EA037039B1 - Штамм гетеротрофных бактерий klebsiella pneumonia 1-17 - ассоциант для получения микробной белковой массы - Google Patents

Штамм гетеротрофных бактерий klebsiella pneumonia 1-17 - ассоциант для получения микробной белковой массы Download PDF

Info

Publication number
EA037039B1
EA037039B1 EA201900129A EA201900129A EA037039B1 EA 037039 B1 EA037039 B1 EA 037039B1 EA 201900129 A EA201900129 A EA 201900129A EA 201900129 A EA201900129 A EA 201900129A EA 037039 B1 EA037039 B1 EA 037039B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
methane
strain
klebsiella pneumonia
oxidizing bacteria
culture
Prior art date
Application number
EA201900129A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201900129A1 (ru
Inventor
Елена Сергеевна БАБУСЕНКО
Валерий Алексеевич Быков
Нина Борисовна ГРАДОВА
Маргарита Витальевна ЛАЛОВА
Леонид Евгеньевич Левитин
Александр Иванович Сафонов
Original Assignee
Ооо "Гипробиосинтез"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ооо "Гипробиосинтез" filed Critical Ооо "Гипробиосинтез"
Publication of EA201900129A1 publication Critical patent/EA201900129A1/ru
Publication of EA037039B1 publication Critical patent/EA037039B1/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 для получения белковой биомассы ассоциативной культурой, включающей метанокисляющие бактерии и бактерии-гетеротрофы. Микробная белковая масса может быть использована в сельском хозяйстве для кормления животных, а также в качестве сырья для глубокой переработки. Техническим результатом изобретения является выявление нового штамма Klebsiella pneumonia 1-17, который является ассоциантом метанокисляющих бактерий и способен использовать продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе, а также продукты метаболизма основной культуры. Технический результат достигнут при использовании штамма гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17, депонированного в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур "ГКПМ-ОБОЛЕНСК" под регистрационным номером В-8465, в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для получения микробной белковой массы.

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 для получения белковой биомассы ассоциативной культурой, включающей метанокисляющие бактерии и бактерии-гетеротрофы. Микробная белковая масса может быть использована в сельском хозяйстве для кормления животных, а также в качестве сырья для глубокой переработки.
На сегодняшний день общая картина в России по производству кормовых белков не благоприятна. Согласно подписанной президентом России доктрины, для обеспечения собственным продовольствием на 80-90%, дефицит кормовых продуктов может составить не менее 2 млн тонн в год.
Основным источником белкового продукта является соевый шрот. Однако природные условия нашей страны не подходят для выращивания сои в достаточных количествах. Специалистам приходится искать другие способы производства кормового белка.
Среди продуцентов кормовой биомассы известны различные микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам, способные расти на различных субстратах.
Использование бактерий в качестве продуцентов кормового белка является более эффективным, так как бактерии накапливают до 79% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%.
В качестве продуцентов белка и биомассы применяют штаммы бактерий, известные как продуценты белка на основе метанола и относящиеся к роду Acetobacter: Acetobacter methylicum ВСБ-924 ЦМПМ В-2942 (патент РФ N 116363, C12N 15/00, 1984); Acetobacter methylicum ВСБ-867 ЦМПМ В-1947 (патент РФ N 925112, C12N 15/00, 1982); Acetobacter methylovorans ВСБ-914 ЦМПМ В-2479 (патент РФ N 1070916, C12N 15/00, 1983). Все штаммы характеризуются содержанием белка до 76% по ACB.
Штаммы различаются чувствительностью к типовым фагам и термоустойчивостью: оптимальный рост у Acetobacter methylicum ВСБ-867 при 28-30°C, у Acetobacter methylicum ВСБ-924 - 30-36°C и Acetobacter methylovorans ВСБ-914 при 36-40°C.
Однако при их нестерильном культивировании в ферментере на ферментолизатах отрубей и/или муки в кислой среде при pH ниже 6,0 происходит, как показали опыты, быстрое инфицирование дрожжами и грибами и вытеснение продуцента из процесса на 30-40% и более от общего числа клеток. В результате в получаемом продукте в сильной степени снижается содержание белка.
Одним из перспективных путей получения полноценного белкового кормового продукта является использование метанокисляющих бактерий. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают метан природного газа, быстро размножаются и наращивают биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными соединениями.
Использование метана природного газа для получения белка одноклеточных имеет ряд преимуществ по сравнению с жидкими углеводородами и другими субстратами, а именно: большие запасы природного газа, хорошая его транспортабельность, возможность получения кормового продукта без дополнительной очистки от субстрата.
Учитывая, что в России большие газовые запасы недр, по некоторым данным они составляют до 40% мировых, внедрение микробиологического производства белка одноклеточных на российских предприятиях сулит не только экономический эффект, но и способно обеспечить продовольственную безопасность страны.
Облигатные метанокисляющие бактерии, содержат фермент метанмонооксигеназу, который не является субстратспецифичным и может окислять не только метан, но и гомологи метана (например, этан, пропан и бутан), содержащиеся в природном газе.
В зависимости от состава природного газа, видовых особенностей метанокисляющих бактерий и условий культивирования среди продуктов неполного окисления метана и его гомологов могут присутствовать в разных соотношениях в среде культивирования метанол, формальдегид, формиат, этанол, ацетальдегид, ацетат, пропионовый альдегид, пропионовая кислота, масляный альдегид. Данные продукты при их накоплении в среде культивирования в определённой концентрации оказывают ингибирующее воздействие на метанокисляющую культуру, на окисление метана.
Стабильное непрерывное культивирование на природном газе возможно только при использовании ассоциативной культуры метанокисляющих микроорганизмов и гетеротрофных микроорганизмов спутников, использующих продукты неполного окисления гомологов метана, возможно и продуктов автолиза клеток микроорганизмов.
В настоящее время установлено, что даже при использовании моносубстрата, в случае накопления в среде продуктов неполного окисления, целесообразно использовать не чистую культуру, а ассоциативную. При культивировании ассоциативной культуры заметно повышается активность роста основной культуры и ее устойчивость к стрессовым воздействиям некоторых физико-химических параметров.
Известен штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК №214 - продуцент фермента дезоксирибонуклеазы, на основе которого могут быть созданы лекарственные препараты (патент РФ №2057178). ДНК-азу получают путем выращивания штамма на жидкой или плотной питательной среде, осаждением биомассы, ультразвуковой дезинтеграцией и центрифугированием. Из надосадочной жидкости извлекают дезоксирибонуклеазу.
Известен штамм Klebsiella azeanae ВКМ В-2008Д - продуцент эндонуклеазы рестрикции (патент РФ
- 1 037039 № 2044055). Данный фермент узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5'-PuGGNClCPy-3'.
Рестриктаза, продуцируемая штаммом может найти применение в генно-инженерных исследованиях.
Известен штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК № 215, используемый в качестве референс-штамма для определения каталазной активности микроорганизмов при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов (патент РФ № 2070923).
Известен штамм Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-7001, который содержит конъюгативную плазмиду рВК1, детерминирующую устойчивость данного сообщества микроорганизмов к соединениям мышьяка. Использование предложенного штамма позволяет получить штаммы бактерий-биодеструкторов соединений, содержащих мышьяк (патент РФ № 2260044).
Известен штамм Methylococcus capsulatus ВСБ-874 - продуцент кормовой биомассы. Штамм хранится в коллекции культур института ВНИИгенетика под коллекционным номером ЦМПМ В-1743 (авт.свид.СССР № 770200). В качестве источника углерода и энергии штамм использует метан как чистый, так и в составе природного газа. Недостатком данного штамма является его чувствительность к продуктам, образующимся при соокислении гомологов метана, которые неизменно, в большем или меньшем количестве, присутствуют в природном газе. Образующиеся продукты ингибируют рост продуцента.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 регистрационный номер ВКПМ В-12549 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов для получения микробной белковой массы (патент РФ № 2613365).
Целью изобретения является повышение производительности и достижение высокой продуктивности при культивировании на природном газе метанокисляющих бактерий в присутствии гетеротрофных бактерий в качестве ассоцианта продуцента микробной белковой массы.
Техническим результатом изобретения является выявление нового штамма, который является ассоциантом метанокисляющих бактерий и способен использовать продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе, а также может использовать белки, аминокислоты и полисахариды, выделяющиеся в процессе лизиса бактерий.
Технический результат достигнут при использовании штамма гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17, депонированного в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМ - ОБОЛЕНСК под регистрационным номером В-8465, в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для получения микробной белковой массы.
Обозначение штамма, присвоенное депозитором 1-17.
Штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 используется в качестве одного из компонентов ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для промышленного получения на основе природного газа кормовой биомассы для кормления животных, а также в качестве сырья для глубокой переработки.
Источник выделения штамма: заявляемый гетеротрофный штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 выделен из ассоциации, включающей метанокисляющие бактерии Methylococcus capsulatus ГБС-15. Для селекции быстрорастущей смешанной культуры бактерий была использована смесь активных накопительных культур, выделенных из подземных вод ряда газо- и нефтеносных районов Российской Федерации.В результате проведенной селекции получен штамм, который при культивировании метанокисляющих бактерий в промышленных условиях на природном газе может быть использован в составе различных ассоциаций. При ферментации штамм растет как ассоциант основного продуцента метанокисляющих бактерий на минеральной среде и при физико-химических условиях, оптимальных для продуцента, потребляет продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе, а также продукты метаболизма основного продуцента.
Штамм не является генетически модифицированным.
Информация о биологической опасности (безопасности) штамма: вид Klebsiella pneumoniae значится в списке IV группа патогенности (Приложение 1 Классификация микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний... к Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами, в ред. Дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N 86).
Другие сведения о патогенности или вирулентности штамма: штамм Klebsiellap neumoniae 1-17 является авирулентным, не токсигенным, не токсичным и безвредным.
Характерные признаки
Обозначение штамма, присвоенное депозитором Klebsiella pneumoniae 1-17. Методы и результаты идентификации: масс-спектрометрия MALDI Biotyper (Score Value 2,561), VITEK 2 (Вероятность 98%), секвенирование последовательности гена 16S -р РНК (99%), полногеномное секвенирование.
Морфологические признаки: грамотрицательные палочки размером 0,5-0,9х 1,0-1,2 мкм, неподвижные, спор не образуют.
Культуральные особенности: на питательном агаре ГРМ № 1 (ФБУН ГНЦ ПМБ) образует гладкие, полупрозрачные, слизистые колонии, 3-4 мм в диаметре. Биохимические свойства: VITEK 2 Systems: 06.01 (bioMerieux) (табл. 1)
- 2 037039
Таблица 1
№ n/n Условное обозначе ние Тест Резуль тат № п/п Условное обозначе ние Тест Резуль тат
1. АРРА Ala-Phe-Pro-ариламидаза - 25. IARL L-арабитол -
2. H2S продукция сероводорода - 26. dGLU D-глюкоза +
3. BGLU β-глюкозидаза + 27. dMNE D-манноза +
4. PROA пролинариламидаза 28. Ту г А тирозинариламидаза +
5. SAC сахароза + 29. CIT цитрат натрия +
6. ILATK L-лактат (алкалинизация) + 30. NAGA β-Ν- ацетилгалакгозаминидаза -
7. GlyA глицин-ариламидаза + 31. IHISa L-гистидин (ассимиляция) -
8. O129R вибриостатический агент 0/129 (2,4-диамино-6,7диизопропилптеридин) + 32. ELLM эллман -
9. ADO адонитол + 33. dCEL D-целлобиоза +
10. BNAG бета-N- ацетилглюкозаминидаза - 34. GGT гамма-глютамилтрансфераза +
11. dMAL D-мальтоза + 35. BXYL β-ксилозидаза +
12. LIP липаза - 36. URE уреаза -
13. dTAG D-тагатоза + 37. MNT маланат +
14. AGLU а-глюкозидаза - 38. AGAL а- галактозидаза +
15. ODC орнитиндекарбоксилаза - 39. CMT кумарат +
16. GGAA Glu-Gly-Arg-ариламидаза - 40. ILATa лактат (ассимиляция) -
17. PyrA L-пирролидонариламидаза + 41. BGAL β-галактозидаза +
18. AGLTp глутамилариламидазарХ А + 42. OFF ферментация глюкозы -1-
19. dMAN D-маннитол + 43. BALap З-аланинариламидазарХА -
20. PLE палатиноза + 44. dSOR D-сорбитол +
21. dTRE D-трегалоза + 45. 5KG 5-кето-О-глюконат -
22. SUCT Сукцинат (алкалинизация) + 46. PHOS фосфатаза +
23. LDC лизиндекарбоксилаза + 47. BGUR β-глюкоронидаза -
23. LDC лизиндекарбоксилаза + 47. BGUR β-глюкоронидаза -
24. IMLTa L-малат (ассимиляция) -
Вирулентность для лабораторных животных:
ЛД50 для мышей линии BALB/c - 3,2х108 КОЕ
Устойчивость (чувствительность) к антибактериальным препаратам (табл. 2)
Таблица 2
Антибиотик МИК, мкг/мл Категория Антибиотик МИК, мкг/мл Категория
Ампициллин >32 R Амикацин <2 S
Ампициллин/сульбактам 4 S Гентамицин < 1 S
Цефуроксим 4 S Тобрамицин < 1 S
Цефуроксимаксетил 4 S Налидиксовая кислота <2 S
Цефокситин < 4 S Ципрофлоксацин < 0,25 S
Цефтазидим <1 S Тетрациклин <1 S
Цефтриаксон < 1 S Тайгециклин 2 S
Цефоперазон/ сульбактам <8 S Нитрофурантоин 64 I
Цефепим < 1 S Хлорамфеникол <2 S
Имипенем < 1 S Бисептол <20 S
Эртапенем < 0,5 S
Генетические характеристики: сделано полногеномное секвенирование на платформе Illumina MiSeq. Количество полученных ридов - 2087324, количество проанализированных нуклеотидов - 469180422, количество контигов (программа SPAdes3.11.1) - 531, общая длина полученных контигов - 5627276 пар нуклеотидов, средняя глубина покрытия - 88, GC состав - 57,01%.
В сборке контигов определена последовательность гена 16Sp РНК и проанализирована в базе данных BLAST Nucleotide collection (nr/nt) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Гомология гена 16SpPHK исследуемого штамма с геном 16S рРНК референсного штамма Klebsiella pneumonia subsp. Pneumonia HS11286 (CP003200.1) составляет 99% (1526/1527). Последовательность участка гена 16Sp РНК штамма Klebsiella pneumonia 1-17:
AGGTGATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCA TGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAA CCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGT AGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACT CCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCT CTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACT TGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGC CGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACA TTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGC ACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTGTGGATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGT TGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTG
- 3 037039
AGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGA AGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACC AGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCC AGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACA CCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCC CAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTAC GCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGG AGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCGATGAGGTTATTAACCTTACG CCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCA TGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGG AGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGG ATCGTCGCCTAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATC TGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACATTATGCGGTATTA GCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACC CGTCCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGCTCGACTTGCATGT GTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCT
Условия культивирования: плотная или жидкая питательная среда - ГРМ № 1, ГРМ-бульон, питательный агар или питательный бульон, 34°C, 24 ч; минеральная среда, в которую в качестве источника углерода вносят либо метанол, либо этанол, либо пропанол, 40°C, 36-48 ч.
Питательный агар, состав (в пересчете на 1 л готовой среды): гидролизат ферментативный белковый, сухой - 10,5 г; пептон ферментативный, сухой - 10,5 г; экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 2,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; агар микробиологический - 12,0 г. Стерилизовать при температуре 121°C в течение 15 мин.
Питательный бульон, состав (в пересчете на 1 л готовой среды): гидролизат фермативный белковый, сухой - 9,1 г; пептон ферментативный сухой - 9,9 г; экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 4,7 г; натрия хлористый - 5,0 г; натрий углекислый - 0,3 г. Стерилизовать при температуре 121°C в течение 15 мин.
ГРМ-№ 1 (состав среды, г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 15,0, панкреатический гидролизат казеина - 10,0, дрожжевой экстракт - 2,0, натрия хлорид - 3,5, Д-глюкоза - 1,0, агар 10,0±2.
ГРМ - бульон (состав среды, г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 8,0, пептон сухой ферментативный - 8,0, натрия хлорид - 4,0
Минеральная среда (состав среды, г/л): (NH4)2SO4 - 0,52; MgSO4 - 0,02; K2SO4 - 0,06; NH4H2PO4 - 1,53. Раствор микроэлементов (готовится отдельно) (г/л): ZnSO4 - 0,43; MnSO4 - 0,88; CuSO4 - 0,78; H3BO3 - 0,4; N2MOO4X2H2O - 0,25; COSO4X7H2O - 0,25; FeSO4x7^O - 4,97.
мл приготовленного раствора микроэлементов добавить на 1000 мл минеральной среды. Стерилизовать при температуре 121°C в течение 15 мин. pH доводят до 6.0-6,2.
В качестве субстрата (источника углерода и энергии) могут быть использованы - метанол (до 1,5 об.%), этанол (до 2 об.%), пропанол (до 1 об.%). Температура культивирования 40°C; аэробные условия.
Условия хранения: штамм хранят на питательном агаре (при температуре 4±2°C), пересевы осуществляются 1 раз в 3 месяца, возможно хранение штамма в лиофильно высушенном состоянии, а также в жидком азоте.
Таким образом, для заявляемого штамма характерны:устойчивый продуктивный рост на средах различного состава; способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии; отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность
Штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 используется в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для промышленного получения кормовой биомассы на основе природного газа, а также в качестве сырья для глубокой переработки.
Гетеротрофные бактерии Klebsiella pneumoniae 1-17 используют образующиеся продукты (метанол, этанол, пропанол) в качестве источника углерода, тем самым снимая ингибирующее действие на основной продуцент. Кроме того, гетеротроф может использовать белки, аминокислоты и полисахариды, выделяющиеся в процессе лизиса бактерий.
Метанокисляющие бактерии развиваются за счет метана природного газа, а другой компонент ассоциативной культуры - за счет продуктов соокисления гомологов метана в природном газе и за счет продуктов жизнедеятельности метанотрофа.
В процессе совместного выращивания их содержание независимо от величины засева находится на уровне, определяемом количеством используемых продуктов, образующихся в результате соокисления газообразных гомологов метана, находящихся в природном газе, так как на минеральной среде эти продукты являются единственным доступным источником углерода для не использующего метан компонента ассоциативной культуры. В результате такой саморегуляции содержания культур в процессе выращивания начальное соотношение клеток культур в засевном материале не имеет существенного значения, но рекомендуется вносить не окисляющих метан микроорганизмов не менее 0,1% и не более 15% от общего числа клеток. Отклонение от этих значений в ту или иную сторону может привести в первом случае к задержке развития метанокисляющих бактерий, а во втором к задержке роста гетеротрофных бактерий. В смеси с подобранными не использующими метан бактериями выход биомассы увеличивается в 3-5 раз по сравнению с чистой культурой метанокисляющих бактерий. Таким образом, добавление к метанокисляющим бактериям подобранных не использующих метан гетеротрофов, растущих за счет продуктов
- 4 037039 соокисления гомологов метана, может повысить выход биомассы на метане. Добавление не окисляющих метан гетеротрофных бактерий не влияет на качество биомассы, так как даже при введении в высокой концентрации гетеротрофов, не использующих метан, их содержание в растущей культуре ограничивается количеством доступного источника углерода, которым являются продукты соокисления гомологов метана, и обычно не превышает 1-15% от общего числа клеток.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей (г/л): (NH4)2SO4 - 0,52; MgSO4 - 0,02; K2SO4 - 0,06; NH4H2PO4 - 1,53. Среду стерилизуют при температуре 121°C в течение 15 мин.
Раствор микроэлементов (готовят и стерилизуют отдельно) (г/л): ZnSO4 - 0,43; MnSO4 - 0,88; CuSO4 0,78; H3BO3 - 0,4; Na2MoO4x2H2O - 0,25; CoSO4x7H2O - 0,25; FeSO4x7H2O - 4,97. 1 мл приготовленного раствора микроэлементов добавляют на 1000 мл минеральной среды. pH доводят до 6.0-6,2. В качестве субстрата (источника углерода и энергии) используют метанол - 1,0%.
Культивирование штамма проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0,3-0,4 в термостатируемой качалке. Культивирование проводят в течение 48 ч при 34°C и pH 6,0. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 8,2 г ACB/л. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л (рабочий объем 7 л) или в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем 28 л).
Пример 2.
Культивирование штамма проводят аналогично примеру 1, но в качестве источника углерода и энергии используют этанол - 1,6%. Физико-химические условия и время культивирования те же, концентрация сухих веществ - 10 г ACB/л.
Пример 3.
Культивирование штамма проводят аналогично примеру 1, но в качестве источника углерода и энергии используют пропанол - 0,5%. Физико-химические условия и время культивирования те же, концентрация сухих веществ - 3,0 г ACB/л.
Пример 4.
Ассоциативную культуру, состоящую из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС15 и гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 выращивают в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л (рабочий объем 7 л) на минеральной среде следующего состава (г/л): НзРО4(80%) - 17,2; K2SO4 - 5,0; MgSO4x7H2O - 4,0; FeSO4x7H2O - 0,21; CuSO4 - 0,78; MnSO4x4H2O - 0,38; ZnSO4x7H2O - 0,06; H3BO3 - 0,4; Na2MoO4x2H2O - 0,009; CoSO4x7H2O - 0,0095.
В качестве источника азота и титрующего агента подают аммиачную воду. Процесс ведут при температуре 40-45°C, pH 5,4-5,8 и непрерывной подаче газовой смеси, содержащей метан и кислород. При достижении концентрации биомассы 9 г ACB/л переходят на непрерывный процесс культивирования с коэффициентом разбавления среды D=0,25 ч-1. Доминирование метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 составляло 93% при концентрации биомассы 18,5 г ACB/л.
Пример 5.
Ассоциативную культуру, состоящую из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС15 и гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 выращивают в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем 28 л) на минеральной среде следующего состава (г/л): H3BO3(80%) - 17,2; K2SO4 - 5,0; MgSO4 x7H2O - 4,0; FeSO4x7H2O - 0,21; CuSO4 - 0,78; MnSO4x4H2O - 0,38; ZnSO4x7H2O 0,06; H3BO3 - 0,25; Na2MoO4x2H2O - 0,009; CoSO4x7H2O - 0,0095.
В качестве источника азота и титрующего агента подают аммиачную воду. Процесс ведут при температуре 41-45°C, pH 5,4-5,7 и непрерывной подаче газовой смеси, содержащей метан и кислород. При достижении концентрации биомассы 9-10 г ACB/л осуществляют постепенное повышение давления до 0,8 МПа. С увеличением давления постепенно увеличивают подачу газообразных источников питания микроорганизмов. При этом показатели процесса были следующими: D=0,30 ч-1, концентрация биомассы 37 г ACB/л, доминирование метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 93%.

Claims (1)

  1. Штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМ-ОБОЛЕНСК под регистрационным номером В-8465, в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для получения микробной белковой массы.
EA201900129A 2018-10-11 2019-03-28 Штамм гетеротрофных бактерий klebsiella pneumonia 1-17 - ассоциант для получения микробной белковой массы EA037039B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018136037A RU2687137C1 (ru) 2018-10-11 2018-10-11 Штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia - ассоциант для получения микробной белковой массы

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201900129A1 EA201900129A1 (ru) 2020-04-30
EA037039B1 true EA037039B1 (ru) 2021-01-29

Family

ID=66430660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201900129A EA037039B1 (ru) 2018-10-11 2019-03-28 Штамм гетеротрофных бактерий klebsiella pneumonia 1-17 - ассоциант для получения микробной белковой массы

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JP2020058339A (ru)
EA (1) EA037039B1 (ru)
RU (1) RU2687137C1 (ru)
WO (1) WO2020076191A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2717991C1 (ru) * 2019-07-22 2020-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ"ООО " ГИПРОБИОСИНТЕЗ" Белковая кормовая добавка для сельскохозяйственных животных и рыб
RU2720121C1 (ru) * 2019-10-29 2020-04-24 Ооо "Гипробиосинтез" Способ получения микробного белка на основе углеводородного сырья

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3930947A (en) * 1973-12-26 1976-01-06 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing microbial cells from methane
US5876982A (en) * 1995-01-26 1999-03-02 Bioeurope Strain of Klebsiella pneumoniae, subsp. pneumoniae, and a process for the production of a polysaccharide containing L-fucose
RU2221864C2 (ru) * 2002-02-07 2004-01-20 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина Штамм бактерий klebsiella pneumoniae, депонированный в вгнки под № 23 мгавмиб-деп, для производства вакцины против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1788965A3 (en) * 1991-03-26 1993-01-15 Poctobckий-Ha-Дohу Haучho-Иccлeдobateльckий Иhctиtуt Эпидemиoлoгии, Mиkpoбиoлoгии, Пapaзиtoлoгии И Гигиehы Strain of bacteria klebsiella pneumonia usable for lipopolysaccharide preparation
RU2083663C1 (ru) * 1994-05-19 1997-07-10 Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE 232 - ПРОДУЦЕНТ β -ГЕМОЛИЗИНА
CN104774792B (zh) * 2015-04-13 2017-12-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株耐受高浓度甲醇的甲基单胞菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3930947A (en) * 1973-12-26 1976-01-06 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing microbial cells from methane
US5876982A (en) * 1995-01-26 1999-03-02 Bioeurope Strain of Klebsiella pneumoniae, subsp. pneumoniae, and a process for the production of a polysaccharide containing L-fucose
RU2221864C2 (ru) * 2002-02-07 2004-01-20 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина Штамм бактерий klebsiella pneumoniae, депонированный в вгнки под № 23 мгавмиб-деп, для производства вакцины против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных

Also Published As

Publication number Publication date
RU2687137C1 (ru) 2019-05-07
EA201900129A1 (ru) 2020-04-30
JP2020058339A (ja) 2020-04-16
WO2020076191A1 (ru) 2020-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2613365C1 (ru) Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 для получения микробной белковой массы
Sukkhum et al. A novel poly (L-lactide) degrading actinomycetes isolated from Thai forest soil, phylogenic relationship and the enzyme characterization
CN114921385B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在饲料添加和无抗养殖中的应用
CN113549578A (zh) 一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13及其应用
KR102150330B1 (ko) 축산분뇨에 대한 악취저감 효능을 갖는 오시아노바실러스 속 신규 균주들 및 이들을 포함하는 가축분뇨 악취저감 조성물
Liu et al. Stimulation of nisin production from whey by a mixed culture of Lactococcus lactis and Saccharomyces cerevisiae
CN113846039A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN116496945A (zh) 一种烟草谷氨酸杆菌n1及其应用
EA036408B1 (ru) Штамм гетеротрофных бактерий stenotrophomonas acidaminiphila gbs-15-2 - ассоциант для получения микробной белковой массы
CN114015607B (zh) 一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用
EA037039B1 (ru) Штамм гетеротрофных бактерий klebsiella pneumonia 1-17 - ассоциант для получения микробной белковой массы
RU2687135C1 (ru) Штамм гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii - ассоциант для получения микробной белковой массы
KR20030096276A (ko) 발효성당 및 그의 혼합물로부터 l(+)-락테이트를생산하기 위한 호열성 미생물 바실러스 코아귤란스 균주sim-7 dsm 14043 및 그의 혼합물
CN106164249A (zh) 用于基于蔗糖的改善精细化学品产生的修饰微生物
RU2745093C1 (ru) Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы
KR101898660B1 (ko) 바실러스 리케니포미스 sn1 균주 및 이를 포함하는 친환경음식물쓰레기처리제제
JP2000037196A (ja) アンモニア耐性l(+)−乳酸産生能菌およびl(+)−乳酸の生産方法
KR101898662B1 (ko) 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 kj5 균주 및 이를 포함하는 친환경음식물쓰레기처리제제
CN106834165B (zh) 可降解青霉素的副球菌、细胞级分及其组合物
CN109554321B (zh) 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用
EP4166646A1 (en) Method for isolating lactic acid bacteria (lab) from complex samples
Omran Production of keratinases from Nocardiopsis sp. 28ROR as a novel Iraqi strain
CN110343636B (zh) 一种斯塔普氏属菌株及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用
Kantha et al. Synergistic growth of lactic acid bacteria and photosynthetic bacteria for possible use as a bio-fertilizer
US20230002796A1 (en) Method for inducing microbial mutagenesis to produce lactic acid

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU