途径流量之和，然后除以2得到该代谢模型下的计算OUR值，并与实测OUR值的比值来判定代谢模型的可靠性。实测OUR与计算OUR的比值分别为1.044(E3)和0.967(E3B)(表6)，表明代谢流计算结果是可信的。

表6、产素期(45-57h)碳回收率和OUR的计算

a：r_s1＝ds1/dt(mmol/L/h)，s1＝葡萄糖，葡萄糖消耗率；

b：r_s2＝ds2/dt(mmol/L/h/day)，s2＝正丙醇，正丙醇消耗率；

c：r_s3＝ds3/dt(mmol/L/h)，s3＝豆油，豆油消耗率；

d：r_p＝dp/dt(mmol/L/h)，p＝红霉素，红霉素生成率；

e：CER＝d(CO₂)/dt(mmol/L/h)，二氧化碳释放速率(carbon dioxide evolutionrate)；

f：细胞成分分子式(Cell molecular formula)：C_48.31H_7.46O_34.95N_9.28，细胞生成率(cell formation rate)；

g：碳回收率(％)＝[(r_p*37+CER*1+生物量)/(r_s1*6+r_s2*3+r_s3*117.17)]*100％，副产物忽略不计。

本发明人发现，相比出发菌E3，重组菌E3B的正丙醇代谢通量提高了90.6％，磷酸戊糖途径通量增加67.1％，而红霉素合成途径通量提高到4.8倍，表明敲除SE_59基因对菌体胞内代谢产生了显著影响。

重组菌E3B中丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA的生成速率是出发菌E3的2.02倍和1.89倍，甲基丙二酰CoA经琥珀酰CoA进入TCA循环的通量减小了22.1％，表明通过敲除SE_59基因降低正丙醇进入TCA循环通量的目的成功实现。

深入分析甲基丙二酰CoA代谢节点的通量分布可以发现，出发菌E3只有27.2％的正丙醇用于红霉素的合成；相比之下，突变菌E3B有70.2％的正丙醇进入了红霉素的合成代谢(表7)，表明重组菌E3B中正丙醇的代谢通量分布发生了显著改变，也就是说SE_59基因的敲除在提高正丙醇利用速率的同时也提高了正丙醇对红霉素的转化效率，这应该是红霉素产量提高的主要原因。

NADH和FADH₂作为细胞呼吸代谢过程中还原力的主要提供物质，其生成和消耗的分布对细胞生理代谢研究至关重要。由表7可知，两个菌株中，NADH和FADH₂的生成都主要来源于葡萄糖和豆油的分解代谢，正丙醇的贡献相对较小。在重组菌E3B中，总NADH的比生成速率比出发菌E3有小幅增大，其中来自葡萄糖和正丙醇的NADH占总NADH的比例都略有增大，表明SE_59基因的敲除会促进菌体产生更多的还原力，进而增强菌体的呼吸代谢强度，也可以从OUR的变化曲线中得到证实，如图4f。

此外，NADPH也是细胞生理代谢反应所需的重要辅因子，而且红霉素合成代谢过程中需要消耗大量NADPH，因此有必要研究出发菌E3和重组菌E3B代谢过程中对于NADPH的利用情况(图6)。红霉素合成途径中缩合反应消耗5分子NADPH、羟基化消耗1分子NADPH、糖基化消耗3分子的NADPH，而NADPH再生主要靠磷酸戊糖途径提供。分析发现，突变菌株E3B的总NADPH比生成速率是出发菌株E3的3倍(表7)，其用于红霉素合成的比例也显著上升，表明SE_59基因的敲除有利于NADPH的合成，增加的NADPH主要用于红霉素合成。

ATP是菌体生长和代谢反应所需的主要能量物质，比较突变菌株E3B与出发菌株E3的ATP合成速率对研究整个代谢网络的调节机制具有重要意义。表7列出了根据代谢途径流量计算得到的ATP比生成速率。结果显示重组菌E3B的总ATP比生成速率有提高，说明SE_59基因的敲除促进了菌体的能量代谢。其中绝大多数ATP来自菌体氧化磷酸化(表7)，说明S.erythraea属于好氧菌，菌体能量代谢受摄氧速率的影响。葡萄糖是主要的供能物质，其分解代谢产生的ATP占总ATP的比例上升了11.1％，而豆油分解代谢产生的ATP占总ATP的比例下降了12.8％，表明S.erythraea倾向于利用葡萄糖产生ATP，以葡萄糖为主要碳源物质的工艺控制是合理的，即在不影响红霉素合成速率的前提下，通过降低用于ATP合成的高价值的正丙醇消耗可以实现原料成本的降低。有意思的是，尽管正丙醇分解代谢产生的ATP占总ATP的比例均较小，但是突变株E3B仍是出发菌株E3的3.93倍，说明重组菌E3B总的能量需求增加，需要消耗更多的正丙醇用于产生ATP，在稳定期其平均比消耗速率提高101.8％，同时葡萄糖作为主要供能物质，其平均比消耗速率提高20.9％，这可能是菌体自身的一种补偿效应(图6)。

表7、基于代谢流量分析的NADPH、NADH、FADH₂和ATP计算

a0：总NADPH比生成速率(mmol g^-1day^-1).

a1：r17*9/总NADPH比生成速率.

b0：总NADH比生成速率(mmol g^-1day^-1).

b1:[(r6-r14)*1+(r7+r9+r10+r11)*((r6-r14)*1/r11)]/总NADH比生成速率.

b2:[r16*1+(r7+r9+r10+r11)*(r16*1/r11)]/总NADH比生成速率.

b3：[r15*50.7+r14*1+(r7+r9+r10+r11)*((r15*50.7+r14*1)/r11)]/totalNADH.

c0：总FADH₂比生成速率(mmol g^-1day^-1).

c1:[(r6-r14)*1]/总FADH₂比生成速率.

c2：(r16*1)/总FADH₂比生成速率.

c3：[r15*40.9+(r15*50.7+r14*1)]/总FADH_2.

d0：总ATP比生成速率(mmol g^-1day^-1).

d1：[-r1-r5+2*(r6-r14)+(r7-r14-r20)*1+(r6-r14+r7-r14+r20+r12+(r6-r14)*4)*2.5]/总ATP比生成速率。

d2：[r16-r12+(r18+2*r16+r12+(r12-r20)*4)*2.5+(r12-r20)*1)]/总ATP比生成速率。

d3:[-6.43*r15+(57.1*r15+r14)*1+40.9*r15*1.5+(r15*50.7+r14*3+(57.1*r15+r14)*4)*2.5]/总ATP比生成速率。

d4:[r22*2.5+r23*1.5]/总ATP比生成速率。

实施例4、SE_59基因敲除提高红霉素产量的原因初探

有研究认为，发酵初期较高浓度葡萄糖有利于菌丝体(孢子)萌发、生长和大量繁殖，有利于缩短营养期(Fan Daidi C B等，The Improvement of Fermentation TechnicalParameters for the Eryhrus-Mycin Formation[J].Chin J Biotech,1999,15(1):104-108)，而豆油(Hamedi J,Malekzadeh F,V.N.Improved Production of Erythromycin bySaccharopolyspora Erythraea by Various Plant Oils[J].Biotechnol Lett,2002,24(9):697-700)和正丙醇(El-Enshasy H A,Mohamed N A,Farid M A,et al.Improvementof Erythromycin Production by Saccharopolyspora Erythraea in Molasses BasedMedium through Cultivation Medium Optimization[J].Bioresour Technol,2008,99(10):4263-4268)均能提高红霉素产量。在工业生产发酵过程中，三种碳源物质(葡萄糖、豆油、正丙醇)均会被利用，但由于自身复杂的反馈调节机制限制了它们的利用效率。近年来，很多关于调控基因与发酵底物关系的研究取得了良好的进展，如调控基因glnR用于调节氮源利用的效率(Pullan S T等，Genome-Wide Analysis of the Role of Glnr inStreptomyces Venezuelae Provides New Insights into Global Nitrogen Regulationin Actinomycetes[J].BMC Genomics,2011,12(1):175)。因此要提高红霉素产量，需要研究发酵过程中各基质代谢通量分布变化并解析其代谢机制，在此基础上指导菌种改造。

本发明敲除甲基丙二酰CoA变位酶基因SE_59后，提高了红色糖多孢菌对正丙醇和葡萄糖的利用能力，这可能是细胞对菌体生长、代谢维持和产物合成的一种补偿效应。甲基丙二酰CoA变位酶失活后，弱化了正丙醇通过甲基丙二酰CoA进入TCA循环的分解代谢支路(图6)，将一部分原本用于菌体生长和能量代谢的正丙醇用于红霉素合成，这就需要更多的正丙醇和葡萄糖来补偿菌体正常生长和产物合成时所需的能量。

结论

微生物菌种改造、发酵工艺优化及工程放大是微生物应用于工业发酵的三个最基本的方面。三者之间既相对独立又相互关联。先前有关S.erythraea菌种改良的研究由于缺乏基因突变对细胞全局的考虑，常常导致菌体生理特性的负面改变，因此必须从全局的角度去系统分析和研究微生物发酵过程，这已经成为当前研究的重要方向。

在本发明的上述实施例中，通过敲除工业生产菌E3中甲基丙二酰CoA变位酶基因SE_59，获得了突变菌株E3B。突变菌株E3B对正丙醇和葡萄糖的利用能力均明显提升，红霉素产量也得到了明显的提高。与出发菌从宏观生理参数、底物利用水平和微观代谢通量分布等各方面进行了比较研究，揭示了重组菌E3B红霉素合成效率得到提高的内在机制。本发明中提出的以定量代谢通量分析来指导菌种改良的方法对其他次级代谢产物有较好的借鉴意义。为后续提高红霉素的产量提供了思路。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1. 一种提高红霉素生产菌Saccharopolyspora erythraea HL3168 E3对碳源的利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法，其特征在于，所述方法包括：以红霉素生产菌Saccharopolyspora erythraea HL3168 E3为出发菌株，敲除其基因组中SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的基因片段，从而获得红霉素合成效率改进的红霉素生产菌；所述碳源包括豆油。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，当pH第一次上升至7.5以上时开始补葡萄糖，补糖4 h后开始补加50%(v/v)正丙醇和纯豆油。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还提高红霉素生产菌Saccharopolyspora erythraea HL3168 E3的：

平均氧消耗速率，

丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA的生成速率，

总NADPH比生成速率，和/或

总ATP比生成速率。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过同源重组的方法敲除红霉素生产菌Saccharopolyspora erythraea HL3168 E3基因组中SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过同源重组的方法，将阿泊拉霉素和硫链丝菌素抗性基因替换Saccharopolyspora erythraea HL3168 E3基因组中SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列。

6.一种碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌，其特征在于，该菌是以Saccharopolyspora erythraea HL3168 E3为出发菌株，在该出发菌株的基因组中将SEQID NO: 1所示核苷酸序列的基因片段敲除而获得；所述碳源包括豆油。

7.如权利要求6所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌，其特征在于，其基因组中SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列被抗性基因替换。

8.如权利要求7所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌，其特征在于，所述的抗性基因包括：硫链丝菌素抗性基因和/或阿泊拉霉素抗性基因。

9.如权利要求8所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌，其特征在于，该菌株能利用更多氧气用于呼吸代谢，从而产生更多ATP用于产物合成。

10.权利要求6-9任一所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌的用途，用于生产红霉素。

11.一种生产红霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求6-9任一所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌，从而生产红霉素；所述碳源包括豆油。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，培养权利要求6-9任一所述的碳源利用率和转化效率改进的红霉素生产菌时，所述的碳源还包括：淀粉，葡萄糖，正丙醇。

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