CN109554321B

CN109554321B - 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用

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Publication number: CN109554321B
Application number: CN201811465067.7A
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 王苗苗
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: CN109554321A

Abstract

本发明公开了属于基因工程技术领域的一种高产脂肽的基因工程菌及其应用。所述高产脂肽的基因工程菌，其是使原始菌株中芽孢合成第四阶段和第五阶段中的至少一个基因失活构建而成。本发明通过敲除了产脂肽菌株基因组中芽孢合成第四阶段和第五阶段的相关基因，阻断了芽孢的合成，从而得到了无芽孢并且显著提高脂肽含量的基因工程菌。本发明所得基因工程菌在高浓度表面活性素环境下能够保持完整的细胞形态；与出发菌株相比，发酵过程中无芽孢产生且显著提高脂肽产量，摇瓶中表面活性素产量最高达到9.9g/L，比出发菌株提高了25％，细胞活性也得到增强。

Description

一种高产脂肽的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产脂肽的基因工程菌及其应用。

背景技术

脂肽(lipopeptide)类生物表面活性剂是一类由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸链以内酯键连接而成的两性物质，主要由芽孢杆菌、链霉菌等微生物合成。芽孢杆菌脂肽可分为表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等，其中在气/液界面形成独特“马鞍”构象的表面活性素具有优良的表面活性、生物降解性及抗菌活性，在石油开采、生物防治、医药及日化等领域都有广阔的应用前景。但由于芽孢杆菌发酵生产表面活性素产率低限制了表面活性素的工业化生产和应用，同时芽孢杆菌发酵中后期产生大量芽孢休眠体，占用了部分营养源且芽孢在发酵生产结束后灭菌排放时也会有环境安全隐患，这些进一步制约了表面活性素的工业化生产和应用。

目前，提高微生物脂肽发酵水平的方法包括培养条件优化、诱变育种、强化表面活性素跨膜运输、强化表面活性素合成酶表达等。专利文献(CN 101892176A、CN101775427A、WO 2002026961A)等通过对枯草芽孢杆菌发酵生产表面活性素发酵过程中培养基及培养条件进行优化，提高了发酵液中表面活性素的产量。CN101928677A公开了通过紫外诱变处理玫瑰孢链霉菌， US05227294公开了用亚硝基甲替尿烷处理枯草芽孢杆菌，上述文献中的微生物在诱变处理后，其表面活性素合成量都有增加。中国专利文献CN103898038 A 公开了通过强化脂肽由胞内向胞外运输的跨膜蛋白YcxA，枯草芽孢杆菌发酵生产的表面活性素产量提高了97％，中国专利文献CN1554747A公开了在枯草芽孢杆菌中表达comA基因，脂肽产量提高了50％。中国专利文献CN105400784A 通过将脂肽合成酶基因簇启动子替换成诱导型强启动子Pg3，表面活性素产量提高了17.7倍。文献(Dhali D,Coutte F,Arias A A,et al.Biotechnology journal,2017, 12(7):1600574.)公开了敲除枯草芽孢杆菌中催化支链氨基酸生成脂肪酸的BKD 操纵子中的lpdV基因，表面活性素产量提高了1.4倍。

另外，枯草芽孢杆菌中芽孢生成过程已有部分基础研究，芽孢合成的整个过程受多个调控蛋白调控，而这些调控蛋白又与参与胞内的其它代谢途径，如 spo0A与枯草芽孢杆菌胞内500多个基因表达相关(Virginie Molle,et al.Molecular Microbiology，2003,50(5):1683-1701)，通过构建其缺陷型菌株能成功获得无芽孢菌株，但胞内麦芽糖操纵子转录表达受到影响(余志强，枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子PΔglvA整合表达载体的构建及启动子功能的初步探讨[D],2004)，乙偶姻发酵产量减少(李欣.枯草芽孢杆菌芽孢形成阻断及碳流调控对乙偶姻合成的影响[M]，2017)。因此，不合适的芽孢基因敲除方案，不仅不会提高目标产物产量，反而会降低目标产物的产量。敲除何种芽孢合成基因构建无芽孢工程菌来提高表面活性素产量、同时降低枯草芽孢杆菌应用安全隐患的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于为了克服现有技术中的问题，提供一种高产脂肽的基因工程菌，其发酵过程中无芽孢产生并且可以提高脂肽的产量。

本发明的一种高产脂肽的基因工程菌，其是使产脂肽的原始菌株中调控芽胞壁形成的基因中的至少一个失活构建而成，所述调控芽胞壁形成的基因包括 spoIVA、spoIVB、spoIVC、spoIVF、spoVA、spoVB、spoVD和spoVE。

上述调控芽胞壁形成的基因，在不同的菌株中的基因编号不同。其序列，以选择枯草芽孢杆菌模式菌B.subtilis 168中的编号为例，其GeneID分别为：

spoIVA(GeneID:938991)；

spoIVB(GeneID:938654)；

spoIVC(包含spiIVCA(GeneID:937799)和spoIVCB(GeneID:937803))；

spoIVF(包括spoIVFB(GeneID:937505)和spoIVFA(GeneID:937501))；

spoVA(包含spoVAA(GeneID:938734)、spoVAB(GeneID:938933)、spoVAC (GeneID:938733)、spoVAD(GeneID:938932)、spoVAEA(GeneID:8303022)、 spoVAEB(GeneID:8303020)和spoVAF(GeneID:938936))；

spoVB(GeneID:938022)；

spoVD(GeneID:936661)；

和spoVE(GeneID:936953)。

所述失活是指基因不表达或者不完全表达。

所述失活的方法为基因敲除或基因变异。

所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌。

在一实施例中，所述原始菌株中的表面活性素合成酶由诱导型强启动子控制，所述诱导型强启动子为可以选择Pg3。

在一实施例中，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7，于2014年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.8906，并在中国专利文献CN105400784A中公开。

在一实施例中，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA，是指在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7中加入诱导型强启动子Pg3，使强启动子Pg3控制表面活性素合成酶srfA的表达。关于诱导型强启动子Pg3、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA及其具体的制备方法在中国专利文献CN105400784A中公开。

上述基因工程菌的可以按下述方法构建，包括：

(1)扩增原始菌株基因组中需要敲除的目的基因的左、右同源臂和抗生素抗性基因片段，通过搭桥PCR得到用于敲除目的基因且含有抗性基因的线性片段；

(2)将上述线性片段导入原始菌株，筛选得到抗性基因原位替换目的基因的工程菌，得到含有抗性筛选标记的基因工程菌；

(3)将含有cre重组酶基因的质粒转化至含有抗性筛选标记的基因工程菌中，培养筛选得到去除抗性基因的高产脂肽的基因工程菌。

上述基因工程菌的构建方法中，抗生素抗性基因可以选择红霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、状观霉素抗性基因和新霉素抗性基因等。优选的，使用博来霉素抗性基因。

在一实施例中，上述基因工程菌构建方法为：

1、合成两端带有lox位点的抗生素抗性基因。

2、利用需要敲除的目的基因左、右同源臂上下游引物，以原始菌株基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得基因组上位于目的基因上下游的同源臂 left和right片段。

3、搭桥PCR获得left-抗生素抗性基因-right片段并转入原始菌株中，涂布于含有抗生素的LB平板上，挑取阳性克隆进行培养，用left-F和right-R引物进行PCR验证，得到抗生素抗性基因原位替换目的基因的目的基因缺陷菌株。

4、合成识别lox位点的cre重组酶基因，构建含有重组酶的pHK-cre质粒。

5、将质粒pHK-cre导入抗生素抗性基因原位替换目的基因的目的基因缺陷菌株，得到含有cre重组酶基因的目的基因缺陷菌株。

6、挑取上述含有cre重组酶基因的目的基因缺陷菌株接种至LB(含1mM IPTG)培养基中，培养并筛选得到抗生素基因缺失的目的基因缺陷型菌株。

7、将上述抗生素基因缺失的目的基因缺陷型菌株传代培养丢掉质粒 pHK-cre得到无芽孢的高产脂肽的基因工程菌。

上述基因工程菌的制备方法中，left-抗生素抗性基因-right片段的具体构建方法为：

1、以left-F和left-R为上下游引物，以原始菌株基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得位于基因组中目的基因上游的同源臂left基因片段。

2、以right-F和right-R为上下游引物，以原始菌株基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得位于基因组中目的基因下游的同源臂right基因片段。

3、按照公开数据库NCBI上公布的p7z6质粒序列(NCBI：EU541492.1) 合成两端带有lox识别位点的抗生素抗性基因片段bleo。

4、将上述得到的3个基因片段回收后混合做为模板，以left-F和right-R做为上、下游引物进行PCR扩增得到用于目的基因敲除的线性基因片段left-抗生素抗性基因-right。

上述基因工程菌的构建方法中，pHK-cre质粒的具体构建方法为：

1、按照公开数据库NCBI上公布的p06-PgrapA-cre质粒序列(GenBank:MG014197.1)合成编码重组酶的cre基因片段，合成时基因cre上下游分别加上 XbaI和XmaI酶切位点。

2、将合成的cre基因以及穿梭质粒pHK分别进行XbaI和XmaI双酶切，纯化酶切产物，使用T4DNA连接酶将两种酶切产物进行连接，得到连接产物。

3、将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于卡纳霉素的 LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒测序验证，得到含有重组酶cre基因序列的表达质粒。

上述基因工程菌的制备方法中，穿梭质粒pHK的具体构建方法为：

1、以pET28a质粒为模板，以NheI-Kana-F和AflII-Kana-R为引物扩增得到卡那霉素抗性基因Kana

2、将Kana基因及穿梭质粒pHT08分别进行NheI和AflII双酶切，纯化酶切产物，使用T4DNA连接酶将两种酶切产物进行连接，得到连接产物。

3、将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于卡纳霉素的 LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，得到含有卡纳霉素抗性基因的穿梭质粒pHK。

其中，所述引物序列为：

NheI-Kana-F:GCTAGCAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGG

AflII-Kana-R:CTTAAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA

所述质粒pET28a购自于Merck KGa公司，穿梭质粒pHT08购自于MoBiTec 公司。

上述基因工程菌的制备方法中，抗生素抗性基因缺失的方法为：

1、将pHK-cre质粒导入基因组中目的基因被原位替换成抗性基因的工程菌株中，涂布于含卡那霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。

2、挑取平板上的阳性克隆接种于10ml含有IPTG诱导剂的LB培养基中培养，14～20h后取菌液稀释涂布于不含抗生素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。

3、挑取平板上的单菌落接于10uL的无菌生理盐水中混匀制成菌悬液，吸取2uL分别滴在含抗生素的LB平板和无抗性素平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。

4、挑取无抗平板上生长而卡那霉素平板上不生长的菌株即为抗生素基因缺失的工程菌。

本发明的目的也在于提供上述基因工程菌在制备脂肽中的应用。

一种脂肽的制备方法，包括步骤如下：

将上述基因工程菌进行扩大培养后，再进行发酵培养，含有脂肽的发酵液。

所述扩大培养的方法为：在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养10-20h。

所述发酵培养的方法为：在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养1.5-4h，加入诱导剂后继续培养40-60h。

上述方法中，所述发酵培养基的组成可以选择为：糖类30-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源0.5-3g/L，KH₂PO₄ 0.1-1g/L,Na₂HPO₄·12H₂O 0.5-0.3 g/L,CaCl₂ 0.002-0.01g/L,MnSO₄·H₂O 0.002-0.01g/L,FeSO₄·7H₂O 0.002-0.01 g/L,pH 6.5-7.5。

本发明的优点和有益效果：

本发明采用基因工程技术构建基因工程菌，敲除了产脂肽菌株基因组中芽孢合成第四阶段和第五阶段的相关基因，阻断了芽孢的合成，从而得到了无芽孢并且显著提高脂肽含量的基因工程。本发明所得基因工程菌与敲除细胞自营养型进入芽孢合成阶段的关键应答调节蛋白基因spo0A或芽孢形成第三阶段基因 spoIIIE的基因工程菌相比，在高浓度表面活性素环境下能够保持完整的细胞形态；与出发菌株相比，发酵过程中无芽孢产生且显著提高脂肽产量，表面活性素产量最高达到9.9g/L，比出发菌株提高了25％；其中敲除spoIVB基因工程菌，二次接种培养10小时后，细胞数比同等条件的出发菌株最多增长了3.6倍。

附图说明

图1为用于spoIVB缺陷型枯草芽孢杆菌构建示意图。

图2为left、right、bleo和left-bleo-right基因片段PCR电泳图；泳道1为 DNA分子量标准；泳道2为left基因，800bp；泳道3为right基因，800bp；泳道4为bleo基因，650bp；泳道5为left-bleo-right片段，2.2kb。

图3为spoIVB敲除菌验证结果。泳道1为DNA分子量标准；泳道2为原始菌株THY-7/Pg3-srfA用left-F和right-R进行PCR扩增的结果，可得到2.9kb 的条带；泳道3为基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB用left-F和right-R进行 PCR扩增的结果，可得到2.2kb的条带。

图4为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspo0A细胞形态显微镜观测的芽孢图；其中，1为原始菌株细胞形态图，图中箭头所指为芽孢；2为芽孢缺陷型基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspo0A细胞形态图。

图5为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspo0A的发酵液检测表面活性素色谱图。

图6为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE显微镜及透射电镜的细胞形态观测图；其中，1为原始菌株细胞形态显微镜观测图，图中箭头所指为芽孢；2为芽孢缺陷型基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE细胞形态图；3为原始菌株细胞形态透射电镜观测；4为芽孢缺陷型基因工程菌 THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE透射电镜观测细胞形态图。

图7为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB显微镜及透射电镜的细胞形态观测图；其中，1为原始菌株细胞形态显微镜观测图，图中箭头所指为芽孢；2为芽孢缺陷型基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB细胞形态图；3为原始菌株细胞形态透射电镜观测；4为芽孢缺陷型基因工程菌 THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB透射电镜观测细胞形态图。

图8为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB的发酵产物中表面活性素的浓度。

图9为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB二次培养细胞数计数结果。

图10为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoVD显微镜及透射电镜的细胞形态观测图；其中，1为原始菌株细胞形态显微镜观测图，图中箭头所指为芽孢；2为芽孢缺陷型基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoVD细胞形态图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手段。

实施例1用于敲除芽孢基因的线性片段left-bleo-right的构建

构建流程如图1所示，以spoIVB基因、博来霉素抗性基因为例。

按照数据库NCBI上公布的p7z6质粒序列(NCBI：EU541492.1)合成两端带有lox识别位点的博来霉素抗性基因片段bleo，650bp。

使用Omega公司的细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌B.subtilis THY-7基因组。以得到的基因组为模板，使用上游引物left-F和下游引物left-R 进行PCR扩增得到基因组中位于spoIVB基因上游的同源臂left片段。以THY-7 基因组为模板，使用上游引物right-F和下游引物right-R进行PCR扩增得到基因组中位于spoIVB基因下游的同源臂right片段，800bp(如图2所示)。

将上述得到left、bleo和right 3个基因片段混合做为模板，以left-F和right-R做为上、下游引物进行PCR扩增left-bleo-right片段，2.2kb(如图2所示)。

其中，所述引物序列如下：

left-F:GAAAAACATGGGCGAAAAAGCT

left-R:CCTGTGTGAAATTGTTATCCTTCACTACTTCACTCTCCTCGCTCC

right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGACTGCCGGAGTTTCCGGCAG TTT

right-R:ATAGAGATAGCCTTTAATATGGGCT

引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解并稀释至10μM 备用。PCR扩增所用聚合酶、缓冲液和限制性内切酶购自TaKaRa公司。PCR扩增反应体系为：

热循环条件为

同样的，利用上述方法，得到用于敲除spo0A、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、 spoIVF、spoVA、spoVB、spoVD、spoVE基因的含博来霉素抗性基因的线性片段，其中用到的引物序列为：

spo0A-left-F:ATGGACACAAAGAAACCAATTGTAGTGGAGA

spo0A-left-R:CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACGCTTGCTTTTTCT

spo0A-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGACATGAGCTTATTAA GTGGT

spo0A-right-R:CTGCCGAAACGATTCGGCAGTCTTTTTTCCC

spoIIIE-left-F:AATGTTTTCAAAAGGAAACTTAACA

spoIIIE-left-R:

CCTGTGTGAAATTGTTATCCCACCTTACTGCGTTAAAAAATGTAA

spoIIIE-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTGAAGGGAGTTCCGCTTTCTATAGTTGTCAA

spoIIIE-right-R:CTCTTCGTATCATCTTCAGACGGCA

spoIVA-left-F:GTGATCCCCTCCCGGACTTCCTATC

spoIVA-left-R:CTGTGTGAAATTGTTATCCCTTACAAGGATGTGCTATCT CGTGA

spoIVA-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTAAGTGCATCTAAG ATCGTATCAAA

spoIVA-right-R:CGGTAGACCTCTTTATAGAATGGGA

spoIVC-left-F:TATTAAATAATGATAGCAATCGTTA

spoIVC-left-R:CCTGTGTGAAATTGTTATCCTCGTGATGAAATAGGGAAT AGGTTG

spoIVC-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTGCTGCTTACCAAAG CCGGACTCCC

spoIVC-right-R:ACCCCCCTTTTGTAATTACAATCTC

spoIVF-left-F:GAAAATAGAATTATTTACGATCTGG

spoIVF-left-R:CCTGTGTGAAATTGTTATCCTTGCCATCATCCTTTGCATT CGT

spoIVF-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGAAACTGATTGACAA ACGCCTTGTATT

spoIVF-right-R:CCTCCTATATTATGTTTGTGGTCAC

spoVA-left-F:TCATTGATCACCATCTTTCGGTGGT

spoVA-left-R:CCTGTGTGAAATTGTTATCCTTTGGAGATTGAAGCTGAG GATGTT

spoVA-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGGATTTCATAGAAATT ATCCACCACA

spoVA-right-R:AAACTGACTGAAGAGTATGATAATG

spoVB-left-F:TCAATAGAACGAAAAGGAAAAACGC

spoVB-left-R:CCTGTGTGAAATTGTTATCCTTTACCCCCTGCCTTCTCAA ACTAC

spoVB-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTGGTCACGTGCGGTG CCCATCTTTT

spoVB-right-R:GTAGACGATCATCTATTTCATACCA

spoVD-left-F:CTGACTCAGATAAGGAAGAAACAAA

spoVD-left-R:CTGTGTGAAATTGTTATCCAGAGACCGTTCACTCCTTATT TAGG

spoVD-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTTTATTGCAGAAAA AATGCTGATA

spoVD-right-R:CTTCGTCGGCTGTCCGTAAAACGCA

spoVE-left-F:TTTACTGGTGTGAAGCACCGCCTCC

spoVE-left-R:CCTGTGTGAAATTGTTATCCACACCCCAAGCTTAAAGTCA TTAGG

spoVE-right-F:TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTCCAAGCCTCCTGTCT AACATGAAG

spoVE-right-R:AAACTTATTCGTGATGCCCGGCAGG

实施例2 spoIVB缺陷型基因工程菌的构建

将实施例1中构建的用于spoIVB基因敲除的left-bleo-right片段以电穿孔法分别转化枯草芽孢杆菌THY-7和THY-7/Pg3-srfA的感受态细胞，可得到spoIVB 缺陷型基因工程菌THY-7/spoIVB:bleo、THY-7/Pg3-srfA/spoIVB:bleo。其中，枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA感受态细胞的制备及电转化采用中国专利文献 CN105400784A中的方法。

复苏后取100uL菌液涂布于含10-30μg/mL博来霉素的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落，使用上下游引物left-F和right-R 进行PCR验证，验证时同时以原始菌株基因组为模板以上述相同引物PCR做为对照，原始菌株可扩增出约2.9kb条带，spoIVB敲除菌可扩增出约2.2kb条带，验证结果如图3所示，即获得了芽孢合成相关基因spoIVB缺陷型基因工程菌B. subtilis THY-7/spoIVB:bleo和B.subtilis THY-7/Pg3-srfA/spoIVB:bleo。

将含有cre重组酶的质粒pHK-cre分别导入B.subtilis THY-7和 THY-7/Pg3-srfA/spoIVB:bleo中，挑取阳性克隆接种至LB培养基中(含1mM诱导剂IPTG)培养8-10h，稀释涂不含抗生素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落采取种田方式筛选丢失博来霉素基因的B.subtilis THY-7(pHK-cre)和THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB(pHK-cre)。种田方式筛菌过程为：挑取平板上的单菌落于10uL无菌生理盐水中混匀，分别取2uL菌悬液滴于含博来霉素和不含博来霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养，无抗生素平板生长而博来霉素平板不生长的菌株，即为丢失博来霉素抗性基因的工程菌。

分别挑取B.subtilis THY-7(pHK-cre)和THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB(pHK-cre)菌株接种于LB液体培养基中，37℃，200rpm传代培养，稀释涂不含抗生素的LB 平板，种田法筛选最终得到spoIVB缺陷型基因工程菌B.subtilis THY-7ΔspoIVB 和THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB。

将上述基因工程菌，经过扩大培养和发酵培养进行脂肽生产，spoIVB缺陷型基因工程菌B.subtilis THY-7ΔspoIVB和THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB所产脂肽的分别产量优于其原始菌株，但是THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB的脂肽生产增长倍数优于B.subtilis THY-7ΔspoIVB，故选用B.subtilis THY-7/Pg3-srfA作为原始菌株进行下一步实验。

同样的，得到芽孢合成第一阶段基因spo0A缺陷的基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspo0A，芽孢合成第三阶段基因spoIIIE缺失的基因工程菌B. subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE，芽孢合成第四阶段基因spoIVA、spoIVC、spoIVF 缺失的基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIVA、B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIVC、B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIVF以及芽孢合成第五阶段基因spoVA、spoVB、spoVD、spoVE缺失的基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoVA、B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoVB、B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoVD和B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoVE。

实施例3使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspo0A生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspo0A接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

以5％的比例接入装有100mL发酵培养基的摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养2-6h时加入1mM的IPTG，继续培养至2d，发酵结束。

所使用的发酵培养基的组成为：糖类30-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源0.5-3g/L，KH₂PO₄ 0.1-1g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 0.5-0.3g/L,CaCl₂ 0.002-0.01g/L,MnSO₄·H₂O 0.002-0.01g/L,FeSO₄·7H₂O 0.002-0.01g/L,pH 6.5-7.5。

发酵过程中细胞芽孢形态显微镜观测采用文献Bacteriology Proceedings,1959,38-39中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspo0A与出发菌株 THY-7/Pg3-srfA发酵液中菌体细胞形态显微镜观测结果如图4所示，敲除芽孢合成途径中spo0A基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspo0A与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中表面活性素色谱图如图5所示，敲除芽孢合成途径中spo0A基因后，发酵液中未检测出表面活性素。

实施例4使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中菌体细胞形态显微镜观测结果如图6所示，敲除芽孢合成途径中spoIIIE基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵过程中细胞芽孢形态透射电镜观测采用文献Microscopy Research andTechnique 2005,66:307-311中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIIIE与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中菌体细胞形态显微镜观测结果如图6所示：敲除芽孢合成途径中spoIIIE基因后，菌体在高浓度表面活性素(8.4g/L)条件下不能维持正常的细胞形态。

实施例5使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIVA生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVA接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

敲除芽孢合成途径中spoIVA基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIVA表面活性素产量为8.9g/，L比出发菌(7.9g/L) 提高了12.7％。

实施例6使用基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB生产脂肽类表面活性剂 —表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

以5％的比例接入装有100mL发酵培养基的摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养2-6h时加入1mM的IPTG，继续培养至2d，即得到含脂肽的发酵液。

将培养至24h的发酵液接种至新鲜发酵培养基中于37℃、200rpm条件下二次培养，取接种时刻和二次培养10h菌液稀释涂平板计数。

基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中菌体细胞形态显微镜观测结果如图7所示，敲除芽孢合成途径中spoIVB基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中菌体细胞形态显微镜观测结果如图8所示，敲除芽孢合成途径中spoIVB基因后，菌体在高浓度表面活性素(9.9g/L)条件下仍然能维持比较完整的细胞形态。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中表面活性素浓度的统计结果如图9所示：THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB表面活性素产量为9.9 g/，L比出发菌(7.9g/L)提高了25％。

将发酵24h的细胞二次接种，接种0小时及10小时时细胞计数结果如图10 所示：等量接种(初始cfu为1×10⁸)10小时后，THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB细胞数是出发菌株的4.6倍，达到5.15×10⁹/mL(图9所示)。

实施例7使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIVC生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVC接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

敲除芽孢合成途径中spoIVC基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIVC表面活性素产量为8.8g/，L比出发菌(7.9g/L) 提高了11.4％。

实施例8使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoIVF生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVF接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

敲除芽孢合成途径中spoIVF基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoIVA表面活性素产量为9.0g/，L比出发菌(7.9g/L) 提高了13.9％。

实施例9使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoVA生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoVA接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

敲除芽孢合成途径中spoVA基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoVA表面活性素产量为9.1g/，L比出发菌(7.9g/L) 提高了15.2％。

实施例10使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoVB生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoVB接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

敲除芽孢合成途径中spoVB基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoVA表面活性素产量为9.0g/，L比出发菌(7.9g/L) 提高了13.9％。

实施例11使用基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoVD生产脂肽类表面活性剂 —表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoVD接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoVD与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中菌体细胞形态显微镜观测结果如图10所示:敲除芽孢合成途径中spoVD基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoVD表面活性素产量为9.2g/，L比出发菌(7.9g/L) 提高了16％。

实施例12使用基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfAΔspoVE生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例2所得到的芽孢缺陷型的基因工程菌THY-7/Pg3-srfAΔspoVE接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

敲除芽孢合成途径中spoVE基因后，菌体细胞中无芽孢产生。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程THY-7/Pg3-srfAΔspoVE表面活性素产量为8.6g/，L比出发菌(7.9g/L) 提高了8.9％。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用

<140> 2018114650677

<141> 2018-12-03

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gctagcagat cctttgatct tttctacggg g 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cttaagttag aaaaactcat cgagcatcaa a 31

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gaaaaacatg ggcgaaaaag ct 22

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cctgtgtgaa attgttatcc ttcactactt cactctcctc gctcc 45

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgactgccg gagtttccgg cagttt 46

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atagagatag cctttaatat gggct 25

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atggacacaa agaaaccaat tgtagtggag a 31

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacgctt gctttttct 39

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgacatgag cttattaagt ggt 43

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ctgccgaaac gattcggcag tcttttttcc c 31

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aatgttttca aaaggaaact taaca 25

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cctgtgtgaa attgttatcc caccttactg cgttaaaaaa tgtaa 45

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgtgaaggg agttccgctt tctatagttg tcaa 54

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ctcttcgtat catcttcaga cggca 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gtgatcccct cccggacttc ctatc 25

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ctgtgtgaaa ttgttatccc ttacaaggat gtgctatctc gtga 44

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgtaagtgc atctaagatc gtatcaaa 48

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

cggtagacct ctttatagaa tggga 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

tattaaataa tgatagcaat cgtta 25

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

cctgtgtgaa attgttatcc tcgtgatgaa atagggaata ggttg 45

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgtgctgct taccaaagcc ggactccc 48

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

accccccttt tgtaattaca atctc 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gaaaatagaa ttatttacga tctgg 25

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

cctgtgtgaa attgttatcc ttgccatcat cctttgcatt cgt 43

<210> 25

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgaaactga ttgacaaacg ccttgtatt 49

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

cctcctatat tatgtttgtg gtcac 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

tcattgatca ccatctttcg gtggt 25

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

cctgtgtgaa attgttatcc tttggagatt gaagctgagg atgtt 45

<210> 29

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

tcgtgactgg gaaaaccctg gcggatttca tagaaattat ccaccaca 48

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

aaactgactg aagagtatga taatg 25

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

tcaatagaac gaaaaggaaa aacgc 25

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

cctgtgtgaa attgttatcc tttaccccct gccttctcaa actac 45

<210> 33

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgtggtcac gtgcggtgcc catctttt 48

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

gtagacgatc atctatttca tacca 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

ctgactcaga taaggaagaa acaaa 25

<210> 36

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

ctgtgtgaaa ttgttatcca gagaccgttc actccttatt tagg 44

<210> 37

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttttatt gcagaaaaaa tgctgata 48

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

cttcgtcggc tgtccgtaaa acgca 25

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

tttactggtg tgaagcaccg cctcc 25

<210> 40

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

cctgtgtgaa attgttatcc acaccccaag cttaaagtca ttagg 45

<210> 41

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgtccaagc ctcctgtcta acatgaag 48

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

aaacttattc gtgatgcccg gcagg 25

Claims

1.一种产脂肽的基因工程菌，其是使产脂肽的原始菌株中调控芽胞壁形成的基因中的至少一个失活构建而成，所述调控芽胞壁形成的基因为spoIVA、spoIVB、spoIVC、spoIVF、 spoVA、spoVB、spoVD和spoVE；所述原始菌株中的表面活性素合成酶由诱导型强启动子控制；所述原始菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述失活的方法为基因敲除或基因变异。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述诱导型强启动子为Pg3。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7。

5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA，是指在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7中加入诱导型强启动子 Pg3，使强启动子Pg3控制表面活性素合成酶srfA的表达。

6.权利要求1-5任一项所述基因工程菌在生产脂肽中的应用。

7.一种脂肽的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

权利要求1-5任一项所述基因工程菌进行扩大培养后，再进行发酵培养，得到含有脂肽的发酵液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩大培养的方法为：在35-40℃、摇床转速为150-200 rpm的条件下培养10-20 h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的方法为：在35-40 ℃、摇床转速为150-200 rpm的条件下培养1.5-4 h，加入诱导剂后继续培养40-60 h。