CN101255413A - 一种产红霉素c的糖多孢红霉菌突变体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，利用染色体同源重组的性质，将糖多孢红霉菌染色体上红霉素3″－O－甲基转移酶编码基因eryG起始密码子下游的343－632nt的290bp DNA序列(对应于Genbank Accession No.AM420293序列中的823972－824261nt)删除，利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体，此突变体主要积累中间产物红霉素C，而不再合成红霉素A。

Description

一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体是一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法。

背景技术：

红霉素(erythromycin，Er)是由革兰氏阳性菌糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的次生代谢产物，为一类大环内酯类抗生素，包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)、红霉素D(ErD)等。这四种红霉素均有抑菌活性，但在临床上具有广泛用途的是ErA，它的抑菌活性最高。

红霉素的生物合成分为两大部分：红霉素母核(6-dEB)的合成和6-dEB的后修饰。前者由一分子丙酸和六分子甲基丙二酸在聚酮合成酶(PKS)复合体的催化作用下完成；随后6-dEB在C-6位羟基化酶及在C-3位和C-5位羟基糖基化酶作用下形成了第一个有活性的中间产物ErD；接着，ErD可以先在C-12位羟基化酶EryK作用下形成ErC，再在3″-O-甲基转移酶EryG作用下形成ErA，这是一条主要途径；然而在体内还有另一条次要途径，即ErD先在EryG作用下形成ErB，再在EryK作用下形成ErA。

红霉素生物合成基因以单一拷贝、成簇存在于糖多孢红霉菌染色体上，质粒不参与红霉素的生物合成。糖多孢红霉菌红霉素″-O-甲基转移酶是一种S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的甲基化酶，在降低红霉素的毒性和提高红霉素的活性方面起着重要的作用。

糖多孢红霉菌红霉素3″-O-甲基转移酶eryG基因开放阅读框(ORF)由921对核苷酸组成，编码产物EryG有306个氨基酸。通过比对EryG和其它几种甲基转移酶的氨基酸序列发现在氨基末端都有一个富含甘氨酸(Gly)的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合位点基序，保守区序列为VLE/DXGXGXG。

本研究构建的糖多孢红霉菌A226G^-突变体不再合成ErA，表明删除突变后的eryG基因表达产物不再有甲基转移酶活性。巨大霉素和红霉素A的生物合成有着共同的中间体红霉素C，所以本发明构建的缺失红霉素eryG基因的糖多孢红霉菌A226G^-突变体，不但为进一步深入研究EryG相关的酶学性质奠定了基础，而且也为研究巨大霉素生物合成中红霉素C之后的修饰酶提供了一个系统。

发明内容：

本发明的目的是提供一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，不但为进一步深入研究EryG相关的酶学性质奠定了基础，而且也为研究巨大霉素生物合成中红霉素C之后的修饰酶提供了一个系统。

本发明的技术方案如下：

一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于利用染色体同源重组的性质，将糖多孢红霉菌染色体上红霉素3″-O-甲基转移酶编码基因eryG删除，或将含有EryG S-腺苷甲硫氨酸SAM结合位点对应的DNA序列在内的一DNA片段删除，或对eryG基因插入失活，得到产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体。

所述的一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于所述的删除或插入失活方法是指下列方法之一：(1)先用重叠PCR方法从糖多孢红霉菌基因组中扩增出红霉素3″-O-甲基转移酶编码基因eryG缺失或部分缺失的重叠DNA片段，将其克隆到质粒pWHM3上构建成同源重组质粒，再将此质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组，筛选出eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体，其发酵产物为红霉素C；(2)用PCR方法扩增出红霉素eryG基因部分DNA片段，将其克隆到质粒pWHM3上，构建成同源重组质粒，将此质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其经染色体同源重组插入到eryG基因上，从而使其蛋白产物EryG失活，得到产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体；(3)用限制酶酶切的方法从糖多孢红霉菌基因组文库中将红霉素eryG基因的部分DNA片段亚克隆到质粒pWHM3上，构建成同源重组质粒，将质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其经染色体同源重组插入到eryG基因上，从而使其蛋白产物EryG失活，得到产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体；(4)先用PCR方法从糖多孢红霉菌基因组中扩增出红霉素eryG基因全部或部分DNA片段，将其克隆到质粒pWHM3上，接着将选择标记基因(如抗性基因)克隆到质粒pWHM3插入片段中间的合适位置上，构建成同源重组质粒，将质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组，筛选出eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体，其发酵产物为红霉素C。

所述的一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于具体做法是：用重叠PCR方法从糖多孢红霉菌基因组中扩增出缺失eryG基因起始密码子下游343-632nt的同源DNA片段ΔG，将其克隆到同源重组质粒pWHM3上，构建了pWHMΔG。将pWHMΔG质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其与染色体发生同源重组，筛选出eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体。

以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版，用重叠PCR方法扩增出去除EryGS-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合位点DNA序列在内290bp的约1600bp DNA片段，克隆于同源重组质粒pWHM3，构建了同源重组质粒pWHMΔG。PEG介导原生质体转化法将pWHMΔG转入糖多孢红霉菌A226，通过同源重组整合到红霉素合成基因位点上。整合体在无抗R3M斜面培养基上连续生长三代后，制备原生质体涂R3M平板。利用薄层层析(TLC)，PCR和质谱(MS)方法筛选出一株eryG基因失活的糖多孢红霉菌A226G^-突变体，此A226G^-突变体只能积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过引入正常eryG基因表达质粒可恢复A226G^-突变体红霉素A的合成能力，但产量比出发菌株A226要低。

附图说明

图1pWHMΔG质粒的酶切验证

1：DNAMarker 15000；

2：pWHMΔG质粒Eco R I和Hind III酶切产物

图2整合体I和II的PCR验证

1：DNAMarker 2000；

2：整合体I的tsr基因PCR产物；

3：整合体II的tsr基因PCR产物

图3整合体I和II中质粒整合位点的确定

1：红霉素A(ErA)标准品；

2：糖多孢红霉菌A226发酵液；

3：整合体I发酵液；

4：整合体II发酵液

图4糖多孢红霉菌A226G突变体的TLC鉴定

1：红霉素A(ErA)标准品；

2：糖多孢红霉菌A226发酵液；

3：A226G^-突变体发酵液；

4：整合体I发酵液

图5A226G^-突变体的PCR验证

1：DNAMarker2000；

2：A226G^-突变体的eryG的PCR产物；

3：A226野生菌的eryG的PCR产物

图6A226G^-突变体发酵产物的MS鉴定

1：720.17为[ErC]H⁺；

2：702.17为[ErC-H₂O]H⁺

图7pZMWG质粒的酶切验证

1：DNAMarker 15000；

2：pZMWG质粒Nde I和Eco R V酶切产物

图8互补测验

1：红霉素A(ErA)标准品；

2：糖多孢红霉菌A226发酵液；

3：工程菌A226G^-G⁺发酵液；

4：整合体I发酵液

具体实施方式：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种和质粒

糖多孢红霉菌A226、大肠杆菌ET12567、同源重组质粒pWHM3、糖多孢红霉菌染色体整合型表达载体pZMW、大肠杆菌DH5α、克隆质粒pUC18为本室保存；质粒pUCΔG、pWHMΔG、糖多孢红霉菌突变体A226G^-、质粒pZMWG、糖多孢红霉菌工程菌A226G^-G⁺为本研究构建。

1.1.2培养基、缓冲液和试剂

LB培养基、TSB培养基、R3M培养基、PEG3350-T缓冲液和改进P缓冲液。

硫链丝菌肽(Thiostrepton，Tsr)、氨朴霉素(Apramycin，Am)、PEG3350为Sigma公司产品，溶菌酶为Fluka公司产品，蛋白酶K为AMRESCO公司产品，TSB为DIFCO公司产品，限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA Marker(DL 2000和DL 15000)为大连宝生物公司产品，RNaseA、dNTP、pfu和TaqDNA聚合酶为上海生工公司产品，质粒提取试剂盒和PCR产物回收试剂盒为道普生物科技(北京)有限公司产品，其它试剂为分析纯。

1.2方法

1.2.1大肠杆菌的培养、感受态细胞的制备、质粒的酶切、连接、转化；质粒提取、PCR产物纯化按道普生物科技(北京)有限公司产品说明书进行

1.2.2糖多孢红霉菌A226的培养和基因组DNA的提取

1.2.3ΔG DNA片段重叠PCR引物的设计

为删除糖多孢红霉菌染色体上红霉素″-O-甲基转移酶编码基因(eryG)中间部分290bp DNA序列(对应于Genbank Accession No.AM420293序列中的823972-824261nt)，在删除位点两侧各扩增一段同源片段。为了两同源片段间进行重叠PCR扩增，上游片段Fra1的反向引物和下游片段Fra2的正向引物完全互补，这样经重叠PCR扩增的DNA片段不含SAM结合位点DNA在内的290bp DNA片段(相对于eryG基因起始密码子下游的343-632nt)。

上游片段Fra1：

P11：5’-accGAATTCtgtacaacctggcggtccggcacg(大写字母表示Eco R I识别位点)，

P12：5’-ctccaccgggatgccgccggacagcggtcaggtcgacgccgacgatcctggcc

下游片段Fra2：

P21：5’-ggccaggatcgtcggcgtcgacctgaccgctgtccggcggcatcccggtggag，

P22：5’-gaAAGCTTgggcaccgccggcgagatcg(大写字母表示Hind III识别位点)

1.2.4糖多孢红霉菌红霉素eryG基因PCR引物的设计

根据GenBank公布的糖多孢红霉菌红霉素eryG基因序列(GenbankAccession No.AM420293)，设计并合成了1对引物：

上游引物P1：5′-cggCATATGagcgtgaagcagaagtcagc(大写字母表示Nde I识别位点)

下游引物P2：5′-gtgAAGCTTGATATCtacgcgccgggcttg(大写字母表示HindIII和Eco RV识别位点)

1.2.5ΔG DNA片段和eryG基因片段的PCR扩增

1.2.6糖多孢红霉菌A226原生质体的制备和转化

1.2.7糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I和II及糖多孢红霉菌A226G^-突变体的筛选

1.2.8A226::pWHMΔG整合体I和II及A226G^-突变体发酵液中红霉素成分的薄层层析(TLC)分析

1.2.9A226::pWHMΔG整合体I和II的PCR鉴定

1.2.10A226G^-突变体PCR鉴定的引物序列设计按1.2.4节中设计的引物序列

1.2.11A226G^-突变体发酵液中红霉素成分的质谱(MS)分析

2结果与分析

2.1同源重组质粒pWHMΔG的构建

以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，PCR先扩增出上游片段Fra1和下游片段Fra2，再以Fra1和Fra2为模版、P11和P22为引物，用重叠PCR扩增出全长约1600bp的DNA片段ΔG，克隆到pUC18载体上构建了质粒pUCΔG。序列分析表明，所克隆的ΔG DNA片段序列与GenBank公布的序列完全一致(预期的290bp DNA片段已被删除)。

pWHM3质粒为穿梭型质粒，在糖多孢红霉菌中不能稳定存在，故可作为糖多孢红霉菌的同源重组质粒。pUCΔG质粒中外源DNA用Eco R I和Hind III酶切后连于pWHM3质粒相应酶切位点，转化大肠杆菌DH5α获得了pWHMΔG质粒(图1)。

为避免糖多孢红霉菌对外源基因甲基化特异的限制性作用，将pWHMΔG质粒转化大肠杆菌ET12567，得到了无甲基化修饰的pWHMΔG质粒。

2.2糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I和II的筛选

将糖多孢红霉菌A226制成原生质体，用pWHMΔG质粒转化，在含30μg/mLTsr的R3M固体培养基上进行筛选。因pWHMΔG质粒在糖多孢红霉菌中不能复制，只有整合到染色体上才能赋予菌体Tsr抗性。从转化平皿中挑取110个单菌落涂含30μg/mL Tsr的R3M斜面，有2个菌落可正常生长，分别命名为A226::pWHMΔG整合体I和II。提取整合体I和II基因组DNA做模板，PCR扩增pWHMΔG质粒上Tsr抗性基因tsr进行鉴定。1.2％琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物位于768bp附近(图2)，表明pWHMΔG质粒已整合到A226的染色体上。

2.3整合体I和II中质粒整合位点的确定

糖多孢红霉菌红霉素生物合成基因在染色体上以单一拷贝、成簇形式存在，其中eryA I、eryA II、eryA III、eryC II、eryC III、eryB II和eryG为一条多顺反子，共同受到eryAI启动子的控制。若pWHMΔG质粒与A226染色体在同源片段Fra1内发生同源重组，那么eryG基因的表达将会受到阻断，整合体发酵液就会积累红霉素A生物合成的中间产物红霉素C；若在同源片段Fra2内发生同源重组，那么eryG基因的表达将不会受到影响，整合体仍然可以合成红霉素A。

为了确定pWHMΔG质粒的整合位置，提取整合体I和II发酵液中的红霉素做薄层层析(TLC)，TLC结果显示整合体I是在同源片段Fra1内发生同源重组的，而整合体II是在同源片段Fra2内发生同源重组的(图3)。

在整合体I红霉素发酵液中仍有少量的红霉素A，说明即使是在同源片段Fra1内发生同源重组也没有完全阻断eryG基因的表达，这暗示着eryG基因可能有单独的启动子。

2.4糖多孢红霉菌A226G^-突变体的筛选

质粒pWHMΔG在染色体上不稳定，在无抗生素选择压力时会自动经染色体二次重组脱落。若第二次重组与第一次重组发生在同一同源片段内，质粒脱落后染色体会回复到质粒整合前状态，菌株恢复红霉素A合成能力；若第二次重组与第一次重组发生在不同的同源片段内，质粒脱落后eryG基因DNA序列中预期的290bp DNA片段会发生删除突变，突变株将失去红霉素A合成能力，发酵液中会有红霉素C的积累。

糖多孢红霉菌A226::pWHMΔG整合体I在无Tsr的R3M斜面上连续传三代后，将制得的原生质体不同浓度稀释液涂无Tsr的R3M平皿。从平皿中挑取约1000个单菌落，各连续涂含30μg/mL Tsr的R3M斜面和无Tsr的R3M斜面，其中有5个菌落仅可以在无Tsr的R3M斜面上生长。提取这5个克隆的红霉素做TLC，结果表明只有4号克隆仅可以积累红霉素C，此克隆命名为A226G^-(图4)。其余4个克隆都为回复突变。

将A226G^-突变体进行液体培养，提取基因组DNA，以eryG基因上游引物P1和下游引物P2进行PCR扩增，与野生菌基因组的PCR产物相比较，A226G^-突变体的PCR产物已发生删除突变(图5)。对PCR产物直接进行序列分析也表明此突变株eryG基因中间部分预期的290bp已被删除。

2.5糖多孢红霉菌A226G^-突变体发酵产物的质谱(MS)鉴定

将糖多孢红霉菌A226G^-突变体的50mL发酵液用乙酸乙酯萃取，水浴浓缩后用质谱仪检测A226G^-突变体发酵液的红霉素成分。MS鉴定结果显示A226G^-突变体发酵液中仅积累红霉素C，而且也没有检测到上一步中间产物红霉素D(图6)，说明糖多孢红霉菌红霉素C-12位羟基化酶EryK可以完全把其底物红霉素D转化成红霉素C。

2.6A226G^-突变体中eryG基因的功能补偿

2.6.1糖多孢红霉菌表达质粒pZMWG的构建

以糖多孢红霉菌A226总DNA为模板，上游引物P1和下游引物P2进行PCR扩增出eryG基因，克隆到pUC18载体上构建了质粒pUCG。序列分析表明，所克隆的eryG片段序列与GenBank公布的序列完全一致。

将pUCG中的eryG DNA片段亚克隆至糖多孢红霉菌表达载体pZMW中，构建了质粒pZMWG。Nde I和Eco RV酶切pZMWG质粒后获得预期大小的两个片段(图7)。

2.6.2互补测验

将糖多孢红霉菌突变体A226G^-制成原生质体，用pZMWG质粒转化，在含125μg/mLAm的R3M固体培养基上进行筛选。从转化平皿中挑取6个单菌落涂含125μg/mL Am的R3M斜面，这6个克隆均可正常生长，命名为A226G^-G⁺I、II、III、IV、V、VI。接种A226G^-G⁺I和A226于100mL TSB培养基/500mL三角烧瓶，30℃振荡培养96h，提取红霉素，TLC结果显示A226G^-G⁺I恢复了红霉素A的生产能力，但产量比野生菌A226要低(图8)。

Claims (3)

1. 一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于利用染色体同源重组的性质，将糖多孢红霉菌染色体上红霉素3″-O-甲基转移酶编码基因eryG删除，或将含有EryG S-腺苷甲硫氨酸SAM结合位点对应的DNA序列在内的染色体片段删除，或对eryG基因插入失活，得到产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体。

2. 根据权利要求1所述的一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于所述的删除或插入失活方法是指下列方法之一：(1)先用重叠PCR方法从糖多孢红霉菌基因组中扩增出红霉素3″-O-甲基转移酶编码基因eryG缺失或部分缺失的重叠DNA片段，将其克隆到质粒pWHM3上构建成同源重组质粒，再将此质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组，筛选出eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体，其发酵主要产物为红霉素C；(2)用PCR方法扩增出红霉素eryG基因部分DNA片段，将其克隆到质粒pWHM3上，构建成同源重组质粒，将此质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其经染色体同源重组插入到eryG基因上，从而使其蛋白产物EryG失活，得到产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体；(3)用限制酶酶切的方法从糖多孢红霉菌基因组文库中将红霉素eryG基因的部分DNA片段亚克隆到质粒pWHM3上，构建成同源重组质粒，将质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其经染色体同源重组插入到eryG基因上，从而使其蛋白产物EryG失活，得到产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体；(4)先用PCR方法从糖多孢红霉菌基因组中扩增出红霉素eryG基因全部或部分DNA片段，将其克隆到质粒pWHM3上，接着将选择标记基因(如抗性基因)克隆到质粒pWHM3插入片段中间的合适位置上，构建成同源重组质粒，将质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组，筛选出eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体，其发酵产物为红霉素C。

3. 根据权利要求2所述的一种产红霉素C的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于具体做法是：用重叠PCR方法从糖多孢红霉菌基因组中扩增出缺失eryG基因起始密码子下游343-632nt的同源DNA片段ΔG，将其克隆到同源重组质粒pWHM3上，构建了pWHMΔG。将pWHMΔG质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其与染色体发生同源重组，筛选出eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体。

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