CN110129400B - 一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法 - Google Patents

一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110129400B
CN110129400B CN201910442602.5A CN201910442602A CN110129400B CN 110129400 B CN110129400 B CN 110129400B CN 201910442602 A CN201910442602 A CN 201910442602A CN 110129400 B CN110129400 B CN 110129400B
Authority
CN
China
Prior art keywords
odd
culture medium
fatty acid
chain fatty
content
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910442602.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110129400A (zh
Inventor
娄文勇
张林尚
宗敏华
倪子富
杨继国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201910442602.5A priority Critical patent/CN110129400B/zh
Publication of CN110129400A publication Critical patent/CN110129400A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110129400B publication Critical patent/CN110129400B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法。该方法包括：将菌种接种至活化培养基中，培养得到活化的菌种；将有机醇加入培养基中，灭菌得到优化培养基；将活化的菌种接种到优化培养基中，摇床培养，得到培养液，在培养液中，含有奇数碳链脂肪酸含量提高的微生物；将培养液离心取沉淀，冻干得到冻干菌粉；将冻干菌粉与盐酸溶液混合，水浴加热处理，萃取，干燥得到油脂类混合物；测试油脂类混合物，发现微生物油脂中奇数碳链脂肪酸百分含量有所提高。本发明公开的技术可以将油脂中奇数碳链脂肪酸含量由30%提高至80%。与现有技术相比，本发明提供的方法，原料添加量更小、价格更便宜、效果更好。

Description

一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种发酵生产含奇数碳链脂肪酸油脂的方法。
背景技术
动植物油脂中绝大多数脂肪酸的碳链长度为偶数，少数为奇数，比如十五酸、十七酸。近些年的研究发现在人体中含量较少的奇数碳链脂肪酸，具有重要的生理功能，有研究显示人体中奇数碳链脂肪酸含量与糖尿病、心血管疾病、肥胖等都呈负相关。
通过对红细胞细胞膜脂肪酸的分析，Krachler等人(Krachler,B.；Norberg,M.,Jw；Hallmans,G.；Johansson,I.；Vessby,B.；Weinehall,L.；Lindahl,B.J.N.M.；Nmcd,C.D.,Fatty acid profile of the erythrocyte membrane preceding development ofType 2 diabetes mellitus.2008,18(7),503-510.)得出结论，红细胞细胞膜中十五酸和十七酸含量越高，糖尿病的风险越低。Santaren(Santaren,I.D.；Watkins,S.M.；Liese,A.D.；Wagenknecht,L.E.；Rewers,M.J.；Haffner,S.M.；Carlos,L.；Hanley,A.J.,％JAmerican Journal of Clinical Nutrition,Serum pentadecanoic acid(15:0),ashort-term marker of dairy food intake,is inversely associated with incidenttype 2 diabetes and its underlying disorders.2014,100(6),1532.)选取了来自三个民族、共计659个的成年人样本来研究奇数碳链脂肪酸含量和糖尿病之间的关系，他们发现人体血浆中十五酸的含量与Ⅱ型糖尿病发病率之间呈负相关。Weitkunat等人(Weitkunat,K.；Schumann,S.；Nickel,D.；Kappo,K.A.；Petzke,K.J.；Kipp,A.P.；Blaut,M.；Klaus,S.J.M.N.；Research,F.,Importance of propionate for the repression of hepaticlipogenesis and improvement of insulin sensitivity in high-fat diet-inducedobesity.2016,60(12),2611-2621.)研究发现，高油脂膳食能够降低小鼠体细胞对胰岛素的敏感性，奇数碳链脂肪酸(C15:0)能够提高小鼠细胞对胰岛素的敏感性。
Smedma等人(Smedman,A.；Gustafsson,I.,Lg；Vessby,B.J.A.J.o.C.N.,Pentadecanoic acid in serum as a marker for intake of milk fat:relationsbetween intake of milk fat and metabolic risk factors.1999,69(1),22)运用流行病学调查的方法，分析了62位70岁老人的奶制品摄入量和心血管疾病发病率之间的关系，其结论是奶制品摄入量和心血管疾病发病率呈负相关。等人(Eva,W.；Jan-HKan,J.；Tommy,C.；Kurt,B.；Mats,E.；GRan,H.；Ingegerd,J.；Per,S.G.J.A.J.o.C.N.,Biomarkers of milk fat and the risk of myocardial infarction in men andwomen:a prospective,matched case-control study.2010,92(1),194.)的研究证实血清磷脂中十七酸和十五酸的含量与心肌梗塞的发病率呈反比，尤其是在女人中。Kay-Tee等人(Kay-Tee,K.；Friesen,M.D.；Elio,R.；Robert,L.；Nicholas,W.J.P.M.,Plasmaphospholipid fatty acid concentration and incident coronary heart disease inmen and women:the EPIC-Norfolk prospective study.2012,9(7),e1001255.)的研究表明，血清中奇数碳脂肪酸含量与冠心病呈负相关。Marcia等(Mc,D.O.O.；Nettleton,J.A.；Lemaitre,R.N.；Steffen,L.M.；Kromhout,D.；Rich,S.S.；Tsai,M.Y.；Jacobs,D.R.；Mozaffarian,D.J.J.o.t.A.H.A.,Biomarkers of dairy fatty acids and risk ofcardiovascular disease in the Multi-ethnic Study of Atherosclerosis.2013,2(4),e000092)选取了年龄在45-84岁的成年人2837个进行研究，发现C15:0的含量每升高一个单位，心血管疾病和冠状动脉粥样硬化的发病率分别降低19％和26％。
有研究表明(Aglago,E.K.；Biessy,C.；Torres-Mejía,G.；Angeles-Llerenas,A.；Gunter,M.J.；Romieu,I.；Chajès,V.J.J.o.L.R.,Association between serumphospholipid fatty acid levels and adiposity in Mexican women.2017,58(7),1462-1470.)人体血清磷脂中奇数碳链脂肪酸含量与肥胖成负相关。Fonteh等人(Fonteh,A.N.；Cipolla,M.；Chiang,J.；Arakaki,X.；Harrington,M.G.J.P.O.,Humancerebrospinal fluid fatty acid levels differ between supernatant fluid andbrain-derived nanoparticle fractions,and are altered in Alzheimer'sdisease.2014,9(6),e100519.)分析了正常人和阿尔茨海默氏症病人脑脊髓液纳米颗粒中脂肪酸的差异，发现阿尔茨海默氏症病人的奇数碳饱和脂肪酸低于正常人的。
CN106900888A公开一种含奇数碳链脂肪酸的油脂，具有降低煎炸油的极性的功效。
但是目前奇数碳链的脂肪酸产品并未问世，其主要原因是奇数碳链脂肪酸来源很少，动植物油脂中含量很低。微生物是生产奇数碳链脂肪酸的绝佳材料。微生物中浑浊红球菌因其高的含油率(80％)备受青睐。但是普通葡萄糖培养基所产的油脂中奇数碳链脂肪酸只占30％，含量仍旧较低。已经报道的提高奇数碳链脂肪含量的策略有两种：1)外援添加丙酸盐策略，(Wu H,San K Y.EngineeringEscherichia colifor odd straight mediumchain free fatty acid production[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(19):8145-8154.)；2)基因工程策略(Wu H,San K Y.Efficient odd straightmedium chain free fatty acid production by metabolically engineeredr,Escherichia coli[J].Biotechnology and Bioengineering,2014,111(11):2209-2219.Young-Kyoung P,Thierry D,Rodrigo L A,et al.Optimization of odd chainfatty acid production by Yarrowia lipolytica[J].Biotechnology for Biofuels,2018,11(1):158-.)。但是这两种方法的改良效果都有限，丙酸盐本身是防腐剂，添加量过大抑制菌的生长，基因工程改良的细菌目前最高的奇数碳链脂肪产量仅仅为1.2g/L,解脂耶氏酵母只有0.75g/L,产量均很低。因此需要开发新的提高奇数碳链脂肪酸的新技术。
本发明公开一种新的增加奇数碳链脂肪酸含量的方法。可以将奇数碳链脂肪酸含量由30％提高至80％，方法简单易操作，工业化前景巨大。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法。
本发明提供的方法旨在提高油脂中奇数碳链脂肪酸的百分含量，提高生产效率。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的一种提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将微生物接种至活化培养基中，摇床培养处理，得到活化的菌种；
(2)配制优化培养基
将有机醇加入基本培养基中，混合均匀，灭菌处理，得到优化培养基；
(3)将步骤(1)所述活化的菌种接种到步骤(2)所述优化培养基中，摇床培养处理，使微生物油脂中的奇数碳链脂肪酸质量百分含量从30％提高至80％。
进一步地，可以将步骤(3)所述培养液进行离心处理(离心转速为4000-10000rpm；离心处理的时间为30s-10min)，取沉淀，洗涤，冻干得到冻干菌粉；然后将所述冻干菌粉与盐酸溶液(盐酸溶液的浓度为0.5-6mol/L；所述冻干菌粉与盐酸溶液的质量体积比为1:5-1:100g/mL。)混合，水浴加热处理(水浴加热处理的温度为60-100℃；水浴加热处理的时间为5-120min)，萃取，干燥得到油脂类混合物；测试油脂类混合物(气相色谱法)，发现微生物油脂中奇数碳链脂肪酸质量百分含量有所提高(奇数碳链脂肪酸含量能够从30％提高至80％)。
进一步地，步骤(1)所述微生物为产油微生物；所述菌种包括浑浊红球菌及解脂耶氏酵母。
进一步地，步骤(1)所述活化培养基包括肉汤培养基及LB培养基。
进一步地，步骤(1)所述摇床培养处理的温度为20-37摄氏度，进一步优选为25～35摄氏度，进一步优选为28～33摄氏度，摇床培养处理的转速为80-250rpm，进一步优选为100-200rpm，进一步优选为120～180rpm，摇床培养处理的时间为12-48h，进一步优选为16～36h，进一步优选为20～30h。
进一步地，步骤(2)所述有机醇包括丙醇、甲醇、戊醇及庚醇；所述丙醇包括正丙醇和异丙醇；所述有机醇的添加量为培养基体积的0.3％-1.5％(v/v)。所述有机醇优选丙醇。
进一步地，步骤(2)所述基本培养基包括MSM培养基及马铃薯培养基，所述培养基优选MSM培养基。
进一步地，步骤(2)所述基本培养基的碳氮比不小于10；进一步优选为≥20，进一步优选为≥40。
进一步地，步骤(2)所述灭菌处理的方式包括高温高压灭菌(121℃,20min)及低温灭菌(115℃30min)。
进一步地，步骤(3)所述接种量为培养基的0.1％-10％(v/v)。
进一步地，步骤(3)所述摇床培养处理的温度为20-37摄氏度，进一步优选为25～35摄氏度，进一步优选为28～33摄氏度，摇床培养处理的时间为48-168h，进一步优选为60～144h,进一步优选为72～120h，摇床培养处理的转速为80-250rpm，进一步优选为100-200rpm，进一步优选为120～180rpm。
本发明提供的一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法，包括：1、菌种活化；2、MSM培养基配制、灭菌及菌体培养；能够通过离心收菌、提油等操作进行提高的效果验证。
进一步地，MSM培养基由碳源、氮源、磷源、金属离子及水等构成。
进一步地，本发明所使用的基本培养基的碳源包括但不局限于葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖等单糖、双糖，还包括各种低聚糖，还包括淀粉、纤维素、木质素等高分子碳水化合物；还包括但不局限于丁烷、己烷、庚烷、辛烷、十一烷、十二烷、十四烷等碳链长度在4-20的烃类及其混合物，碳链长度在2-20的脂肪酸、脂肪酸酯及其混合物，碳链长度在2-30的各种脂肪醇及其混合物。
进一步地，所述碳源包括尿素、氯化铵、氨基酸、多肽、蛋白质等各种无机和有机的含氮化合物。
进一步地，所述脂肪酸酯包括脂肪酸甘一酯、甘二酯、甘三酯及脂肪酸甾醇酯、Ve脂肪酸酯、磷脂等其他脂肪酸酯类。
本发明提供了一种利用有机醇提高油脂中奇数碳链脂肪酸质量百分含量的方法。本发明提供的方法，能够将菌所产油脂中奇数碳链脂肪酸含量由30％提高至80％。所述的奇数碳链脂肪酸包括但不局限于十一酸、十三酸、十五酸、十七酸、十九酸、十五烯酸、十七烯酸等。所述的MSM培养基为无机盐培养基。本发明涉及的基本过程为：1、菌种活化；2、MSM培养基配制、灭菌、菌体培养；3、离心收菌、提油；4、测定生物量、含油量、油脂脂肪酸组成。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的一种提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，可以将油脂中奇数碳链脂肪酸含量由30％提高至80％；与现有技术相比，原料添加量更小、价格更便宜、效果更好。
附图说明
图1为脂肪酸组成的气相色谱图；
图2为本发明实施例与对比例不同培养条件下菌体的生物量柱状图；
图3为本发明实施例与对比例不同培养条件下菌体的含油量柱状图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
对比例的实验方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将浑浊红球菌接入LB培养基中，在温度为30℃，转速为160rpm的摇床中培养24h，活化菌种。活化得到的菌种为一级发酵菌种。
(2)配制培养基
参照下表1配制培养基(表1为MSM培养基的成分表)，作为举例，培养基的体积为1升。
表1
(3)菌的培养
参照表1配制MSM培养基，得到的培养基在121℃条件下进行灭菌处理，灭菌处理时间为12min；将培养基分装至250mL的锥形瓶中，将步骤(1)活化的菌种接种至250mL锥形瓶中，接种量为1％(v/v)，在温度为30℃、转速为160rpm的摇床中培养4天，然后采用离心的方法收菌，离心转速为6000rpm，离心的时间为2min，得到菌体沉淀。
(4)生物量测定
将步骤(3)所述菌体沉淀，用0.1％(w/w)PBS缓冲液洗涤三次，除去菌体沉淀上的残留培养基；之后冻干，得到冻干菌粉，称重，计算生物量。
(5)含油量测定
称取0.1g步骤(4)所述冻干菌粉，加入2mL浓度为3mol/L的HCl溶液，混合均匀，然后在80℃条件下水浴30min，之后加入2mL三氯甲烷进行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，用氮气吹干萃取液中的三氯甲烷，得到油脂类混合物，称重计算含油量。
(6)全样脂肪酸测定
取步骤(5)所述油脂类混合物0.02g，将油脂类混合物加入2mL正己烷中溶解，搅拌均匀，然后在加入2mL浓度为0.5mol/L氢氧化钠的甲醇溶液，在60℃条件下水浴20min，完成甲酯化反应，取上清液(正己烷)用气相色谱法分析脂肪酸组成。气相色谱法的条件：色谱柱选用HP-5，柱温箱的温度为180℃，进样口的温度为190℃，检测器的温度为270℃。得出结果图，根据峰的保留时间判定脂肪酸种类。
对比例1
按照表1(表1为MSM培养基的成分表)配制培养基，不额外添加任何物质，按照上述方法培养及测定生物量、含油量及脂肪酸组成参数。
对比例2
按照表1的配制培养基，但在表1的基础上再添加0.5％(w/w)的丙酸钠，0.5％表示丙酸钠的质量为培养基质量的0.5％；其次步骤(3)中的摇床培养时间改为84h，测定生物量、含油量及脂肪酸组成参数。
对比例3
按照表1的配制培养基，但在表1的基础上再添加1％的丙酸钠(1％表示丙酸钠的质量为培养基质量的1％)；其次步骤(3)中的摇床培养时间改为84h，测定生物量、含油量及脂肪酸组成参数。
对比例4
按照表1的配制培养基，但在表1的基础上再添加1.5％的丙酸钠(1.5％表示丙酸钠的质量为培养基质量的1.5％)；其次步骤(3)中的摇床培养时间改为84h，测定生物量、含油量及脂肪酸组成参数。
对比例5
按照表1的配制培养基，在表1的基础上再添加2％的丙酸钠(2％表示丙酸钠的质量为培养基质量的2％)；其次步骤(3)中的摇床培养时间改为96h，测定生物量、含油量及脂肪酸组成参数。
对比例6
按照表1的配制培养基，在表1的基础上再添加2％的丙醇(2％表示丙醇的质量为培养基质量的2％)；其次步骤(3)中的摇床培养时间改为96h，测定生物量、含油量及脂肪酸组成参数。
实施例1
实施例1提供的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将菌种(浑浊红球菌)接种至活化培养基(LB培养基)中，摇床培养处理，摇床培养处理的温度为30℃，摇床培养处理的时间为24h，摇床培养处理的转速为160rpm，得到活化的菌种；
(2)配制优化培养基
按照表1的配制培养基，但在表1的基础上将丙醇加入培养基中，丙醇的质量为培养基质量的0.3％，混合均匀，灭菌处理(在121℃条件下进行灭菌处理，灭菌处理时间为12min)，得到优化培养基；
(3)将步骤(1)所述活化的菌种接种到步骤(2)所述优化培养基中，接种量为1％(v/v)；摇床培养处理，摇床培养处理的温度为30℃，摇床培养处理的时间为84小时，摇床培养处理的转速为160rpm，得到培养液，在培养液中，含有奇数碳链脂肪酸含量提高的微生物(浑浊红球菌)；
(4)将步骤(3)所述培养液进行离心处理，离心处理的离心速率为6000rpm，离心处理的时间为3min，取沉淀，用PBS缓冲液洗涤，冻干得到冻干菌粉；
(5)将步骤(4)所述冻干菌粉(0.08g)与2mL盐酸溶液(3mol/L)混合，水浴加热处理，水浴加热处理的温度为80℃，水浴加热处理的时间为30min，萃取，干燥得到油脂类混合物；测试油脂类混合物，称重计算含油量；
(6)全样脂肪酸测定
取步骤(5)所述油脂类混合物0.02g，将油脂类混合物加入2mL正己烷中溶解，搅拌均匀，然后在加入2mL氢氧化钠的甲醇溶液(0.5mol/L)，在60℃条件下水浴20min，完成甲酯化反应，取上清液(正己烷)用气相色谱法分析脂肪酸组成。气相色谱法的条件：色谱柱选用HP-5，柱温箱的温度为180℃，进样口的温度为190℃，检测器的温度为270℃。得出结果图，根据峰的保留时间判定脂肪酸种类。
实施例2
实施例2提供的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将菌种(浑浊红球菌)接种至活化培养基(LB培养基)中，摇床培养处理，摇床培养处理的温度为30℃，摇床培养处理的时间为24h，摇床培养处理的转速为160rpm，得到活化的菌种；
(2)配制优化培养基
按照表1的配制培养基，但在表1的基础上丙醇加入培养基中，丙醇的质量为培养基质量的0.5％，混合均匀，灭菌处理(在121℃条件下进行灭菌处理，灭菌处理时间为12min)，得到优化培养基；
(3)将步骤(1)所述活化的菌种接种到步骤(2)所述优化培养基中，接种量为1％(v/v)；摇床培养处理，摇床培养处理的温度为30℃，摇床培养处理的时间为84小时，摇床培养处理的转速为160rpm，得到培养液，在培养液中，含有奇数碳链脂肪酸含量提高的微生物(浑浊红球菌)；
(4)将步骤(3)所述培养液进行离心处理，离心处理的离心速率为6000rpm，离心处理的时间为3min，取沉淀，用PBS缓冲液洗涤，冻干得到冻干菌粉；
(5)将步骤(4)所述冻干菌粉(0.08g)与2ml盐酸溶液(3mol/L)混合，水浴加热处理，水浴加热处理的温度为100摄氏度，水浴加热处理的时间为5min，萃取，干燥得到油脂类混合物；测试油脂类混合物，称重计算含油量；
(6)全样脂肪酸测定
取步骤(5)所述油脂类混合物0.02g，将油脂类混合物加入2mL正己烷中溶解，搅拌均匀，然后在加入2mL氢氧化钠的甲醇溶液(0.5mol/L)，在60℃条件下水浴20min，完成甲酯化反应，取上清液(正己烷)用气相色谱法分析脂肪酸组成。气相色谱法的条件：色谱柱选用HP-5，柱温箱的温度为180℃，进样口的温度为190℃，检测器的温度为270℃。得出结果图，根据峰的保留时间判定脂肪酸种类。
实施例3
实施例3提供的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将菌种(浑浊红球菌)接种至活化培养基(LB培养基)中，摇床培养处理，摇床培养处理的温度为20摄氏度，摇床培养处理的时间为48h，摇床培养处理的转速为80rpm，得到活化的菌种；
(2)配制优化培养基
按照表1的配制培养基，但在表1的基础上将有机醇(实施例3所使用的有机醇为戊醇)加入培养基中，有机醇的质量为培养基质量的1％，混合均匀，灭菌处理(在121℃条件下进行灭菌处理，灭菌处理时间为12min)，得到优化培养基；
(3)将步骤(1)所述活化的菌种接种到步骤(2)所述优化培养基中，接种量为0.1％；摇床培养处理，摇床培养处理的温度为20摄氏度，摇床培养处理的时间为168小时，摇床培养处理的转速为80rpm，得到培养液，在培养液中，含有奇数碳链脂肪酸含量提高的微生物(浑浊红球菌)；
(4)将步骤(3)所述培养液进行离心处理，离心处理的离心速率为10000rpm，离心处理的时间为30s，取沉淀，用PBS缓冲液洗涤，冻干得到冻干菌粉；
(5)将步骤(4)所述冻干菌粉0.02g与2mL盐酸溶液(3mol/L)混合，水浴加热处理，水浴加热处理的温度为60摄氏度，水浴加热处理的时间为120min，萃取，干燥得到油脂类混合物；测试油脂类混合物，称重计算含油量；
(6)全样脂肪酸测定
取步骤(5)所述油脂类混合物0.02g，将油脂类混合物加入2mL正己烷中溶解，搅拌均匀，然后在加入2mL氢氧化钠的甲醇溶液(0.5mol/L)，在60℃条件下水浴20min，完成甲酯化反应，取上清液(正己烷)用气相色谱法分析脂肪酸组成。气相色谱法的条件：色谱柱选用HP-5，柱温箱的温度为180℃，进样口的温度为190℃，检测器的温度为270℃。得出结果图，根据峰的保留时间判定脂肪酸种类。
实施例4
实施例4提供的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将菌种(浑浊红球菌)接种至活化培养基(LB培养基)中，摇床培养处理，摇床培养处理的温度为37摄氏度，摇床培养处理的时间为12h，摇床培养处理的转速为250rpm，得到活化的菌种；
(2)配制优化培养基
按照表1的配制培养基，但在表1的基础上将有机醇(实施例4所使用的是庚醇)加入培养基中，有机醇的质量为培养基质量的1.5％(w/w)，混合均匀，灭菌处理(在121℃条件下进行灭菌处理，灭菌处理时间为12min)，得到优化培养基；
(3)将步骤(1)所述活化的菌种接种到步骤(2)所述优化培养基中，接种量为10％(v/v)；摇床培养处理，摇床培养处理的温度为37摄氏度，摇床培养处理的时间为48小时，摇床培养处理的转速为250rpm，得到培养液，在培养液中，含有奇数碳链脂肪酸含量提高的微生物(浑浊红球菌)；
(4)将步骤(3)所述培养液进行离心处理，离心处理的离心速率为4000rpm，离心处理的时间为10min，取沉淀，用PBS缓冲液洗涤，冻干得到冻干菌粉；
(5)将步骤(4)所述冻干菌粉(0.08g)与2mL盐酸溶液(浓度为3mol/L)混合，水浴加热处理，水浴加热处理的温度为100摄氏度，水浴加热处理的时间为5min，萃取，干燥得到油脂类混合物；测试油脂类混合物，称重计算含油量。
(6)全样脂肪酸测定
取步骤(5)所述油脂类混合物0.02g，将油脂类混合物加入2mL正己烷中溶解，搅拌均匀，然后在加入2mL氢氧化钠的甲醇溶液(0.5mol/L)，在60℃条件下水浴20min，完成甲酯化反应，取上清液(正己烷)用气相色谱法分析脂肪酸组成。气相色谱法的条件：色谱柱选用HP-5，柱温箱的温度为180℃，进样口的温度为190℃，检测器的温度为270℃。得出结果图，根据峰的保留时间判定脂肪酸种类。
对比例与实施例的油脂测试结果如下表2所示，表2为对比例及实施例微生物油脂中主要脂肪酸组成的数据表。
表2
脂肪酸 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
C13:0 0.28 0.22 1.26 1.13 1.14 0.30 1.25 2.39 1.87
C15:0 7.24 8.92 26.93 31.68 31.52 9.74 29.64 38.80 34.87
C15:1 0.24 0.47 1.93 3.33 3.42 0.59 2.88 2.41 2.24
C16:0 31.76 27.79 11.73 5.63 6.22 26.66 10.19 6.99 8.08
C16:1 10.54 9.24 3.47 2.42 2.76 7.86 3.32 1.97 2.73
C17:0 9.01 8.83 15.45 13.15 12.91 11.13 12.61 17.95 15.56
C17:1 13.78 17.65 25.36 30.35 28.67 15.31 25.53 23.95 26.19
C18:1 16.27 16.38 3.88 1.40 1.56 16.57 4.51 1.06 1.29
OCFAs 30.03 35.40 67.73 75.18 73.10 36.18 67.78 80.69 76.62
C15:0+C17:0 16.24 17.75 42.37 44.83 44.43 20.87 42.25 56.75 50.43
由表2可以看出对比例1中奇数碳链脂肪酸(OCFAs)含量仅为30％(w/w)。向培养基中添加0.5％(w/w)、1.0％(w/w)、1.5％(w/w)、2％(w/w)的丙酸钠后，OCFAs含量(w/w)分别提高至35.40％、67.73％、75.18％、73.10％。向培养基中添加0.3％、0.5％、1.0％、1.5％的丙醇(w/w)后，OCFAs含量(w/w)分别提高至36.18％、67.78％、80.69％、76.62％。显然，丙醇的效果优于丙酸钠。
由图1可以清楚的看出对比例1中棕榈酸和油酸含量非常高，添加0.5％和1.5％的丙醇后(实施例2和实施例4)棕榈酸含量和油酸含量急剧下降，而十五酸、十七酸、十七一烯酸含量大幅度提高。
由图2可以看出对比例6，添加2％的丙醇生物量大幅度下降，由平均约3.5g/L下降至0.6g/L。由图3可以看出实施例和对比例含油量在约40％，而对比例6，添加2％的丙醇含油量降低至18％。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化
将微生物接种至活化培养基中，摇床培养处理，得到活化的菌种，所述微生物为浑浊红球菌；
（2）配制优化培养基
将有机醇加入基本培养基中，混合均匀，灭菌处理，得到优化培养基，所述有机醇为戊醇，所述有机醇的添加量为基本培养基质量的1%，所述基本培养基的成分为12g/L葡萄糖、1.5g/L KH2PO4、9g/L Na2HPO4·12H2O、1.0g/L NH4Cl、0.5g/L MgSO4·7H2O、20mg/L CaCl2·2H2O、2mg/L Na2MoO4·2H2O、5mg/L FeNaEDTA·3H2O、0.2mg/L CoCl2·6H2O、0.1mg/LZnSO4·7H2O、0.05mg/L MnCl2·4H2O、0.3mg/L H3BO3、0.1mg/L CuCl2·2H2O、0.2mg/LNiCl2·6H2O；
（3）将步骤（1）所述活化的菌种接种到步骤（2）所述优化培养基中，摇床培养处理，所述接种的接种量为0.1%。
2.根据权利要求1所述的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤（1）所述微生物为产油微生物。
3.根据权利要求1所述的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化培养基包括肉汤培养基及LB培养基。
4.根据权利要求1所述的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤（1）所述摇床培养处理的温度为20-37摄氏度，摇床培养处理的转速为80-250 rpm，摇床培养处理的时间为12-48 h。
5.根据权利要求1所述的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤（2）所述基本培养基的碳氮比不小于10。
6.根据权利要求1所述的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤（2）所述灭菌处理的方式包括高温高压灭菌及低温灭菌。
7.根据权利要求1所述的提高微生物油脂中奇数碳链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤（3）所述摇床培养处理的温度为20-37摄氏度，摇床培养处理的时间为48-168 h，摇床培养处理的转速为80-250 rpm。
CN201910442602.5A 2019-05-25 2019-05-25 一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法 Active CN110129400B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910442602.5A CN110129400B (zh) 2019-05-25 2019-05-25 一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910442602.5A CN110129400B (zh) 2019-05-25 2019-05-25 一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110129400A CN110129400A (zh) 2019-08-16
CN110129400B true CN110129400B (zh) 2023-09-01

Family

ID=67581656

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910442602.5A Active CN110129400B (zh) 2019-05-25 2019-05-25 一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110129400B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114854800B (zh) * 2022-04-28 2024-03-29 南京师范大学 提高产油微生物的油脂产量的方法和微生物油脂的制备方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06113868A (ja) * 1992-09-30 1994-04-26 Agency Of Ind Science & Technol シュードモナス属細菌によるシクロプロパン脂肪酸の製造方法
CN1703515A (zh) * 2002-10-10 2005-11-30 株式会社钟化 共聚合聚酯的生产方法
CN1888020A (zh) * 2006-07-14 2007-01-03 清华大学 微生物细胞催化脂肪酸及含酸油脂生产生物柴油的方法
WO2009115221A1 (en) * 2008-03-18 2009-09-24 Hexion Specialty Chemicals Research Belgium S.A. Composition for low colour of unsaturated glycidyl esters derivatives and the use thereof
TW201207116A (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Univ Fu Jen Catholic A method for producing oil by Cystofilobasidium spp.
CN103906845A (zh) * 2010-09-15 2014-07-02 Ls9公司 在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物
CN105154481A (zh) * 2006-08-01 2015-12-16 帝斯曼营养品股份公司 产油微生物及改良这些微生物的方法
TW201639557A (zh) * 2015-01-07 2016-11-16 美國海軍部 用於診斷及治療代謝症候群的組合物及方法
CN106916856A (zh) * 2015-12-28 2017-07-04 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 提高产脂微生物生产奇数碳脂肪酸产量的培养基及方法
CN107446944A (zh) * 2016-06-01 2017-12-08 华东理工大学 提高红霉素生产菌的碳源利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140193867A1 (en) * 2012-12-21 2014-07-10 William Marsh Rice University Microbial odd chain fatty acids

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06113868A (ja) * 1992-09-30 1994-04-26 Agency Of Ind Science & Technol シュードモナス属細菌によるシクロプロパン脂肪酸の製造方法
CN1703515A (zh) * 2002-10-10 2005-11-30 株式会社钟化 共聚合聚酯的生产方法
CN1888020A (zh) * 2006-07-14 2007-01-03 清华大学 微生物细胞催化脂肪酸及含酸油脂生产生物柴油的方法
CN105154481A (zh) * 2006-08-01 2015-12-16 帝斯曼营养品股份公司 产油微生物及改良这些微生物的方法
WO2009115221A1 (en) * 2008-03-18 2009-09-24 Hexion Specialty Chemicals Research Belgium S.A. Composition for low colour of unsaturated glycidyl esters derivatives and the use thereof
TW201207116A (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Univ Fu Jen Catholic A method for producing oil by Cystofilobasidium spp.
CN103906845A (zh) * 2010-09-15 2014-07-02 Ls9公司 在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物
TW201639557A (zh) * 2015-01-07 2016-11-16 美國海軍部 用於診斷及治療代謝症候群的組合物及方法
CN106916856A (zh) * 2015-12-28 2017-07-04 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 提高产脂微生物生产奇数碳脂肪酸产量的培养基及方法
CN107446944A (zh) * 2016-06-01 2017-12-08 华东理工大学 提高红霉素生产菌的碳源利用率和转化效率从而改进红霉素合成效率的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Optimization of odd chain fatty acid production by Yarrowia lipolytica;Young‑Kyoung Park;《Biotechnology for Biofuels》;20181231;第11卷(第158期);第1-12页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110129400A (zh) 2019-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Revin et al. Cost-effective production of bacterial cellulose using acidic food industry by-products
Řezanka et al. Odd-numbered very-long-chain fatty acids from the microbial, animal and plant kingdoms
Nakashima et al. The alga Euglena gracilis stimulates Faecalibacterium in the gut and contributes to increased defecation
KR20190127572A (ko) 저당도 과채 효소액의 제조 방법
CN102702372B (zh) 一种嗜热链球菌胞外多糖及其制备和检测方法
CN110129400B (zh) 一种提高微生物油脂奇数碳链脂肪酸含量的方法
CN108330083A (zh) 一株嗜热链球菌及在生产搅拌型酸奶中的应用
CN110184311B (zh) 一种使用微生物发酵生产特种油脂opo的方法
Matsui et al. Paramylon production by Euglena gracilis via mixotrophic cultivation using sewage effluent and waste organic compounds
CN111560447A (zh) 一种评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法
CN113621665B (zh) 一种植物乳杆菌酸性胞外多糖及其应用
JP2010241945A (ja) リポ多糖、イネ発酵エキス及びイネ発酵エキス配合物
CN104231106B (zh) 一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用
CN113698503A (zh) 一种植物乳杆菌中性胞外多糖及其应用
Hull et al. Co-production of bioethanol and probiotic yeast biomass from agricultural feedstock: application of the rural biorefinery concept
Boyko et al. Structural and functional peculiarities of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense SR55, isolated from the roots of Triticum durum
Sinzinger et al. Towards a cyanobacterial biorefinery: Carbohydrate fingerprint, biocomposition and enzymatic hydrolysis of Nostoc biomass
Yevstigneyeva et al. Structural properties of capsular and O-specific polysaccharides of Azospirillum brasilense Sp245 under varying cultivation conditions
Sigida et al. Characterization of the lipopolysaccharides of serogroup II Azospirillum strains
JP5137204B2 (ja) マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法
CN113801798B (zh) 食腺嘌呤节孢酵母a50菌株、所产胞外多糖及其应用
CN113372463B (zh) 一种从蒸馏米酒蒸馏残液中提取益生功能糖的方法
Woldie Characterization of dairy waste whey and its’ utilization for the production of ethanol
CN117417869B (zh) 一株约氏黄杆菌w24h及其生产2,3-丁二醇的应用
Martins The biorefinery of the heterotrophic marine microalga Crypthecodinium cohnii grown on low-cost substrates: Production of DHA and biodiesel

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant