CN113801834B - 一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用。本发明通过基因工程方法构建重组质粒pIB139‑RelA，并转入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)中构建得到，所述丰加霉素高产粉酶产色链霉菌过量表达天蓝色链霉菌ppGpp合成酶RelA基因，RelA基因过量表达产物可以正向调控丰加霉素生物合成，用于丰加霉素生产。本发明所获得的菌株发酵生产丰加霉素产量至少提高到1568mg/L，是原始菌株产量的10倍，为工业生产提高丰加霉素产量提供新的技术支持。

Description

一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其涉及基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用。

背景技术

丰加霉素是一种核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C1连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。其作用机理主要是通过抑制微生物的转运而影响菌体的生长，可以广泛用于医疗、制药、农业等领域。近年来发现，丰加霉素可以用作农用抗生素，抑制多种植物病原真菌的生长，如黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌等。此外，丰加霉素由于是链霉菌的天然代谢产物，对环境污染小，对植物生长也有一定的调节作用，是一种理想的生物农药。相对于化学合成，生物法合成效率更高，反应条件温和，对环境污染小，生产成本低，是目前合成丰加霉素的主要技术手段。

丰加霉素是链霉菌的次级代谢产物，合成途径复杂，受到微生物内多种调控因子的调控，单一途径基因的调节无法大幅度提高产物的产量。目前丰加霉素的产量较低，还无法进行工业化生产。采用紫外诱变等方式可以提高次级代谢产物的产量，但是由于次级代谢产物筛选困难，需要大规模的筛选才能获得高产菌株。CN201310170658.2、CN201310170665.2、CN201310168066.7、CN201310170674.1、CN201310168980.1、CN201410783862.6、CN201510966008.8等报道了通过加强淀粉酶产色链霉菌部分基因的表达来提高丰加霉素产量以及通过抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的研究，但丰加霉素产量提高有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高丰加霉素发酵产量的方法，通过过表达链霉菌内关键代谢调控因子ppGpp，对胞内的核苷代谢进行调控。同时ppGpp也是链霉菌内代谢的调控因子，可以激活次级代谢途径，激活途径特异性转录调控因子的转录，所以设计通过过量表达天蓝色链霉菌RelA基因，提高淀粉酶产色链霉菌胞内ppGpp合成，从而提高淀粉酶产色链霉菌的丰加霉素产量。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌，其为通过基因工程方法由质粒pIB139和RelA基因构建重组质粒pIB139-RelA，并转入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)中构建得到，所述丰加霉素高产粉酶产色链霉菌过量表达ppGpp合成酶RelA基因，所述RelA基因序列如SEQ ID No.1所示。

所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)在CN201410128610.X、CN201410128645.3中已经公开，其已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No.2060.本发明还提供了一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其包括如下步骤：

1)以天蓝色链霉菌基因组为模板，以引物RelA-F和RelA-D为引物，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RelA基因；

RELA-F的序列为：ggaattccatatgccagacgaggcccagccactgaccg；

RELA-D的序列为：gctctagactaggggtcctcggtctccttctgccagtcg；

2)使用NdeI和XbaI酶切获得RelA基因片段，与NdeI和XbaI双酶切质粒pIB139进行连接，得到连接产物的重组质粒pIB139-RelA；转入大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子保存；所述pIB139是在pSET152质粒上，在多克隆位点添加红霉素启动子PermE*构建获得；重组质粒pIB139-RelA为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒；

3)将pIB139-RelA整合到淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes1628)染色体基因组，获得重组菌株淀粉酶产色链霉菌。

所述的天蓝色链霉菌为天蓝色链霉菌A3(2)Streptomyces coelicolor(genebank:ASM20383v1)，可以购买于北京生物保藏中心。

本发明还提供了一种提高丰加霉素产量的方法，其包括如下步骤：

1)权利要求1所述的基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌菌接种在GYM培养基中，在25-37℃培养到产生分生孢子；

2)将孢子接种到GYM培养基培养基中，在25-37℃，150-200rpm，培养24-30小时，将培养好的种子转接到GYM培养基中发酵直到96h，即可获得丰加霉素母液。

优选的，所述GYM培养基的组成为：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽糖提取物4g/L，酪蛋白提取物1g/L，NaCl 2g/L。

本发明通过基因工程途径在淀粉酶产色链霉菌过量表达RelA基因拷贝，能够激活链霉菌内ppGpp的合成，获得丰加霉素高产菌株，为工业生产提高丰加霉素发酵产量提供技术支持。

用所获得的菌株发酵生产丰加霉素产量提高到1560mg/L，表明RelA基因过量表达可以提高丰加霉素产量。。

附图说明

图1为RelA基因过量表达载体构建示意图。

图2为重组质粒pIB139-RelA的酶切结果。

图3为RelA基因过量表达菌株的PCR鉴定结果。

具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例中大肠杆菌在37℃的液体LB培养基(或者加入1.5％琼脂的固体培养基)中培养，丰加霉素生产菌株淀粉酶产色链霉菌及其工程菌株在28℃的GYM培养基中培养。

实施例1

RelA过表达基因工程菌株的构建：

(1)以天蓝色链霉菌基因组为模板，以引物RelA-F和RelA-D为引物，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RelA基因，与pMD19质粒连接，构建pMD19-RelA载体，将载体导入至E.coli JM109感受态中，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，经过酶切鉴定后送公司进行测序分析。

所述RelA基因序列如SEQ ID No.1所示

所述的引物RelA-F和RelA-D的序列为(下划线为酶切位点)：

RelA-F:GGAATTCcatatgCCAGACGAGGCCCAGCCACTGACCG(SEQ IDNo.2)；

RelA-D:GCtctagaCTAGGGGTCCTCGGTCTCCTTCTGCCAGTCG(SEQ IDNo.3)；

(2)使用NdeI和XbaI酶切载体pMD19-RelA，获得RelA基因片段，与双酶切的pIB139载体连接，如图1所示。得到重组穿梭载体pIB139-RelA，经过酶切验证后(如图2)，得到连接产物的重组质粒pIB139-RelA。

(3)将重组穿梭载体pIB139-RelA加入E.coli ET12567(pUZ8002)感受态细胞中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min，此过程不要移动。在无菌条件下，像离心管中加入900μLLB培养基，吹打混匀后，37℃，200rpm震荡培养45min，将转化产物吸取200μL涂布到含有卡那抗性、氯霉素抗性和安普霉素抗性的LB平板上，将LB平板37℃倒置培养过夜，直到单菌落清晰可见，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证(如图3)筛选获得E.coli ET12567(pUZ8002,pIB139-RelA)。

(4)重组链霉菌1628-RelA菌株的构建。将构建好的E.coli ET12567(pUZ8002,pIB139-RelA)培养到OD₆₀₀为0.4到0.6之间。40mL菌体8000rpm离心收集菌体后，用新鲜的LB洗涤2-3次除去残留的抗生素，重悬到1mL LB中备用。向生长状态良好的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes1628)菌株平板上加入10mL pH 8.0的PBS缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃180rpm震荡2h，随后用无菌脱脂棉过滤，得到孢子悬液。50℃热激10min，冷却至室温，加入等体积的GYM培养基，37℃，180rpm摇床培养3h，9000rpm离心收集孢子，并悬浮于TES溶液中备用。分别取100μL 108供体菌和108受体菌置于离心管中，静置2min，然后涂布在MS平板上，28℃倒置培养16h-18h，用1mL终浓度为100μg/mL的安普霉素和50μg/mL的萘啶酮酸覆盖于之前涂布的MS平板上，培养3-5天后，若菌落生长，则测定为结合子。随后挑取单菌落在安普霉素抗性平板上验证抗性。随后提取转化子的基因组，并通过PCR扩增安普霉素抗性基因，确定将pIB139-RelA整合到淀粉酶产色链霉菌S.diastatochromogenes 1628染色体基因组，获得重组菌株淀粉酶产色链霉菌1628-scRelA，即本发明的基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌。

实施例2:

淀粉酶产色链霉菌原始菌株和重组菌株的发酵性能验证

将基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌和野生型S.diastatochromogenes1628菌株接种在GYM平板上，在25-37℃培养4天，直到产生孢子。然后将孢子接种在60mL新鲜的GYM培养基中，在25-37℃，200rpm的摇床上培养2天，做成种子液。转接到60mL新鲜的GYM培养基中，在25-37℃，150-250rpm的摇床上培养4天，得到丰加霉素母液，采用HPLC法测定丰加霉素产量。如表1所示，重组菌的丰加霉素产量高于原始菌株，重组菌的丰加霉素最终产量达到1568mg/L，且重复性良好。说明在野生型S.diastatochromogenes1628菌株中过量表达RelA基因，有助于提高丰加霉素产量。

表1野生菌和基因工程菌的丰加霉素产量

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1464

<212> DNA

<213> 淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)

<400> 1

ggggtcctcg gtctccttct gccagtcgag cagctggcgc agccacgcca tgtcgttgag 60

gtggtcgtcc ttgctcttgc cggacgactt gggggcgtcg gtgcgcacct tggaggcgcc 120

ggcgacggcc tcctgcttgt acttccagtg cgcggcgatg ccgtactccg cgcggcggtg 180

catgtcgaag gtgcggatct gcagctcgac cggcttgccg ccgggcccga tgaccgtcgt 240

gtgcagcgac tggtacatgt tgaacttggg catcgcgatg tagtccttga accgccccgg 300

aaccgggttc cagcgggcgt ggaccgtgcc gagcgccgcg tagcagtcgc ggacggtgtc 360

caccaggacg cggatgccca ccaggtcgta gatctccgcg aagtcccggc cgcggacgat 420

catcttctgg tagacgctgt agtagtgctt ggggcggccg gtgacggtcg ccttgatgcg 480

ggccgcgcgc aggtcctgct ggacctcgtc ggtgacgacg gcgaggtact cgtcgcgctt 540

gggggctcgc tcggcgacca ggcggacgat ctcgtcgtac atcttggggt agaggatcgc 600

gaaggcgagg tcctccagct cccacttgat ggtgttcatg cccaggcgat gggcgagcgg 660

cgcgtagatc tccagggtct cgcgcgcctt cttctcctgc ttctcgcgct tgaggtagcg 720

catggtgcgc atgttgtgca ggcggtcggc gagcttgatg accaggacgc gcgggtcctt 780

ggccatggcg acgaccatct tgcgcacggt ctcggcctgc gcggcctcgc cgaacttgac 840

cttgtccagc ttggtgacgc cgtcgacgag cagggtgacc acgtcgccga agtcgcggcg 900

caggtcctcc aggccgtact cggtgtcctc gacggtgtcg tgcagcagcc cggccatcag 960

cgtggccgga tccatgccca gctcggcgag gatggtggtg acggcgagcg ggtgcgtgat 1020

gtacgggtcg ccgctcttgc gcttctggcc gcggtgccag cgttcggcga cctggtaggc 1080

ccgctcgatc tggcgcaggg tcgacgtctc gatcttcggg tcgttgccgc gcactatgcg 1140

cagcagcggc tccaggaccg ggttgtacgg gttggcgcgc tgcacgccga ggcgggccag 1200

gcgggcgcgg acgcggttgg aggagccgga gcgggcgggc tgcccggcgg gggcgcggac 1260

cacgggcgcg ttctgcgggc gctcggccgg cagcggcttg gggcgcggct gctgctcggc 1320

cggcttgtcg accggtgcgg ccggggcgtg ctggatcggc ccgtgcgtgt cgttcttcgc 1380

ctggggcgcg ctcggcgcgg gcttcgccgc ggacgccgag gcggactcgg gctttgcggc 1440

ggtcagtggc tgggcctcgt ctgg                                        1464

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaattccat atgccagacg aggcccagcc actgaccg 38

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagact aggggtcctc ggtctccttc tgccagtcg 39

Claims (5)

1.一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌，其特征在于，其为通过基因工程方法由质粒pIB139 和RelA基因构建重组质粒pIB139-RelA，并转入淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）1628中构建得到，所述丰加霉素高产粉酶产色链霉菌过量表达ppGpp合成酶RelA基因，所述RelA基因序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述的基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）以天蓝色链霉菌基因组为模板，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RelA基因，所述RelA基因序列如SEQ ID No.1所示；

2）使用NdeI和XbaI酶切获得RelA基因片段，与NdeI和XbaI双酶切质粒pIB139进行连接，得到连接产物的重组质粒pIB139-RelA；转入大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子保存；所述质粒pIB139是在pSET152质粒上，在多克隆位点添加红霉素启动子PermE*构建获得；重组质粒pIB139-RelA为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒；

3）将重组质粒pIB139-RelA整合到淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces  diastatochromogenes）1628染色体基因组，获得基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1）中，PCR扩增的引物为RELA-F/RELA-D，其序列如下：

RELA-F：GGAATTCCATATGCCAGACGAGGCCCAGCCACTGACCG；

RELA-D：GCTCTAGACTAGGGGTCCTCGGTCTCCTTCTGCCAGTCG。

4.一种提高丰加霉素产量的方法，其包括如下步骤：

1）将权利要求1所述的基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌菌接种在GYM培养基中，在25-37℃培养到产生分生孢子；

2）将孢子接种到GYM培养基培养基中，在25-37℃，150-200 rpm，培养24-30小时，将培养好的种子转接到GYM培养基中发酵直到96 h，即可获得丰加霉素母液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述GYM培养基的组成为：葡萄糖4 g/L，酵母提取物4 g/L，麦芽糖提取物4 g/L，酪蛋白提取物1 g/L，NaCl 2 g/L。

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