CN111621454B - 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因工程高产ε‑聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，所述淀粉酶产色链霉菌将不同代谢通路中的三个关键基因琥珀酸脱氢酶基因sdhB、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA或天冬酰胺合成酶基因asnO在Streptomyces diastatochromogenes TUST中分别过量表达得到的。本发明通过过表达不同代谢途径中关键基因获得基因工程重组菌株，经过实验证实，该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε‑聚赖氨酸的能力均有提高，为ε‑聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

Description

基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用。
背景技术
ε-聚赖氨酸是目前发现的两种天然氨基酸同聚物之一(另一种是γ-聚谷氨酸)，自首株ε-聚赖氨酸产生菌发现后，经土壤筛选所得ε-聚赖氨酸产生菌均属于链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、北里孢菌属(Kitasatospora)和香柱属
Figure GDA0004099814320000011
ε-聚赖氨酸产生菌的分布主要局限于丝状细菌链霉菌科和麦角真菌。ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用，热稳定性好，可直接加入食品一起加工。日本学者Shima和Sakai于20世纪80年代初首次将这种生物防腐剂应用于食品防腐。ε-聚赖氨酸还可作为一种食疗剂，抑制肠道中膳食脂肪的吸收，最终降低肥胖的几率。ε-聚赖氨酸也可用于防治牙周炎疾病，可抑制口腔细菌毒素的产生。除此之外，ε-聚赖氨酸可用于一次性擦布中药溶液的一种组成成分。ε-聚赖氨酸还可用作乳化剂，ε-聚赖氨酸与葡聚糖结合后所得结合物的乳化活性优于商业乳化剂。在水凝胶、生物芯片和生物电子的镀膜材料等方面也具有十分重要的用途。
正是由于ε-聚赖氨酸具有以上优良性质和广阔的市场前景，1989年日本智索股份有限公司(Chisso Corporation)首先利用微生物发酵技术工业化生产ε-聚赖氨酸。2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε-聚赖氨酸的产量。随着ε-聚赖氨酸的需求量不断增大，国内外也有许多学者采用诱变育种等手段以期提高ε-聚赖氨酸的产量，Hiraki利用亚硝基胍对野生型菌株S.albulus No.346进行化学诱变，其中一株S.albulus 11011A高产突变株比出发菌株ε-聚赖氨酸产量高出约10倍。目前还未见到通过基因工程构建淀粉酶产色链霉菌菌株，来提高ε-聚赖氨酸产量的报道。
通过检索，发现如下与本发明专利申请相关的公开文献：
1、一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 105441373 B)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD-4，它是将来源于S.albulus PD-1基因组上的铵转运蛋白基amtB进行过量表达，具有比白色链霉菌S.albulus PD-1(CCTCCM2011043)更高的ε-聚赖氨酸合成能力。虽然工程菌的ε-聚赖氨酸合成效率有所提高，但由于基因工程仅提高了单一代谢通路、而不是多条代谢通路的强度，因此小白链霉菌ε-PL产量仍有提升空间。
2、一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 108531439 A)，公开了一种大肠杆菌基因工程菌，通过构建过表达fimH基因的大肠杆菌基因工程菌，使大肠杆菌在发酵产L-苏氨酸过程中生物膜产量提高，并且黏附性增加，菌群数量增加，提高了L-苏氨酸的产量和糖转化率，缩短了发酵周期。
3、宋存江等发表的论文(Effects of Chromosomal Integration oftheVitreoscilla Hemoglobin Gene(vgb)and S-Adenosylmethionine Synthetase Gene(metK)onε-Poly-L-Lysine Synthesis in Streptomyces albulus NK660)中，在菌株Streptomyces albulus NK660中利用组成型启动子ermE*表达vgb和metK基因，使ε-聚赖氨酸产量提高了26.67％，生物量也有所改善。
4、毛忠贵等的文章(Differential protein expression ofa streptomycin-resistant Streptomyces albulus mutant in high yield production of ε-poly-L-lysine:a proteomics study)中，在菌株S.albulus M-Z18中过表达了ε-聚赖氨酸合成酶(pls)基因和核糖体回收因子(frr)基因，使ε-聚赖氨酸产量和每单位细胞ε-PL生物合成量分别增加了7.2％和20.3％。
5、毛忠贵等(Understanding highε-poly-l-lysine production byStreptomyces albulus usingpH shock strategy in the level of transcriptomics)一文中，敲除了信号转导系统中的有关基因，说明了其对ε-聚赖氨酸的产量存在着重要的作用。
如上所述，目前虽然有报道将基因工程技术用于菌株的改造上，但对于ε-聚赖氨酸生产菌的报道较少，且就ε-聚赖氨酸和葡萄糖转化率而言，据日本的报道还有一定的距离。因此，需要一种利用基因工程改造淀粉酶产色链霉菌以提高ε-聚赖氨酸产量的方法，不单单局限于单一代谢通路，而着眼于多条代谢途径中关键基因的改造。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，所述淀粉酶产色链霉菌将不同代谢通路中的三个关键基因琥珀酸脱氢酶基因sdhB、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA或天冬酰胺合成酶基因asnO在Streptomyces diastatochromogenes TUST中分别过量表达得到的。
而且，所述Streptomyces diastatochromogenes TUST的名称为TUST1，分类名称为Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.3145，保藏日期：2009年6月29日，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴提取原始淀粉酶产色链霉菌TUST的基因组；
⑵以步骤⑴提取得到的基因组为模板，采用PCR技术扩增目的基因，目的基因为琥珀酸脱氢酶基因sdhB、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA或天冬酰胺合成酶基因asnO；
⑶将步骤⑵得到的目的基因插入整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP的EcoRI/XbaI酶切位点间，得到携带目的基因的重组质粒；
⑷将步骤⑶构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，通过接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌TUST的基因组中，获得所述的工程菌。
而且，所述携带目的基因的重组质粒的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据所需基因设计引物序列FF/RR，在基因两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的目的基因；
⑵重组质粒的构建：用XbaI和EcoRI双酶切质粒pIMEP，将扩增的目的基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的质粒pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒，化学法转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选转化子保存。
而且，所述步骤⑶中pIMEP质粒是在pSET 152质粒的基础上在多克隆位点前连入红霉素启动子ermE*构建得到，该质粒为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，能够用于链霉菌中基因的表达。
如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在ε-聚赖氨酸制备方面中的应用。
利用如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，步骤如下：
将基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌接种在贝纳特培养基平板上，在28-37℃培养直至产生分生孢子；
然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28-37℃，150-200rpm，培养24-30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵直至72h，即得ε-聚赖氨酸母液；
其中，每1LM3G培养基的组成为：(NH4)2SO410g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO40.8g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL；
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml 20×MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min；
在使用M3G培养基时，每取90ml M3G，再加入10ml 10×的葡萄糖母液；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明通过过表达不同代谢途径中关键基因获得基因工程重组菌株，经过实验证实，该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε-聚赖氨酸的能力均有提高，为ε-聚赖氨酸生产提供了优良菌种。
2、本发明方法通过分别过表达琥珀酸脱氢酶基因(sdhB)、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因(dcdA)或天冬酰胺合成酶基因(asnO)来提高ε-聚赖氨酸发酵水平。
3、本发明通过过表达琥珀酸脱氢酶基因(sdhB)、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因(dcdA)或天冬酰胺合成酶基因(asnO)，发现淀粉酶产色链霉菌聚赖氨酸生物合成中三羧酸循环途径和二氨基庚二酸途径对ε-聚赖氨酸的生产有重要影响。
4、本发明选择一株淀粉产色链霉菌S.diastatochromogenes TUST作为分子生物学操作的出发菌株。通过PCR技术从S.diastatochromogenes TUST菌株的基因组上扩增得到了琥珀酸脱氢酶基因(sdhB)、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因(dcdA)或天冬酰胺合成酶基因(asnO)，利用一种整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，成功构建了能够高效过量表达目的基因的工程菌。该重组菌可以高效利用碳源合成更多的ε-聚赖氨酸，经摇瓶发酵产量分别提高了10.08％、15.95％及12.04％。从发酵角度进一步证实过表达关键基因可以更好的提高发酵液碳源的利用，使菌株能很好的合成ε-聚赖氨酸，有效解决了发酵过程中引起的的问题，有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为本发明中以pIMEP为基础构建pIMEP-sdhB重组质粒的构建图；
图2为本发明中以pIMEP为基础构建pIMEP-dcdA重组质粒的构建图；
图3为本发明中以pIMEP为基础构建pIMEP-asnO重组质粒的构建图；
图4为本发明中对基因表达质粒pIMEP-sdhB菌落的PCR验证图；其中，泳道M：5kbmarker；泳道1：sdhB基因全长验证；泳道2：菌落PCR扩增sdhB片段，筛选阳性转化子；
图5为本发明中对基因表达质粒pIMEP-dcdA菌落的PCR验证图；其中，泳道M：5kbmarker；泳道1：dcdA基因全长验证；泳道2：菌落PCR扩增dcdA片段，筛选阳性转化子；
图6为本发明中对基因表达质粒pIMEP-asnO菌落的PCR验证图；其中，泳道M：5kbmarker；泳道1：asnO基因全长验证；泳道2：菌落PCR扩增asnO片段，筛选阳性转化子；
图7为本发明中工程改造菌株在72h的摇瓶发酵ε-聚赖氨酸相对产量图；以原始菌株TUST作比较，纵坐标表示为高产菌株相对提高值，横坐标表示具体菌株；其中SDHB为基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌SDHB，DCDA为基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌DCDA，ASNO为基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ASNO。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，所述淀粉酶产色链霉菌将不同代谢通路中的三个关键基因琥珀酸脱氢酶基因sdhB、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA或天冬酰胺合成酶基因asnO在Streptomyces diastatochromogenes TUST中分别过量表达得到的。
较优地，所述Streptomyces diastatochromogenes TUST的名称为TUST1，分类名称为Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.3145，保藏日期：2009年6月29日，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴提取原始淀粉酶产色链霉菌TUST的基因组；
⑵以步骤⑴提取得到的基因组为模板，采用PCR技术扩增目的基因，目的基因为琥珀酸脱氢酶基因sdhB、赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA或天冬酰胺合成酶基因asnO；
⑶将步骤⑵得到的目的基因插入整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP的EcoRI/XbaI酶切位点间，得到携带目的基因的重组质粒；
⑷将步骤⑶构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，通过接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌TUST的基因组中，获得所述的工程菌。
较优地，所述携带目的基因的重组质粒的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据所需基因设计引物序列FF/RR，在基因两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的目的基因；
⑵重组质粒的构建：用XbaI和EcoRI双酶切质粒pIMEP，将扩增的目的基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的质粒pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒，化学法转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选转化子保存。
较优地，所述步骤⑶中pIMEP质粒是在pSET 152质粒的基础上在多克隆位点前连入红霉素启动子ermE*构建得到，该质粒为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，能够用于链霉菌中基因的表达。
如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在ε-聚赖氨酸制备方面中的应用。
利用如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，步骤如下：
将基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌接种在贝纳特培养基平板上，在28-37℃培养直至产生分生孢子；
然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28-37℃，150-200rpm，培养24-30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵直至72h，即得ε-聚赖氨酸母液；
其中，每1LM3G培养基的组成为：(NH4)2SO410g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO40.8g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL；
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml 20×MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min；
在使用M3G培养基时，每取90ml M3G，再加入10ml 10×的葡萄糖母液；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。
本发明中使用的培养基组成可以如下：
每1LM3G培养基的组成为：(NH4)2SO410g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO40.8g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL；
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml 20×MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。在使用M3G培养基进行发酵时，取90ml M3G，再加入10ml 10×的葡萄糖母液。
每1L贝纳特培养基的组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水定容至1L；
每1L LB培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，葡萄糖1g/L，NaCl 5g/L，pH自然，加水定容至1L。
本发明中使用的PCR反应体系和条件可以如下：
PCR反应体系：2×phanta max buffer 25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，phanta max×Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，50-65℃退火15s，72℃延伸1min，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应。
更为具体地，通过相关实施例来具体说明：
实施例1
一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌SDHB(Streptomycesdiastatochromogenes SDHB)，构建步骤如下：
(1)目的片段基因的获得：
根据sdhB基因设计引物序列sdhB-FF/sdhB-RR，在基因sdhB两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在sdhB基因核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在sdhB核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的sdhB基因；
所述引物sdhB-FF/sdhB-RR的序列为：
sdhB-FF：SEQ No.2，即5’-tctagaatggcgcatgtggaccgg-3’，下划线序列为XbaI酶切位点；
sdhB-RR：SEQ No.3，即5’-gaattctcaccggctcagctcctcg-3’，下划线序列为EcoRI酶切位点；
所述琥珀酸脱氢酶基因sdhB的序列为SEQ No.1；
(2)含有sdhB基因的重组质粒pIMEP-sdhB的构建：
将PCR扩增的sdhB基因片段用XbaI和EcoRI双酶切，将带有红霉素启动子ermE*质粒pIMEP用XbaI和EcoRI双酶切，再将sdhB基因片段连接到双酶切后pIMEP质粒的相应XbaI和EcoRI酶切位点，得到连接产物重组质粒pIMEP-sdhB。如图1所示。
(3)重组质粒pIMEP-sdhB的转化：
取连接产物重组质粒pIMEP-sdhB加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有安普霉素抗性的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，结果如图4所示，重组质粒pIMEP-sdhB已成功转化到转化子中。
(4)基因工程菌株的获得：
利用结合转移的方法将质粒pIMEP-sdhB整合到淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)基因组中。
首先提取大肠杆菌JM109转化子中的pIMEP-sdhB重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，将转化子涂布于含有卡那霉素100μg/mL、安普霉素50μg/mL和氯霉素25μg/mL抗性的LB平板中，37℃倒置培养24h。挑选大肠杆菌阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温震荡过夜培养，之后按照1％的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD6000.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40mL菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌TUST孢子生长良好的平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mLM3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用，得到萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子。
将处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的贝纳特培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌SDHB。
琥珀酸脱氢酶(sdhB)，也叫复合物II或琥珀酸：醌氧化还原酶(SQR)是参与三羧酸循环(TCA)和氧化磷酸化(OXPHOS)的重要酶，这是产生ATP的两个主要代谢途径。高产菌株SDHB其聚赖氨酸产量较出发菌株有明显的提高，摇瓶发酵72h比原始菌株提高了10.08％。
实施例2
一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌DCDA(Streptomycesdiastatochromogenes DCDA)，构建步骤如下：
(1)目的片段基因的获得：
根据dcdA基因设计引物序列dcdA-FF/dcdA-RR，在基因dcdA两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在dcdA基因核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在dcdA核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的dcdA基因；
所述引物dcdA-FF/dcdA-RR的序列为：
dcdA-FF：SEQ No.5，即5’-tctagagtgcctccgtctgtggagc-3’，下划线序列为XbaI酶切位点；
dcdA-RR：SEQ No.6，即5’-gaattctcatggctctccccctgg-3’，下划线序列为EcoRI酶切位点；
所述赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA的序列为SEQ No.4；
(2)含有dcdA基因的重组质粒pIMEP-dcdA的构建：
将PCR扩增的dcdA基因片段用XbaI和EcoRI双酶切，将带有红霉素启动子ermE*质粒pIMEP用XbaI和EcoRI双酶切，再将dcdA基因片段连接到双酶切后pIMEP质粒的相应XbaI和EcoRI酶切位点，得到连接产物重组质粒pIMEP-dcdA。如图2所示。
(3)重组质粒pIMEP-dcdA的转化：
取连接产物重组质粒pIMEP-dcdA加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有安普霉素抗性的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，结果如图5所示，重组质粒pIMEP-dcdA已成功转化到转化子中。
(4)基因工程菌株的获得：
利用结合转移的方法将质粒pIMEP-dcdA整合到淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)基因组中。
首先提取大肠杆菌JM109转化子中的pIMEP-dcdA重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，将转化子涂布于含有卡那霉素100μg/mL、安普霉素50μg/mL和氯霉素25μg/mL抗性的LB平板中，37℃倒置培养24h。挑选大肠杆菌阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温震荡过夜培养，之后按照1％的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD6000.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40mL菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌TUST孢子生长良好的平板上加入10mL pH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mLM3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用，得到萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子。
将处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的贝纳特培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌DCDA。
赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因(dcda)是二氨基庚二酸途径对聚赖氨酸生物合成的调控基因。菌株DCDA聚赖氨酸产量较出发菌株有明显的提高，在72h时其聚赖氨酸产量较出发菌株明显提高了15.95％。
实施例3
一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ASNO(Streptomycesdiastatochromogenes ASNO)，构建步骤如下：
(1)目的片段基因的获得：
根据asnO基因设计引物序列asnO-FF/asnO-RR，在基因asnO两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在asnO基因核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在asnO核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的asnO基因；
所述引物asnO-FF/asnO-RR的序列为：
asnO-FF：SEQ No.8，即5’-tctagaatgtgcggaatcaccggc-3’，下划线序列为XbaI酶切位点；
asnO-RR：SEQ No.9，即5’-gaattctcagagggcgagttcggg-3’，下划线序列为EcoRI酶切位点；
所述天冬酰胺合成酶基因asnO的序列为SEQ No.7；
(2)含有asnO基因的重组质粒pIMEP-asnO的构建：
将PCR扩增的asnO基因片段用XbaI和EcoRI双酶切，将带有红霉素启动子ermE*质粒pIMEP用XbaI和EcoRI双酶切，再将asnO基因片段连接到双酶切后pIMEP质粒的相应XbaI和EcoRI酶切位点，得到连接产物重组质粒pIMEP-asnO。如图3所示。
(3)重组质粒pIMEP-asnO的转化：
取连接产物重组质粒pIMEP-asnO加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有安普霉素抗性的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，结果如图6所示，重组质粒pIMEP-asnO已成功转化到转化子中。
(4)基因工程菌株的获得：
利用结合转移的方法将质粒pIMEP-asnO整合到淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)基因组中。
首先提取大肠杆菌JM109转化子中的pIMEP-asnO重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，将转化子涂布于含有卡那霉素100μg/mL、安普霉素50μg/mL和氯霉素25μg/mL抗性的LB平板中，37℃倒置培养24h。挑选大肠杆菌阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温震荡过夜培养，之后按照1％的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD6000.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40mL菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌TUST孢子生长良好的平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mLM3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用，得到萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子。
将处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的贝纳特培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ASNO。
天冬酰胺合成酶(asnO)使用天冬氨酸，ATP和氨作为底物催化天冬酰胺合成，天冬酰胺消除了asnC对asnA转录的积极作用，而天冬酰胺不影响asnC的自身调节。高产菌株ASNO比原始菌株TUST较早积累聚赖氨酸，在72小时聚赖氨酸产量与TUST相比提高了12.04％。
利用如上所述的六种基因工程菌株发酵产生聚赖氨酸的方法，具体步骤如下：
将基因工程菌株接种在贝纳特培养平板上，在28-37℃培养7天左右直至产生孢子；然后，将孢子接种至含有100mLM3G培养基的500mL容量摇瓶中，在28-37℃，150-200rpm发酵30h。以6-10％的接种量转移到新的M3G培养基中发酵直至72h，即得ε-聚赖氨酸母液，产量均较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST有不同程度的提高；
结果如图7所示，经过72小时的摇瓶发酵，三种基因工程菌株ε-聚赖氨酸产量与原始出发菌株TUST相比各有不同程度的提升。其中菌株SDHB产量为0.39487g/L，比原始菌株0.35871g/L提高了10.08％，菌株ASNOε-聚赖氨酸产量与TUST相比提高了12.04％，菌株DCDA产量较出发菌株明显提高了15.95％。以上结果充分说明过表达聚赖氨酸生物合成途径如三羧酸循环和二氨基庚二酸途径中关键酶对ε-聚赖氨酸产量有一定的提高效果。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1923
<212> DNA/RNA
<213> 琥珀酸脱氢酶sdhB基因(Unknown)
<400> 1
atggcgcatg tggaccggca gacctgggac gtggtcgtgg tgggcgcggg cggcgccggg 60
ctgcgcgccg ccatcgaggc ccgcgaggcg gggatgcgga cggcggtgat ctgcaagtcc 120
ctgttcggca aggcccatac ggtgatggcc gagggcggca tcgcggccag tatgggcaac 180
gccaacgagc acgacacctg gcaggtgcac ttccgggaca ccatgcgcgg cgggaagttc 240
ctcaaccagt ggcggatggc cgagttgcac gcccgcgagg ccccggaccg ggtctgggag 300
ctggagacct ggggcgcgct cttcgaccgc accgcggacg gccggatctc ccagcgcaac 360
ttcggcggcc acgagtaccc gcggctggcg cacgtcggcg accgcaccgg cctggagctg 420
atccgcaccc tccaacagaa gatcgtctcg ctccagcagg aggacgagcg ggtctccggc 480
tcgtacgagg agggcctgaa ggtcttccag gagtgcaccg tcacccgcgt cctgacgacg 540
gacgggcagg tcgccggcgt cttctgctac gaccgggagt cgggccgctt cttcgtgctg 600
gaggcgccgg ccgtggtgct ggccaccggc ggcatcggca agtccttcaa ggtcacctcg 660
aactcctggg agtacaccgg tgacggtcac gcgctggccc tgctggccgg cgcaccgctg 720
atcaacatgg agttcgtcca gttccatccg accgggatgg tctggccgcc gtcggtcaag 780
ggcatcctcg tcaccgagtc ggtgcgcggc gacggcgggg tgctgcgcaa cagtgacggc 840
aagcggttca tgttcgacta cgtcccggac gtcttcaagg agaagtacgc cgagtccgag 900
gccgagggcg accgctggta cgaggacccc gaccgcaacc gccgcccacc cgagctgctg 960
ccccgcgacg aggtggcgcg ggccatcaac gccgaggtca aggcgggccg cggctccccg 1020
cacggcgggg tcttcctgga cgtctcgacg cgcatgccgg ccgaggtcat cacccgtcga 1080
ctgccgtcca tgcaccacca gttcaaggag ctggcggacg tggacatcac cgccgaaccg 1140
atggaggtcg gcccgacctg ccactacgtg atgggcgggg tggaggtgga cccggacacc 1200
gccgccgcga ccggggtgcc gggcctgttc gccgccggcg aggtggccgg cggcatgcac 1260
ggttcgaacc ggctgggcgg caactccctg tccgacctgt tggtcttcgg gcgccgcgcg 1320
gggctgtacg cggccgagta cgtcggcggg ctgcgcgccc ggccgatccc cgaaccgcgc 1380
ggcatcgacg ccgccgaggc ggaggcgctg cgcccgttca gcgccgagga gggcggcggc 1440
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ggcatcatcc gccgggaggg cgagatggcc gaggcactgg agcggttggc gaagctgcgg 1560
gtgcgggccc gccgggcggg cgtggagggc caccggcagt acaacccggg ctggcacctc 1620
tccctcgacc tgcgcaacat gctgctggtc agcgagtgcg tggcgcgggc ggccctggag 1680
cgcacggaga gccggggcgg gcacacccgg gacgaccatc cgcagatgga ccggcgctgg 1740
cgcaacgtca acctggtctg ccagctcgcc gacgaccggg acgcggcggg cgatccggac 1800
ccggcgctgg ggcagatccg gctctcccgc cgcgagaccc cgccgatccg ccgcgacctg 1860
ttggaactct tcgacaagga cgagctggtg aagtacctga cggacgagga gctgagccgg 1920
tga                                                               1923
<210> 2
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> sdhB-FF(Unknown)
<400> 2
tctagaatgg cgcatgtgga ccgg 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> sdhB-RR(Unknown)
<400> 3
gaattctcac cggctcagct cctcg 25
<210> 4
<211> 1479
<212> DNA/RNA
<213> 赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶dcdA基因(Unknown)
<400> 4
gtgcctccgt ctgtggagcc gctgtctctg gaaccacgcc tggagccgca actggcggcg 60
ctgctgggcg cgggagaact cctcccctcg ctcgtcgacg cgttgggctc gccgttggcc 120
gtggtgctgc ccgaccagat cgccgagaac gccgcgcggt tccgtgccgc gtacggcacc 180
caccgactgg gcggtcaggt cttctacgcg cacaaggcca accgctccag cgcgctgctg 240
cgccggctgg cggcgaccga cacggcggtg gacgtcgcct cgctcggcga gttgcagcac 300
gccctcggcg ccggcttcgc cccggaccgg atcatggcga ccgggccgaa gaaccgcgag 360
ttcctgtggc tcgccgcccg ggtcggcgcc accgtcaacg ccgactcgac cgcggagctg 420
gacgaactgg cggccctggt gcgcgcgcac caactggccc ggatgcgggt gctggtgcgg 480
ctgtccgcct tcgacgggcc cggcgtgcgg gtgctgaccc ggcccagccg gttcggcatc 540
ccggcggggg agttggacac cctgctgaag accgtcgagc ggcacgccga cgtgctcgac 600
ctgacaggcg tcggctacca cctcgacacc accagtgccg aggagaaggc ccgcgccctc 660
gaaggctgcg tgcgggccct ggacgcctgc cggaaccgcg gactgcgccc gcgggcggtg 720
gacatcggcg gcggcttcgg cgtcaactac ctcgcgcacg cggcacagtg ggagcgctac 780
acctccgagc tgaccgccgc cgtgctcggc caccgcccac cgctcacctg gcgcggccac 840
ggctacgggc tccgcaacga cgcgggcacg ctgcgcggcg cgctgggcct ctacccggcc 900
caccgcccgg tcgccggcgc ccgctacctc gacgacctgt tggcgctgcc cgccgcctcg 960
ttcggcggcc ggagcctggc caccctcctg ctggagaacc tctacgacct ctacaccgag 1020
ccggggcggg cgctggtgga ccagtgcggc ctggtggcgg cccgggtgct ggaggtgcgt 1080
cgcacggaca gcggcgagcc gttggtgcgc ctggcgatga aggccgacga cgccgccttg 1140
gaggagcacg gggtgctgat ggacccggtg ctgctcgggc gggacggcgc ccgcgcggtg 1200
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ctgatcaccc gtcggatggt gttcctgccc cgactgcccc gccccgggga gctgttggtc 1320
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cagtactggc cgatcacacg tccaggggga gagccatga                        1479
<210> 5
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> dcdA-FF(Unknown)
<400> 5
tctagagtgc ctccgtctgt ggagc 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> dcdA-RR(Unknown)
<400> 6
gaattctcat ggctctcccc ctgg 24
<210> 7
<211> 1827
<212> DNA/RNA
<213> 天冬酰胺合成酶asnO基因(Unknown)
<400> 7
tcagagggcg agttcgggtc ggtggtggtc cagccacagg gccaggtcga cgacccgttc 60
gaggcggagg cggtggcccc acaccagttg gtcgggcggg gtgtcgaggg cgggcttgag 120
gcgggactcg tcggccaggg cacggacctg ctcgctggac agggcgtcgc gggccagctc 180
ctggaggccg cggttgtagt cggggtggtg ggtggccggg tagtggttct tgggccggtg 240
cagtacggag tcgggcgcga gtccggtgcc ggcggcgcgc agcaggctct tctcccggcc 300
gtcgaaactc ttgtgcgccc agggcgtggc gaaggcgtac tcgacgaggc ggtggtcgca 360
gtaggggacg cggacctcca ggccctgagc catgctcaac cggtccttgc ggtgcaggag 420
ttggcgcagc cagcgggtca gggacaggtg ctgcatctcg cgttggcggt gctcgacggg 480
ggtttcgccg tcccgatgcg gtacggcagc cagcgcgctg cgatacgtgt cctggcggaa 540
ctcccctatt cgcaggtcga gttcggcgtt gagcggcatc gcggcgtcgt cgccgttgac 600
gagcagccac gggaaggtgt ccgcggccag cgccttcgga tggtggaacc agggatagcc 660
gccgaacacc tcgtccgccg cctcaccgga gagggccacg gtggagtgct tgcggatctc 720
gccgaacagc aggtacagcg aggtgtccat gtcgccgacg ccgatcggcg agtccctggc 780
caccacgacc gccttccggt gctcggggtc gagcagggcg tgcgggtcga ggacgacggt 840
gctgtggtcg gtgccgatga acgccccggc ctcggtggcg tacggggtgt cgtggccggt 900
gcgcagcacg tcgccggtga actgctcggc ctggtcgctg tagtcgacgg cgtgggagcg 960
gatccgggcg tccgggcctt gtctcagccg gagttcgtcg gcgagcagcg cggtcaggac 1020
ggtggagtcg atcccgccgg acagcaggct gcacaccggg acgtcggcct ccagctggct 1080
gcgggcggcc gagcagacca gcgcacggac ccgctcgacg gcggtgtccc ggtcgtcgtc 1140
gtggacatcg gcctccagct gccagtagcg gcgttcgcgg atgccgtccc cgtccaggac 1200
gagcagaccg ccgggctcca cctcccgtac gcccgaccac accgtgggcc cggtgttgaa 1260
cagcaggctg tacgcctccc gcaacccgtc ggcgtccacc cggggccgga tctccgggtg 1320
ggcgaacagt gccttgggct ccgaggcgaa ggccaggccg ccgtcgacgg ccgcccagaa 1380
caggggtttg acgccgaggc ggtcgcgtac cagcagcagc cgctgcgccc gctcgtccca 1440
cacggcgaag gcgaacatgc cgtccaggtg gtcggcgacg gcctcgcccc actcggcgta 1500
ggcgcgcagt accacctcgg tgtcgctgcg ggtgcggaag tggtggcccc ggcgccggag 1560
ttcggcccgc agtgcgtgat ggttgtagac ctcgccgctg tagctgagga cgagggccgg 1620
ccgctcgggg cggtcggtca tcggctgtac gccgccggcc aggtcgatga cggccaggcg 1680
gcggtggccg agcgcggcgt gctcgccgag ccagacgccg cgcgcgtccg gtccgcgcgg 1740
ggtgagggtg tcggtcatgg cctcgatgac cggggcctgg gtgcgggcgt cgcggtggaa 1800
ggacgcccag ccggtgattc cgcacat                                     1827
<210> 8
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> asnO-FF(Unknown)
<400> 8
tctagaatgt gcggaatcac cggc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> asnO-RR(Unknown)
<400> 9
gaattctcag agggcgagtt cggg 24

Claims (3)

1.一种高产ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述淀粉酶产色链霉菌将关键基因赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA在Streptomyces diastatochromogenes TUST中过量表达得到的；赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因dcdA的基因序列如SEQ ID No.4所示；
所述Streptomyces diastatochromogenes TUST的名称为TUST1，分类名称为Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.3145，保藏日期：2009年6月29日，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的高产ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌在ε-聚赖氨酸制备方面中的应用。
3.利用如权利要求1所述的高产ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：
将基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌接种在贝纳特培养基平板上，在28-37℃培养直至产生分生孢子；
然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28-37℃，150-200rpm，培养24-30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵直至72h，即得ε-聚赖氨酸母液；
其中，每1LM3G培养基的组成为：(NH4)2SO410 g/L，KH2PO41.36 g/L，K2HPO40.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL；
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml20×MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min；
在使用M3G培养基时，每取90ml M3G，再加入10ml 10×的葡萄糖母液；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L。
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