KR101542243B1 - 이소발레릴 스피라마이신 ｉ을 생산하는 유전학적으로 공학처리된 균주 ｗｓｊ­ｉａ - Google Patents

이소발레릴 스피라마이신 ｉ을 생산하는 유전학적으로 공학처리된 균주 ｗｓｊ­ｉａ Download PDF

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Abstract

본 발명은 이소발레릴 스피라마이신 I을 생산하기 위해 유전학적으로 공학처리된 균주 WSJ-IA에 관한 것이다. 또한, a) 이중 유전자 ist-acyB2를 포함하는 재조합 플라스미드를 작제하는 단계; b) 상기 플라스미드로 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 균주를 형질전환시켜 균주 WSI-IA를 수득하는 단계를 포함하여, 균주를 제조하는 방법이 제공된다. 균주 WSI-IA의 발효에 의해 생산된 이소발레릴 스피라마이신 I의 수준은 단일 유전자 ist만을 포함하는 균주에 비해 1.7배 증가되었고 이의 발효 효능은 4.14배 증가되었다.

Description

이소발레릴 스피라마이신 Ｉ을 생산하는 유전학적으로 공학처리된 균주 ＷＳＪ­ＩＡ{GENETICALLY ENGINEERED STRAIN WSJ-IA FOR PRODUCING ISOVALERYL SPIRAMYCIN I}
본 발명은 유전자 조절 기법으로 작제함에 의해 고함량 및 고수율의 단일 성분 항생제를 생산하는 박테리아 균주의 획득을 포함한다.
비테스피라마이신(Bitespiramycin) (원시명: 셍지마이신(Shengjimycin)) [특허번호: ZL97104440.6]은 스피라마이신 분자에서 마이카로스 모이어티의 4"-위치 히드록실기의 이소발레릴화에 의해 형성된 스피라마이신의 유도체이다. 이것은 유전자 공학처리 기법을 이용하여 생산되어 내열성 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 이소발레릴 스피라마이신 유전자 ist 및 스피라마이신 간의 박테리아 유전체 조합을 일으킨다. 비테스피라마이신은 그램-양성 박테리아, 특히 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia) 및 클라미디아(chlamydia)에 대해 비교적 강한 활성을 지니고, 인플루엔자 바실러스(influenza bacillus), 레지오넬라(Legionella), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)와 같은 에리트로마이신- 및 β-락탐 항생제-내성 박테리아에 대해 항박테리아 활성을 나타내며; 유사한 약물과 완전한 교차-내성을 나타내지 않는다. 비테스피라마이신은 비교적 높은 지방친화도(lipophicity)를 갖고, 조직으로의 강한 투과성 및 체내 광범위한 분포 및 긴 유지 시간을 가지며 경구 흡수율이 빠르다. 따라서, 이것은 양호한 항생제 투여 후 효과(post-antibiotic effect)를 나타낸다. 유전자 공학처리 기법으로 생산된 비테스피라마이신에 대한 III상 임상 시험이 종료되었고, 그 결과 양호한 치료 효과 및 안전성이 입증되었다. 클래스 I 신규 약물 증명을 위한 신청이 본 약물에 대해 제출되었다.
임상 연구는 비테스피라마이신이 안전하고 효과적인 항생제임을 나타낸다. 이의 치료 효과는 현재 최선의 매크롤리드로서 일반적으로 허용된 항생제 아지트로마이신에 상당한다. 그럼에도 불구하고, 비테스피라마이신이 다-성분 약물이라는 사실로 인해, 제어할 수 있는 성분 비율 및 안정한 품질로 생산물을 수득할 수 있는 정제 생산 과정을 확립하기 위한 모든 노력에 있어서, 추출뿐 아니라 정제 과정의 제어에 대한 요구는 여전히 비교적 엄격하고, 품질 검사 과정은 복잡하다. 한편, 이의 치료 효과를 향상시키기 위해, 주사 제형을 개발할 필요가 있다. 주사는 치료 효과를 매우 신속하게 초래하고, 위독한 환자 또는 약물을 경구 섭취하기에 적합하지 않은 환자에게 특히 적용될 수 있는 것이 널리 알려져 있다. 주사는 품질 제어의 관점에서 더욱 요구될 것이 확실하다.
상응하는 박테리아에 의한 다-성분 비테스피라마이신의 생산은 스피라마이신의 다-성분 특징으로부터 초래된다. 플라테노마이신의 상동성으로 인해, 이것은 주요 핵이 16-원 락톤 고리인 매크롤리드 항생제이다. 이것은 세 개의 당 분자인 포로사민, 마이카미노스 및 마이카로스를 함유하는 한편, 비테스피라마이신의 주요 성분은 스피라마이신 분자에서 마이카로스 모이어티의 4"-위치에서의 히드록실기의 이소발레릴화 유도체이다. 스피라마이신을 생산하는 박테리아에서 아실트랜스퍼라제 유전자의 존재로 인해, 스피라마이신 분자에서의 락톤 고리의 3-위치가 아세틸화되어 스피라마이신 성분 II를 형성할 수 있고; 프로피오닐화되어 스피라마이신 성분 III을 형성할 수 있으며; 락톤 고리의 3-위치가 탈아실화될 때, 스피라마이신 성분 I이 형성된다. 따라서, 비테스피라마이신은 또한 이소발레릴 스피라마이신 I, II, III의 적어도 세 개의 성분들의 혼합물이다. 비테스피라마이신의 세 개의 주요 성분의 구조는 다음과 같다:
Figure 112013015717368-pct00001
상기 식에서,
Figure 112013015717368-pct00002
연구 결과, 이소발레릴 스피라마이신 I, II 및 III의 단일 성분들은 모두 항생제 활성을 지녔고, 이들의 활성 간에 유의적 차이는 없는 것으로 나타났다[특허출원번호: 201010119745.1]. 비테스피라마이신에 대해 설정된 현재 품질 표준에 따르면, 이소발레릴 스피라마이신 (I+II+III)의 함량은 60% 이상이어야 한다. 따라서, 단일 성분 (60%보다 높은 함량)은 다-성분 혼합물을 대신하도록 이용될 수 있다. 다-성분의 생산을 감소시키기 위해, 이러한 실험에서는 비테스피라마이신 발생 박테리아 WSJ-1에서 유전자 재조합 기법을 이용하여 3-O-아실 트랜스퍼라제 유전자를 차단시킴에 의해 박테리아 균주 WSJ-2를 작제하였다. WSJ-2는 이소발레릴 스피라마이신 I만을 생산하였다[Chunyan Ma et al. Current Microbiology, 2011, 62:16-20]. 그러나, 이러한 균주는 매우 낮은 발효 유닛(fermentation unit)을 나타내었으므로, 대규모 생산에 도움이 되지 않았다. 본 발명의 목적은 유전자 acyB2를 조절하여 WSJ-2 균주를 변형시킴으로써 단일 성분 이소발레릴 스피라마이신 I의 수율 및 혼합물에서의 이의 함량을 증가시키는 것이다. 이것은 신규한 약물, 즉 임상적 용도의 이소발레릴 스피라마이신 I인 단일 성분의 비테스피라마이신 동족체(homolog)를 개발하기 위한 토대가 될 것이다.
내열성 스트렙토마이세스로부터의 이소발레릴트랜스퍼라제 유전자 ist는 조절 유전자 acyB2와 연결되고, 조절 유전자의 존재는 ist 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있음이 공지되어 있다. 모델 스트렙토마이세스 균주, 즉 완전한 ist- 뿐 아니라 acyB2-조절 유전자를 함유하는 다양한 리드 그린(Variable Lead Green) 스트렙토마이세스는 외부에서 첨가된 틸로신의 67-79%를 4"-이소발레릴 틸로신으로 전환시킬 수 있는 반면, ist 유전자만을 함유하거나 불완전한 acyB2 유전자를 갖는 ist 유전자를 함유하는 스트렙토마이세스의 동일한 균주는 첨가된 틸로신의 0-2.4%만을 전환시켰다[Arisawa A et al: Biosci Biotechnol Biochem 1993, 57(12): 2020-2025]. 약물 (티오펩틴)을 외부 첨가하는 조건하에, ist- 및 acyB2 유전자를 함유하는 자가 복제 형태의 재조합 플라스미드(벡터 pIJ702 또는 pIJ943)를 틸로신을 생산하는 박테리아(스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae))에 전달함에 의해, 형질전환체는 발효에서 주로 틸로신을 생산하였고, 그 밖에 미량의 4"-이소발레릴틸로신 (약 56 g/mL)이 검출될 수 있었다[Arisawa A. et al: J Antibiotics 1996, 49(4): 349-354]. 그러나, ist- 및 acyB 유전자를 틸로신을 생산하는 박테리아에 전달함에 의해 4"-이소발레릴틸로신 수율을 증가시키거나 혼합물에서 더 높은 함량의 단일 성분을 수득했다는 보고는 지금까지 발표된 바 없었다.
스피라마이신 생산 박테리아(스트렙토마이세스 암보파시엔스(Streptomyces ambofaciens))에서 acyB2 조절 유전자 및 전사 조절 단백질 Srm28c는 일치하며 [Fatma Karray et al Microbiology 2007, 153, 4111-4122], 이들의 동일성 정도는 69%이고, 틸로신 생산 박테리아(스트렙토마이세스 프라디애)에서 acyB2 및 조절 단백질 tylR의 동일성 정도는 41%이고, tylR은 틸로신 생산 박테리아에서 생합성의 포지티브 조절 단백질이며, 이것은 틸로신 생산 박테리아에서 폴리케타이드 합성효소 모듈 (tylGI)의 발현을 조절하며 틸로신 글리코실 합성뿐 아니라 폴리케톤 고리 산화에 대한 조절 역할을 한다. 틸로신 생산 박테리아에서 tylR 유전자의 높은 발현이 틸로신의 수율을 증가시킬 수 있다[George S. et al., Mol. Microbiology 2004,54(5):1326-1334]. 그러나, ist 유전자를 염색체-재조합 플라스미드 유사 DNA 재조합 기법에 의해 acyB2와 상동인 스피라마이신 생산 박테리아에 통합시키는 방법은 이소발레릴 스피라마이신의 혼합물을 800mg/mL만큼의 수율로 생산하였을 뿐이다[Shang Guangdong et al. Chinese Journal of Biotechnology, 1999,15(2):171]. 이것은, ist 유전자를 acyB2와 유사한 조절 유전자를 함유하는 균주에 전달하는 것만으로는 표적 생산물의 수율 및 성분 함량을 현저하게 증가시킬 수 없을 것임을 입증하는 것이다.
이러한 실험에서는 유전자 공학처리 기법을 이용하여 ist 유전자를 연결시킴에 의해 스피라마이신 생산 박테리아에서 ist 유전자의 카피수를 증가시켜 ist 유전자 양을 증가시킴으로써, 이소발레릴레이트에 대한 박테리아의 능력 또한 증가되었음을 입증하였다; 원래 ist 유전자 프로모터 서열을 강한 활성을 갖는 프로모터, 예컨대 에리트로마이신 내성 유전자 ermE 프로모터 서열로 대신함에 의해, ist 유전자의 발현이 증가될 수 있었음이 또한 입증되었다. 이에 의해 유전자 공학처리된 박테리아를 이용하여 이소발레릴 스피라마이신의 생산이 62%만큼 증가되었다[특허출원 번호 200910148767.8].
본 발명의 목적은 고함량의 비테스피라마이신 단일 성분, 즉 이소발레릴 스피라마이신 I을 산출하는 박테리아 균주뿐 아니라, 고도로 효율적이고 안정한 발현 시스템을 이용하여, 이소발레릴 스피라마이신 I의 성분만을 생산할 수 있는 이미 수득된 균주에서 조절 유전자 acyB2와 연결된 ist 유전자의 발현에 의해 높은 생산성을 수득하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 외인성 유전자에 의한 유전자 변형에 대해 실용 가치가 있는 항생제 생산 박테리아가 한정되어 있다는 장애를 극복함으로써 외인성 DNA의 전환율을 향상시키는 것이 필요하다. 한편, 안정한 발현을 위한 벡터 시스템을 선택함으로써 유전학적으로 공학처리된 박테리아가 대규모 산업적 생산에 적합해질 수 있도록 하는 것이 필요하다. 본 발명은 스트렙토마이세스에서 비-자가 복제용 통합 벡터를 채용할 것을 제안하며, 그러한 벡터는 스트렙토마이세스 파지 인테그라제 효소는 물론 부착 부위를 함유하고, 이. 콜라이(E. coli)에서의 제조를 촉진하기 위해 이. 콜라이 레플리콘만을 함유한다; 한편, 벡터에는 스트렙토마이세스 레플리콘이 없다. 이것이 스트렙토마이세스 세포로 들어갈 때, 통합은 담체 상의 부착 부위 (attP) 및 숙주 박테리아의 특이적 부착 부위에 의존한다. 따라서, 외인성 유전자는 대규모 생산에서 안정하게 발현될 수 있다. 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아에서 이소발레릴 스피라마이신 I의 수율 및 함량을 증가시키기 위한 상기 이소발레릴 아실라제 유전자 ist 및 조절 유전자 acyB2의 공동 발현에 대한 연구 및 파일럿-규모 실험 생산에 대한 연구는 국내외에서 지금까지 보고된 바가 없었다.
발명의 내용
1. 본 발명은 고수율 및 고함량의 이소발레릴 스피라마이신 I 성분을 생산하는 유전학적으로 공학처리된 박테리아의 균주를 제공하며, 상기 공학처리된 박테리아는 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아인 WSJ-2에서 공동 발현되는 acyB2 조절 유전자에 연결된 이소발레릴 트랜스퍼라제 유전자 ist를 갖는 클론 균주이다.
2. 본 발명은 고수율 및 고함량의 이소발레릴 스피라마이신 I 성분을 생산하는 유전자 공학처리된 박테리아 균주의 작제를 제공하며, 상기 작제는 내열성 스트렙토마이세스 (스트렙토마이세스 써모톨러렌시스(Streptomyces thermotolarences) CGMCC4.1501)의 총 DNA를 주형으로서 이용하여, NCBI에 의해 고지된 ist-acyB2 서열에 따라 프라이머를 설계하고, PCR에 의해 연결된 ist-acyB2 유전자 단편을 수득하고, 적절한 절단 부위를 삽입시켜 ist-acyB2 유전자 재조합 플라스미드를 작제하는 것이며, 또한 ist 및 acyB2 유전자 단편을 각각 적절한 절단 부위에서 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아 균주로 전달될 수 있는 통합 벡터와 라이게이션시켜 ist-acyB2 유전자 재조합 플라스미드를 작제하는 것이 제안된다. ist-acyB2 유전자 재조합 플라스미드는 후속하여 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아인 WSJ-2로 삽입되고, 그 후 PCR을 수행하여 ist-acyB2를 형질전환체 유전체에 통합시킴으로써 WSJ-IA를 수득하는 것이 확인된다.
3. 본 발명은 스트렙토마이세스의 분류 및 동정 기준에 따라 스트렙토마이세스 균주 WSJ-IA의 특징을 확인할 것을 제안한다.
4. 본 발명에서는 ist 모노겐을 대조로서 함유하는 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아 WSJ-2를 이용하여, 미생물학적 방법을 이용한 WSJ-IA 균주의 발효 역가 및 HPLC 정량 분석에 의해 발효 브로스에서 이소발레릴 스피라마이신 I의 함량 측정을 포함하는 WSJ-IA 균주의 발효 성능을 시험하였다. 그 결과, acyB2 조절 유전자의 도입은 이소발레릴 스피라마이신 I 성분의 함량뿐 아니라 균주에 의한 수율을 현저하게 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 효과: 본 발명의 긍정적인 효과는 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아 균주 WSJ-2로의 acyB2 조절 유전자의 도입이 발효 역가를 414%만큼 증가시킬 수 있고 이소발레릴 스피라마이신 성분 I의 함량을 170.2%만큼 증가시킬 수 있다고 나타난 것이다. 본 발명에서 작제된 높은 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 균주를 2톤 발효 탱크에서 파일럿 시험하였고, 축적된 이소발레릴 스피라마이신 I 샘플을 약동학적 연구에 이용하였다. 이러한 항생제 성분의 산업적 생산으로의 상기 균주의 적용은 품질 제어 및 생산물의 시험 기준을 단순화시킬 수 있을 뿐 아니라 이소발레릴 스피라마이신의 주사가능 제형을 제조하기 위한 조건도 제공할 수 있다.
도면의 설명
도 1은 ist-acyB2 유전자 재조합 플라스미드 pSET52-ia의 작제를 나타낸다;
도 2는 이소발레릴 스피라마이신을 생산하고 ist-acyB2 유전자를 함유하는 박테리아 균주의 염색체의 PCR 결과이다; 여기서 M: DNA MarkerIII; 1- WSJ-2 대조 박테리아; 2-5: 형질전환체 WSJ-IA 1-4;
도 3은 발효 생산물 중 ist-acyB2 유전자 재조합 플라스미드 pSET52-ia를 함유하는 박테리아 균주 WSJ-IA에 의한 이소발레릴 스피라마이신 성분 I의 HPLC 결과이다; 여기서 A: WSJ-2 대조 박테리아; B: WSJ-IA, ist 유전자 및 조절 유전자 acyB2를 함유하는 유전자 공학처리된 박테리아; SP-스피라마이신; ISO-SP-이소발레릴 스피라마이신 I.
발명의 구체예
하기 실시예는 당업자가 본 발명을 더 잘 이해하도록 돕기 위해 제공되었을 뿐이며 본 발명에 대한 어떠한 제한을 나타내는 것이 아니다.
실시예 1: 이중 유전자 ist-acyB2를 함유하는 재조합 플라스미드 pSET52-ia의 작제
실험실에서 미리 작제된 재조합 플라스미드 pSW4 [Shang Guangdong et al., Chinese Journal of Biotechnology, 1999,15(2):171]를 SmaI-BamHI 효소로 분해시켜 acyB2 유전자의 업스트림 부분을 함유하는 완전한 ist 유전자 및 1820bp 세그먼트를 수득하고, 차이나 제너럴 마이크로바이올로지컬 컬쳐 콜렉션 센터에서 제공된 내열성 스트렙토마이세스 (스트렙토마이세스 써모톨러렌시스 CGMCC4.1501)의 총 DNA를 주형으로서 이용하여 NCBI에 의해 고지된 acyB2 서열에 따라 프라이머를 설계하였다.
p1: CGCTCAGGGACGCAAGACC 및 P2: CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTC, PCR 온도: 94℃에서 2분간 예비변성; 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 1분간, 28 사이클; 72℃에서 5분간 연장시켜 acyB2 유전자의 다운스트림 부분의 1013bp 세그먼트를 수득하였다. BamHI-EcoRI 효소를 이용하여 PCR 생성물을 분해시킴으로써 934bp 세그먼트를 수득하였고, SmaI-BamHI(1820bp) 및 BamHI-EcoRI(934bp)에 의해 분해된 상기 언급된 세그먼트를 제한 효소 부위 SmaI-EcoRI에 의해 pBluesript II KS(+) 벡터 (E·Merck)내로 라이게이션시켜 ist 및 완전한 acyB2를 함유하는 유전자 재조합 플라스미드 pBKS-ia를 수득하였다. pSET152 플라스미드를 제한 부위를 통해 XbaI-EcoRI 효소에 의해 통합된 이. 콜라이/스트렙토마이세스 컨쥬게이션 전달 플라스미드내로 라이게이션시켜 [Bierman M. et al Gene 1992,116,43-49, from shared gene bank, www.genecool.com] ist-acyB2 유전자 재조합 플라스미드 pSET52-ia를 수득하였다 (실험 방법은 TAKARA Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.의 작업 절차에 따랐다). 작제 과정을 도 1에 도시한다.
실시예 2: 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아 WSJ-2의 재조합 플라스미드 pSET52-ia 전환
실험 [Chunyan Ma et al. Current Microbiology, 2011,62:16-20]에 의해 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아 WSJ-2를 작제하였다. 상기 균주를 사면 배지 [콩케익가루 2.0%, 글루코스 1.0%, 전분 3.0%, CaCO3, 0.5%, NaCl, 0.4%, 아가 2.0%] 상에서 28℃에서 7-10일간 배양시켜 문헌[D.A.Hopwood et al. Genetic manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, Norwich; John Innes Foundation UK, 1985]에 기재된 절차에 따라 원형질체를 제조하였다. 특히, 균주 배양액의 한 조각을 떠서 수크로스를 함유하는 R2YE 배지 상에 접종시키고, 28℃에서 2-4일 동안 배양하고, 0.5% 글리신을 첨가한 상기 배양액의 10%를 옮겨서 동일한 배지를 접종시키고 20시간 동안 배양하였다. 원심분리에 의해 균사체를 수집하고, 10.3% 수크로스 용액으로 2-3회 세척하고, 균사체를 2mg/ml 라이소자임을 함유하는 P 용액에서 37℃에서 15-60분간 용균시키고(bacteriolyze), 솜을 통해 여과시켜 원형질체를 수득하였다. 외인성 유전자 변형에 대한 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아 WSJ-2의 한계를 극복하기 위해, 먼저, 재조합 플라스미드 pSET52-ia를 메틸화-결함 이. 콜라이 12567로 이동시켰다 [Mac Neil et al Gene 1992, 111, 61-68, from shared gene bank, www.genecool.com]. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 후속하여 PEG의 매개하에 원형질체로 옮기고, R2YE 고형 배지 상에 코팅시켰다. 28℃에서 24시간 동안 배양시킨 후, 배양액을 아프라마이신을 함유하는 용액으로 덮어 배지에서 50 ㎍/ml의 최종 아프라마이신 농도를 달성하였고, 내성 형질전환체를 선택하기 위해 7-10일간 배양하였다. 형질전환체를 주입 없이 연속하여 계대배양한 다음, 주입 후 시험하여 내성 재조합 플라스미드 pSET52-ia를 안정하게 발현시키는 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 박테리아 WSJ-IA를 수득하였다.
ist 유전자의 업스트림 및 acyB2 유전자의 다운스트림을 위한 프라이머 P3: GAGGTAGAAGGCGAAGGT 및 P4: CGTCAGATGCCAGTTCAC를 설계하였다. 대조 박테리아 WSJ-2의 총 DNA에 대해 PCR을 수행하였고 WSJ-IA의 형질전환체 (4)를 본 발명에서 주형으로서 제시하였으며, PCR 절차는 다음과 같았다: 94℃에서 2분간 예비변성; 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 2분간, 28 사이클; 72℃에서 5분간 연장 (도 2). 수득된 결과는 WSJ-IA 유전체로부터 1733bp PCR 생성물이 수득될 수 있는 반면, 대조 균주에서는 어떠한 PCR 생성물도 수득되지 않았음을 나타내었는데, 이는 ist-acyB2 유전자가 표적 균주의 유전체에 성공적으로 통합되었음을 의미하는 것이었다. 상기 균주를, 보존을 위해 2010년 6월 25일에 차이나 제너럴 마이크로바이올로지컬 컬쳐 콜렉션 센터(No. 1, 3rd Bldg., Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, on June 25, 2010)로 보냈다. 수탁 번호: No.CGMCC 3942, 카테고리명: 스트렙토마이세스 스피라마이세티쿠스(Streptomyces spiramyceticus).
실시예 3: 균주 WSJ-IA의 특징의 동정 및 확인
"액티노마이세테스의 분류 및 동정"[Yan Xunchu ed., 1992]을 참조하여, 본 발명에서 WSJ-IA 균주의 특징을 동정하고 확인하였다.
1. WSJ-IA 배양 형태학 및 생리적 및 생화학적 특징
(1) 배양 특징
공기 균사체, 기질 균사체 및 상이한 배지에서 배양된 균주의 가용성 색소의 색을 관찰하였고, 결과를 표 1에 도시한다.
(2) 현미경 특징
포자의 원섬유는 부드럽고 감겨 있는 훅 같이 생긴 나선이고; 스포어는 원통모양이고 타원형이다.
표 1. WSJ-IA 균주의 배양 형태학
Figure 112013015717368-pct00003
Figure 112013015717368-pct00004
(3) 생리적 및 생화학적 특징
A. 선택된 기본 배지에서 WSJ-IA 균주에 의한 탄소원의 이용 검출
기본 배지: (NH4)2SO4 2.0g, MgSO4·7H2O 0.2g, NaH2PO4·H2O 0.5g, CaCl2·2H2O 0.1g, K2HPO4 0.5g, 증류수 1.0L. 측정하려는 0.1%-0.5%의 탄소원을 기본 배지에 첨가한다. 살균 후, 배지를 박테리아 현탁액으로 접종하고, 28℃에서 배양시키고, 3세대 동안 연속하여 계대배양시킨다. 세포 성장의 상태에 따라 탄소원에 대한 WSJ-IA 균주의 활용을 측정한다.
B. 기본 배지에서 말론산 활용의 측정: 기본 배지: 효모 추출물 1.0g, (NH4)2SO4 2.0g, K2HPO4 0.6g, KH2PO4 0.4g NaCl 2.0g, 소듐 말로네이트 3.0g, 브로모티몰 블루 0.025g, 증류수 1.0L, pH7.0-7.4. 살균 후, 배지를 박테리아 현탁액으로 접종하고, 28℃에서 1-2일 동안 배양시켰고, 박테리아에 의한 말론산 활용은 배지의 색이 녹색에서 청색으로 바뀔 때 나타난다.
C. 기본 배지에서 타르타르산 활용의 측정: 기본 배지: 펩톤 10.0g, NaCl 5.0g, 소듐 타르트레이트 10.0g, 브로모티몰 블루 (0.2%) 12.5mL, 증류수 1.0L, 사용 전에 배지를 살균시켰다. 동시에 아세트산납의 포화 용액을 제조하였다. 배지를 박테리아 현탁액으로 접종하고, 28℃에서 14일 동안 배양시켰다. 이성질체 아세트산납 용액을 첨가하였고, 박테리아에 의한 타르타르산 활용은 소량의 아세트산납 침전과 함께 배지의 색이 녹색에서 황색으로 바뀔 때 나타난다.
D. 젤라틴의 액화: 기본 배지: 펩톤 5.0g, 젤라틴 100-150g, 증류수 1.0L, pH7.2-7.4를 살균하였다. 박테리아를 18-24시간 동안 배양시킨 후, 현탁액을 젤라틴 배지에 천자 접종시키고, 동시에 비-접종된 대조군을 마련하였다. 샘플을 20℃에서 인큐베이터에서 2, 7, 10, 14 및 30일 동안 배양시키고, 세포 성장 및 젤라틴 액화를 20℃ 미만의 실온에서 관찰하였다. 결과가 박테리아의 성장을 나타내고 젤라틴 표면에서 어떠한 약화(depression)도 관찰되지 않으며 젤라틴 덩어리가 안정한 경우, 이는 젤라틴 액화 음성임을 의미한다.
E. 유제 반응(Milk reaction): 신선한 유제를 끊여서 밤새 냉장고에 두었다. 밑에 있는 탈지 분유를 취하고, 4 ml의 2.5% 리트머스 수용액 (100 ml의 증류수에 밤새 담근 후에 여과시킨 2.5 g의 리트머스)을 100 ml의 탈지 분유에 첨가하고, 혼합물을 시험 튜브에 약 4 cm의 높이로 각각 첨가시켰다. 시험 튜브를 살균하고 균주로 접종시키고 1, 3, 5, 7, 14 및 30일 동안 28℃에서 배양시켰다. 결과는 유제가 케익으로 펩톤화되었음을 나타내었다.
F. 니트레이트의 환원: 한천 배지 1.0 리터, KNO3 1.0 g, pH7.0-7.6. 4-5mL의 상기 배지를 시험 튜브 각각에 분배시킨 다음 살균시켰다. Griess 시약: a) 0.5 g의 설파닐산을 150 ml의 희석 아세트산 (10%)에 용해시키고; b) 0.1 g-나프틸 아민을 20 ml의 증류수 및 150 ml의 희석 아세트산 (10%)에 용해시켰다. 디페닐아민 시약: 0.5 g의 디페닐아민을 100 ml의 농축 황산에 용해시키고, 20 ml의 증류수로 희석시켰다. 균주를 니트레이트 배지에 접종시키고, 28℃에서 1, 3, 5일 동안 배양시키고, 소량의 1-, 3-, 5-일 배양액을 깨끗한 튜브에 첨가하고, 한 방울의 a) 및 b) 시약을 각각 첨가하였으며, 적색으로의 용액의 색 변화는 니트레이트의 니트라이트로의 환원을 나타내었다; 한 방울의 디페닐아민 시약을 첨가하였고, 청색 반응은 관찰될 수 없다.
G. 티로시나제 시험: 균주를 가우스 No.1 액체 배지에서 28℃에서 7, 9, 12일 동안 각각 접종시키고, 2 ml의 배양 브로스를 샘플링하고, 원심분리시켜 상청액을 수득하고, 2 mL의 인산염 완충액 (pH5.9) 및 1 ml의 0.04% 티로신 용액을 첨가하고, 온도를 37℃에서 유지시키고, 5분간 인큐베이션하였고, 어떠한 적색 반응도 관찰되지 않았다.
H. 아밀라제 시험: 균주를 0.2% 가용성 전분 아가를 지닌 BPA 배지로 접종시키고, 2-5일 동안 28℃에서 배양시켰다. 아가 플레이트에 명확한 콜로니가 형성된 후에, 아이오딘 용액 (아이오딘 1.0g KI 2.0g, 300mL 증류수)을 플레이트에 떨어뜨렸다. 색의 변화 없이 콜로니 조위에 투명한 원의 형성은 전분의 가수분해를 나타낸다.
균주 WSJ-IA의 생리적 및 생화학적 특징을 표 2에 나타낸다.
2. WSJ-IA의 분자 조직 특성의 분석
(1)16S rDNA 유전자 서열:
16SrDNA는 박테리아 리보솜의 일부이며, 이것은 rRNA의 엔코딩을 책임지는 박테리아의 염색체의 DNA 서열이다. 이것은 유전학에서 고도로 보존되기 때문에, 이의 서열은 박테리아 분자 분류학의 특성 중 하나로서 일반적으로 인지되어 왔다.
하기 16SrDNA 프라이머를 이용하였다: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3',
박테리아 균주 WSJ-IA의 총 DNA를 주형으로서 이용하여 PCR을 수행하였고, 절차는 다음과 같았다: 96℃에서 1분간 예비변성; 25 사이클의 각각에서 96℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1.5분간 연장; 후속하여, 72℃에서 10분간 연장시켜 1393 bp 서열을 수득하였다. 표 1을 참조하라.
표 2. 균주 WSJ-IA의 생리적 및 생화학적 특성
Figure 112013015717368-pct00005
표 3. WSJ-IA 16S rDNA 유전자 서열과 공지된 박테리아의 비교
Figure 112013015717368-pct00006
더욱이, 본 발명은 스트렙토마이세스의 분자 분류학에 일반적으로 사용되는 5개의 항존 유전자, 즉 WSJ-IA 균주에서 atpD, gyrB, rpoB, recA 및 trpB의 서열을 결정하였다. 이들은 단일 복사되었고 단백질 엔코딩 유전자였다. 이들은 구조적으로 안정하며, 이들 유전자에는 갭(gap) 또는 스태킹(stacking)이 없다. 따라서, 서열화 결과는 WSJ-IA의 분류학상 상태를 추가로 결정하기 위해 누클레오티드뿐 아니라 아미노산 수준에서 종간 균주 비교를 수행하는데 직접 이용될 수 있다.
(2) 항존 유전자
A．atpD 유전자 서열
atpD 유전자는 ATP 합성효소의 서브유닛이다. 이것은 고도로 안정하며 미생물 종에 공통이므로, 생식세포 분류를 위한 분자 마커가 되기에 적합하다. 본 발명에서 하기 프라이머를 이용하였다:
Figure 112013015717368-pct00007
박테리아 균주 WSJ-IA의 총 DNA를 주형으로서 이용하여 PCR을 수행하였고, 절차는 다음과 같았다: 96℃에서 1분간 예비변성; 28 사이클의 각각에서 96℃에서 30초간 변성, 63℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1.0분간 연장; 후속하여, 72℃에서 10분간 연장시켜 680 bp 서열을 수득하였다. 표 2를 참조하라.
B．gyrB 유전자 서열
gyrB는 DNA 가이라제 사합체의 서브유닛이고 원핵생물 타입 II DNA 토포아이소머라제에 속한다. 이것은 DNA를 절단하고 재라이게이션시키는 효과에 의해 DNA 토폴로지를 조절하고, 몇몇 항생제 생산 박테리아 균주의 내성과 일부 관련성을 지니며, 미생물 종에서 고도의 안정성 및 보편성을 지닌 결과로서, 계통발생 분류의 분자 마커에 적합하다. 따라서, 이의 서열은 박테리아 분자 분류학의 특징 중 하나로서 일반적으로 인지되어 왔다.
하기 프라이머를 본 발명에 이용하였다:
박테리아 균주 WSJ-IA의 총 DNA를 주형으로서 이용하여 PCR을 수행하였고, 절차는 다음과 같았다: 96℃에서 1분간 예비변성; 28 사이클의 각각에서 96℃에서 30초간 변성, 65℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1.5분간 연장; 후속하여, 72℃에서 10분간 연장시켜 1177 bp 서열을 수득하였다. 표 3을 참조하라.
C．rpoB 유전자 서열
rpoB는 RNA 폴리머라제의 b-서브유닛이고, 스트렙토마이세스에 광범하게 존재한다.
하기 프라이머를 본 발명에 이용하였다:
Figure 112013015717368-pct00008
박테리아 균주 WSJ-IA의 총 DNA를 주형으로서 이용하여 PCR을 수행하였고, 절차는 다음과 같았다: 96℃에서 1분간 예비변성; 28 사이클의 각각에서 96℃에서 30초간 변성, 65℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1.3분간 연장; 후속하여, 72℃에서 10분간 연장시켜 870 bp 서열을 수득하였다. 표 4를 참조하라.
D．recA 유전자 서열
RecA는 재조합효소이고, DNA 상동 재조합 및 손상된 DNA의 복구 과정에서 중요한 역할을 한다. RecA의 존재는 균주 유전체 DNA의 안정성을 확보하는데 매우 중요한 인자이므로, 이의 서열은 박테리아 분자 분류학의 특징 중 하나로서 일반적으로 인지되어 왔다.
하기 프라이머를 본 발명에 이용하였다:
Figure 112013015717368-pct00009
박테리아 균주 WSJ-IA의 총 DNA를 주형으로서 이용하여 PCR을 수행하였고, 절차는 다음과 같았다: 96℃에서 1분간 예비변성; 28 사이클의 각각에서 96℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1.0분간 연장; 후속하여, 72℃에서 10분간 연장시켜 701 bp 서열을 수득하였다. 표 5를 참조하라.
E．trpB 유전자 서열
trpB 유전자는 스트렙토마이세스의 일차 대사에 관여하는 트립토판 합성효소를 엔코딩하고, 이러한 유전자는 균주 종 특이성을 갖는 것으로 고려되며, 이의 서열은 박테리아 분자 분류학의 특징 중 하나로서 일반적으로 인지되어 왔다.
하기 프라이머를 본 발명에 이용하였다:
Figure 112013015717368-pct00010
박테리아 균주 WSJ-IA의 총 DNA를 주형으로서 이용하여 PCR을 수행하였고, 절차는 다음과 같았다: 96℃에서 1분간 예비변성; 28 사이클의 각각에서 96℃에서 30초간 변성, 66℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1.0분간 연장; 후속하여, 72℃에서 10분간 연장시켜 611 bp 서열을 수득하였다. 표 6을 참조하라.
표 3 및 4의 결과는 박테리아 균주 WSJ-IA의 16SrDNA 및 5개의 항존 유전자 서열과, 공지된 균주의 유전자 서열 간에 완전한 일치가 존재하지 않음을 나타내며, 따라서 WSJ-IA가 스트렙토마이세스의 새로운 종일 수 있다고 판단할 수 있다.
표 4. WSJ-IA의 항존 유전자 서열과 공지된 박테리아의 비교
Figure 112013015717368-pct00011
실시예 3: WSJ-IA 박테리아 균주의 파일럿-규모 발효의 측정
WSJ-IA 균주를 실시예 2에 기재된 사면 배지에서 28℃에서 7-10일간 배양시키고, 상기 배양액의 한 조각을 떠서 시드 배지 (콩케익가루 1.5%, 전분 3.0%, NaCl 0.4%, CaCO3 0.5%, 피쉬 펩톤 0.3%, KH2PO4 0.05%) 상에 접종하고, 단계 A에서 28℃에서 48시간 동안 배양시키고, 이어서 단계 B로 옮겨서 28℃에서 24시간 동안 배양시킨 다음, 50L의 시드 탱크로 옮기고, 36시간 동안 배양시킨 후에 2톤 발효 탱크로 옮겨서 시드 배지에서 배양시키고 (배양 배지: 글루코스 0.5%, 전분 6.0%, 효모 분말 0.5%, 피쉬밀 2.0%, NH4NO3 0.6%, NaCl 1.0%, CaCO3 0.5%, KH2PO4 0.05%, MgSO4 0.1%), 28℃에서 발효를 수행하여 96h 동안 배양시켰다. 발효 브로스의 상청액을 샘플링하고, 3% NaCl을 함유하는 pH7.8~8.0 포스페이트 완충액으로 희석시켰다. 바실러스[CGMCC(B)63501]를 시험 박테리아로서 이용하여 하기 배지에서 중국 약전 2010 ed. II, 부록 XI에 따른 표준 곡선법을 이용하여 발효 역가를 측정하였다: 폴리펩톤 0.6%, 쇠고기 추출 분말 0.15%, 효모 추출물 페이스트 0.6%, 글루코스 0.2%, 아가 1.5-2.0%, 대조군으로서 아세틸 스피라마이신 이용. 실험을 3회 반복하여 1160 ㎍/ml의 평균 WSJ-IA 발효 역가를 수득하였고, 대조적으로 ist 단일 유전자를 함유하는 WSJ-2 균주를 이용한 발효는 280 ㎍/ml의 평균 역가를 나타내었다 (표 5).
실시예 4: WSJ-IA 균주를 이용하여 발효시킨 이소발레릴 스피라마이신 I 성분의 생산물의 수율 측정
실시예 3에서 수득된 발효 브로스를 샘플링하고, 브로스의 pH를 8.5로 조정하였으며, 이것을 당량의 에틸 아세테이트로 추출하고, 에틸 아세테이트 추출물을 농축건조시켜 메탄올에 용해시켰다. 용액을 Kromasil C18 컬럼 (4.5 mm × 150 mm, 5 ㎛)을 이용하여 분리시켰다; 이동상: 메탄올: 소듐 디히드로겐 포스페이트 용액 (53:47 v/v); 검출 파장: 231 nm; 유량: 1.0 mL·분-1; 컬럼 온도 25℃; 샘플 크기: 10-20 μL. 브로스에서 이소발레릴 스피라마이신 I 성분의 함량을 HPLC 결과를 이용하여 계산하였다 (도 3). 3회 실험의 결과는, ist 모노겐을 함유하는 WSJ-IA 균주 및 WSJ-2 균주를 이용하여 발효시켰을 때, 이소발레릴 스피라마이신 I 성분의 평균 총 함량이 각각 12.061% 및 7.088%였음을 나타내었다. 실시예 3에 따른 발효 후에, 두 균주의 발효 역가를 미생물학적 검정으로 측정하였고, 생산물을 HPLC를 이용하여 분석하였다 (도 3). 수득된 HPLC 피크 면적에 따라, 두 균주를 이용하여 생산된 이소발레릴 스피라마이신 I 성분을 비교하고, 두 균주를 이용하여 생산된 이소발레릴 스피라마이신 I vs. 스피라마이신의 비를 각각 계산하였다. 이러한 결과는, ist-acyB2 유전자의 도입이 WSJ-IA의 발효 역가를 414%만큼 증가시켰고, 생산된 이소발레릴 스피라마이신 I 함량을 170.2%만큼 증가시켰으나, 스피라마이신의 생산은 그에 따라 감소되었음을 나타내었다. 이것은 이소발레릴 스피라마이신 I 함량과 스피라마이신 함량 간의 비를 218%만큼 증가시켰다 (표 5).
본 발명은 특정 발효 조건하에 ist-acyB2 유전자를 함유하는 이소발레릴 스피라마이신 I을 생산할 수 있는 균주를 제공한다. 이러한 균주는 ist 유전자만을 함유하는 균주에 비해 이소발레릴 스피라마이신 I의 생산율을 1.7배만큼 증가시키고, 발효 역가를 4.14배만큼 증가시켰다.
표 5. WSJ-IA 및 WSJ-2 균주를 이용한 발효 역가 및 성분 함량의 비교
Figure 112013015717368-pct00012
차이나 제너럴 마이크로바이올로지컬 컬쳐 콜렉션 센터(CGMCC) CGMCC3942 20100625
SEQUENCE LISTING <110> Shen Yang Tonglian Group Co.,Ltd <120> A genetically engineered bacterial strain WSJ-IA I producing high content and high yield of isovaleryl spiramycin <141> 2011-3-30 <150> 201010237595.4 <151> 2010-7-23 <160> 6 <210> 1 <211> 1393 <212> DNA <213> Streptomyces spiramyceticus <220> <221> 16S rDNA <222> (20)..(1413) <223> <400> 1 CCTTCGACAG CTCCCTCCCA CAAGGGGTTG GGCCACCGGC TTCGGGTGTT ACCGACTTTC 60 GTGACGTGAC GGGCGGTGTG TACAAGGCCC GGGAACGTAT TCACCGCAGC AATGCTGATC 120 TGCGATTACT AGCAACTCCG ACTTCATGGG GTCGAGTTGC AGACCCCAAT CCGAACTGAG 180 ACCGGCTTTT TGAGATTCGC TCCGCCTCGC GGCATCGCAG CTCATTGTAC GGCCATTGTA 240 GCACGTGTGC AGCCCAAGAC ATAAGGGGCA TGATGACTTG ACGTCGTCCC CACCTTCCTC 300 CGAGTTGACC CCGGCGGTCT CCTGTGAGTC CCCATCACCC CGAAGGGCAT GCTGGCAACA 360 CAGGACAAGG GTTGCGCTCG TTGCGGGACT TAACCCAACA TCTCACGACA CGAGCTGACG 420 ACAGCCATGC ACCACCTGTA TACCGACCAC AAGGGGGCAC CTATCTCTAG GTGTTTCCGG 480 TATATGTCAA GCCTTGGTAA GGTTCTTCGC GTTGCGTCGA ATTAAGCCAC ATGCTCCGCT 540 GCTTGTGCGG GCCCCCGTCA ATTCCTTTGA GTTTTAGCCT TGCGGCCGTA CTCCCCAGGC 600 GGGGAACTTA ATGCGTTAGC TGCGGCACCG ACGACGTGGA ATGTCGCCAA CACCTAGTTC 660 CCAACGTTTA CGGCGTGGAC TACCAGGGTA TCTAATCCTG TTCGCTCCCC ACGCTTTCGC 720 TCCTCAGCGT CAGTAATGGC CCAGAGATCC GCCTTCGCCA CCGGTGTTCC TCCTGATATC 780 TGCGCATTTC ACCGCTACAC CAGGAATTCC GATCTCCCCT ACCACACTCT AGCCTGCCCG 840 TATCGAATGC AGACCCGGGG TTAAGCCCCG GGCTTTCACA TCCGACGCGA CAAGCCGCCT 900 ACGAGCTCTT TACGCCCAAT AATTCCGGAC AACGCTTGCG CCCTACGTAT TACCGCGGCT 960 GCTGGCACGT AGTTAGCCGG CGCTTCTTCT GCAGGTACCG TCACTTTCGC TTCTTCCCTG 1020 CTGAAAGAGG TTTACAACCC GAAGGCCGTC ATCCCTCACG CGGCGTCGCT GCATCAGGCT 1080 TTCGCCCATT GTGCAATATT CCCCACTGCT GCCTCCCGTA GGAGTCTGGG CCGTGTCTCA 1140 GTCCCAGTGT GGCCGGTCGC CCTCTCAGGC CGGCTACCCG TCGTCGCCTT GGTAGGCCAT 1200 TACCCCACCA ACAAGCTGAT AGGCCGCGGG CTCATCCTTC ACCGCCGGAG CTTTTAACCC 1260 CCACCCATGC AGGCAGGAGT GTTATCCGGT ATTAGACCCC GTTTCCAGGG CTTGTCCCAG 1320 AGTGAAGGGC AGATTGCCCA CGTGTTACTC ACCCGTTCGC CACTAATCCA CCCCGAAGGG 1380 CTTCATCGTT CGA 1393 <210> 2 <211> 680 <212> DNA <213> Streptomyces spiramyceticus <220> <221> atpD <222> (553)..(1232) <223> <400> 2 AGCTTGTCCT CTTCGCCCAG CTCGTCGATA CCGAGGATCG CGATGATGTC CTGGAGGTCC 60 TTGTACTTCT GCAGGATTCC CTTGACGCGG CTGGCCGCGT CGTAGTGGTC CTGCGTGATG 120 TAGCGGGGGT CCAGGATGCG GGACGTCGAG TCCAGCGGGT CGACCGCCGG GTAGATGCCC 180 TTCTCCGAGA TCGGGCGCGA CAGAACGGTC GTCGCGTCCA GGTGGGCGAA GGTGGTCGCC 240 GGCGCCGGGT CGGTCAGGTC GTCCGCGGGG ACGTAGATCG CCTGCATCGA GGTGATCGAG 300 TGACCACGCG TCGAGGTGAT GCGCTCCTGG AGCACACCCA TCTCGTCGGC CAGGGTCGGC 360 TGGTAACCCA CTGCGGACGG CATACGGCCG AGCAGCGTGG AGACCTCGGA ACCGGCCTGG 420 GTGAAGCGGA AGATGTTGTC GATGAAGAGC AGCACGTCCT GCTTCTGAAC ATCGCGGAAG 480 TACTCCGCCA TGGTCAGGGC GGACAGGGCG ACGCGCAGAC GCGTGCCCGG CGGCTCGTCC 540 ATCTGGCCGA AGACCAGCGC GGTCTTGTCC AGAACACCCG ATTCGGTCAT CTCGTCGATG 600 AGGTCGTTGC CCTCACGGGT GCGCTCGCCG ACACCGGCGA ACACCGACAC ACCCTCGTGC 660 AGCTTCGCCA CACGCATGAT 680 <210> 3 <211> 1177 <212> DNA <213> Streptomyces spiramyceticus <220> <221> gryB <222> (20)..(1196) <223> <400> 3 CCGGCGGTCT GCACGGCGTC GGCGTCTCCG TGGTGAACGC GCTGTCGTCG AAGGTCGCTG 60 TCGAGGTCAA GCGCGACGGT TACCGCTGGA CGCAGGACTA CAAGCTCGGT GTGCCGACGG 120 CGCCGCTGGC CCGTAACGAG GCCACGGAGG AGTCCGGTAC CTCTGTCACC TTCTGGGCCG 180 ACCCGGACGT CTTCGAGACG ACCGACTACT CCTTCGAGAC GCTGTCGCGG CGTTTCCAGG 240 AGATGGCGTT CCTCAACAAG GGCCTGACGC TCAAGCTGAC GGACGAGCGG GAGTCCGCGA 300 AGGCCGTGGC GGGGGCGGAC ACGGCGGACG GTACGGAGGA CGACCAGGTC CGTACGGTCA 360 CGTACCACTA CGAAGGCGGC ATCGTCGACT TCGTGAAGTA CCTGAACTCG CGCAAGGGTG 420 AGCTGATTCA CCCGACCGTC ATCGACGTCG AGGCCGAGGA CAAGGAGCGC ATGCTCTCGG 480 TCGAGATCGC GATGCAGTGG AACTCGCAGT ACACCGAGGG TGTCTACTCC TTCGCGAACA 540 CGATCCACAC GCACGAGGGC GGCACGCACG AAGAGGGCTT CCGTGCGGCG ATGACAGGTC 600 TGGTCAACCG GTACGCGCGC GAGAAGAAGT TCCTGCGTGA GAAGGACGAC AACCTCGCCG 660 GTGAGGACAT CCGTGAGGGT CTGACGGCGA TCATCTCGAT CAAGCTGGGC GAGCCGCAGT 720 TCGAGGGTCA GACGAAGACC AAGCTGGGCA ACACGGAGGC GAAGACCTTC GTGCAGAAGG 780 TCGTGCACGA GCACCTCAAC GACTGGTTCG ACCGCAATCC GAACGAGGCC GCGGACATCA 840 TCCGCAAGTC GATCCAGGCG GCCACGGCGC GCGTCGCGGC CCGCAAGGCG CGCGACCTGA 900 CCCGTCGCAA GGGCCTGCTG GAGTCGGCCT CGCTGCCGGG CAAGCTGTCC GACTGCCAGT 960 CGAACGACCC GACGAAGTGC GAGATCTTCA TCGTCGAGGG TGACTCCGCC GGTGGCTCGG 1020 CGAAGTCCGG TCGTAACCCG ATGTACCAGG CCATCCTGCC GATCCGAGGC AAGATCCTGA 1080 ACGTCGAGAA GGCGCGGATC GACAAGATCC TCCAGAACAC CGAGGTCCAG GCGCTGATCT 1140 CGGCGTTCGG CACGGGTGTG CACGAGGACT TCGACAT 1177 <210> 4 <211> 870 <212> DNA <213> Streptomyces spiramyceticus <220> <221> gryB <222> (1276)..(2145) <223> <400> 4 GTCGTCGCCT CCATCAAGGA GTTCTTCGGC ACCACCCAGC TGTCGCAGTT CATGGACCAG 60 AACAACCCGC TGTCGGGTCT CACCCACAAG CGCCGTCTGT CGGCGCTTGG CCCGGGTGGT 120 CTCTCCCGTG AGCGGGCCGG CTTCGAGGTC CGTGACGTGC ACCCGTCTCA CTACGGCCGC 180 ATGTGCCCGA TTGAGACCCC TGAAGGCCCG AACATCGGTC TGATCGGTTC GCTCGCCTCG 240 TACGGCCGCG TCAACGCGTT CGGCTTCGTC GAGACGCCGT ACCGCAAGGT CGTCGACGGT 300 GTCGTCACCG ACGACGTCGA CTACCTGACG GCCGACGAAG AGGACCGCTT CGTCATCGCG 360 CAGGCCAACG CGACGCTCTC CGAGGACATG CGCTTCGAGG AGTCCCGCGT CCTGGTCCGC 420 CGTCGTGGCG GCGAGATCGA CTACATCCCG GGCGACGACG TCGACTACAT GGACGTCTCG 480 CCGCGCCAGA TGGTGTCGGT CGCGACCGCG ATGATCCCGT TCCTCGAGCA CGACGACGCA 540 AACCGCGCGC TCATGGGCGC GAACATGATG CGTCAGGCCG TGCCGCTGAT CACGTCCGAG 600 GCGCCGCTCG TCGGCACCGG CATGGAATAC CGCTGTGCGG TCGACGCCGG TGACGTCATC 660 AAGGCGGAGA AGGAGGGCGT GGTCCAGGAG GTTTCCGCGG ACTACGTCAC CGTCGCCAAC 720 GACGACGGTA CGTACACCAC GTACCGCATC GCCAAGTTCT CCCGCTCCAA CCAGGGCACC 780 TCGGTCAACC AGAAGGTTGT CGTCGACGAG GGTGCCCGGG TCGTCGAGGG CCAGGTCCTC 840 GCCGACGGGC CCGCCACCCA GCAGGGTGAG 870 <210> 5 <211> 701 <212> DNA <213> Streptomyces spiramyceticus <220> <221> gryB <222> (167)..(867) <223> <400> 5 ACCGGCCGAC GACCCCATCG AGGTCATCTC CACCGGGTCG ACCGCTCTGG ACATCGCGCT 60 CGGCGTCGGC GGACTGCCGC GCGGTCGTGT GGTGGAGGTG TACGGACCGG AATCCTCCGG 120 TAAGACGACA CTGACGCTGC ACGCCGTGGC CAACGCGCAG AAGGCCGGTG GCACCGTCGC 180 CTTCGTGGAT GCCGAGCACG CGCTCGACCC CGAATACGCC AAGGCACTCG GCGTCGACAC 240 GGACAATCTG ATCCTCTCCC AGCCGGACAC CGGCGAGCAG GCCCTCGAGA TCGTGGACAT 300 GCTGGTCCGC TCGGGCGCCA TCGACCTCAT CGTCATTGAC TCCGTCGCCG CCCTGGTGCC 360 GCGCGCGGAG ATTGAGGGTG AGATGGGCGA CTCGCACGTC GGCCTCCAGG CCCGGCTGAT 420 GAGCCAGGCG CTGCGCAAGA TCACTGGCGC GCTGCACCAG TCCCAGACCA CAGCGATCTT 480 CATCAACCAG CTCCGCGAGA AGATCGGTGT GATGTTCGGC TCCCCGGAGA CCACGACAGG 540 TGGCCGGGCG CTGAAGTTCT ACGCCTCCGT GCGGCTCGAC ATCCGCCGTA TCGAGACCCT 600 CAAGGACGGC ACGGACGCGG TCGGCAACCG CACCCGCGTC AAGGTCGTCA AAAACAAGGT 660 CGCGCCGCCG TTCAAGCAGG CCGAGTTCGA CATCCTCTAC G 701 <210> 6 <211> 611 <212> DNA <213> Streptomyces spiramyceticus <220> <221> trpB <222> (1)..(611) <223> <400> 6 GCTCACCAAG CGCATGGGCA AGACGCGCGT GATCGCGGAG ACCGGCGCCG GCCAGCACGG 60 CGTCGCCACC GCCACCGCGT GCGCCCTCTT CGGCCTCGAA TGCACCATCT ACATGGGCGA 120 GATCGACACC GAGCGCCAGG CGCTCAACGT CGCCCGCATG CGGATGCTCG GTGCCGAGGT 180 CGTCGCCGTG AAGTCCGGCA GCCGCACCCT GAAGGACGCC ATCAACGAGG CGTTCCGCGA 240 CTGGGTCGCC AATGTCGACC GTACGCACTA CCTCTTCGGC ACGGTCGCCG GCCCGCACCC 300 CTTCCCCGCC ATGGTCCGCG ACTTCCACCG GGTCATCGGT GTCGAGGCAC GCCGCCAGAT 360 CCTGGAGCGC ACGGGACGGC TGCCCGACGC GGCGGTCGCC TGCGTCGGCG GCGGGTCCAA 420 CGCCATCGGT CTCTTCCACG CCTTCATCCC GGACGCGGAC GTACGTCTCA TCGGCTGCGA 480 GCCCGCCGGG CACGGCATCG AGACCGGCGA GCACGCGGCC ACCCTGTCCG CGGGCGAGCC 540 CGGCATCCTG CACGGCTCGC GGTCGTACGT CCTCCAGGAC GAGGAGGGCC AGATCACCGA 600 GCCCTACTCG A 611

Claims (4)

  1. WSJ-IA로 명명되고 기탁번호 CGMCC 3942로 기탁된 유전공학적으로 처리된 스트렙토마이세스 균주.
  2. A) 재조합 플라스미드 pSW4를 SmaI-BamHI 효소로 분해시켜, acyB2 유전자의 업스트림 부분을 함유하는 완전한 ist 유전자 및 1820bp 세그먼트를 수득하고;
    B) 내열성 스트렙토마이세스 써모톨러렌시스(Streptomyces thermotolarences) CGMCC4.1501의 총 DNA를 주형으로서 이용하여, p1: CGCTCAGGGACGCAAGACC 및 P2: CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTC의 프라이머를 설계하고, PCR 온도: 94℃에서 2분간 예비변성; 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 1분간, 28 사이클; 72℃에서 5분간 연장시켜 acyB2 유전자의 다운스트림 부분의 1013bp 세그먼트를 수득하고;
    C) BamHI-EcoRI 효소를 이용하여 PCR 생성물을 분해시킴으로써 934bp 세그먼트를 수득하고, SmaI-BamHI 및 BamHI-EcoRI에 의해 분해된 상기 언급된 세그먼트를 제한 효소 부위 SmaI-EcoRI에 의해 pBluesript II KS(+) 벡터 내로 라이게이션시켜 ist 및 완전한 acyB2를 함유하는 유전자 재조합 플라스미드 pBKS-ia를 수득하고;
    D) XbaI-EcoRI 효소를 이용하여 pSET152 플라스미드 및 pBKS-ia를 분해시켜, ist-acyB2 유전자 재조합 플라스미드 pSET52-ia를 수득하고;
    E) 재조합 플라스미드 pSET52-ia를 메틸화-결함 대장균 12567로 이동시키고; 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 그 후 R2YE 고형 배지 상에 코팅된, 스트렙토마이세스 써모톨러렌시스 WSJ-2A로 PEG의 매개 하에 이동시키고; 28℃에서 24시간 동안 배양시킨 후, 배양액을 아프라마이신을 함유하는 용액으로 덮어, 50 ㎍/ml의 내지 내 최종 아프라마이신 농도를 달성하고, 7 내지 10일간 배양하여, 내성 형질전환체를 선택하고; 형질전환체를 주입 없이 연속하여 계대배양한 다음, 주입 후 시험하여 내성 재조합 플라스미드 pSET52-ia를 안정하게 발현시키는 이소발레릴 스피라마이신 I 생산 균주 WSJ-IA를 수득하는,
    제 1항의 유전공학적으로 처리된 스트렙토마이세스 균주를 작제하는 방법.
  3. 제 1항의 유전공학적으로 처리된 스트렙토마이세스 균주를 배양 배지에서 배양하여 제조된 발효 브로스로부터 이소발레릴 스피라마이신 Ⅰ을 회수하는 단계를 포함하는, 이소발레릴 스피라마이신 Ⅰ의 제조 방법.
  4. 삭제
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