JP2000037196A

JP2000037196A - アンモニア耐性ｌ（＋）−乳酸産生能菌およびｌ（＋）−乳酸の生産方法

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Publication number: JP2000037196A
Application number: JP10209713A
Authority: JP
Inventors: Mitsuyasu Okabe; 満康岡部
Original assignee: Musashino Chemical Laboratory Ltd
Current assignee: Musashino Chemical Laboratory Ltd
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2000-02-08
Anticipated expiration: 2018-07-24
Also published as: JP4132253B2; CN1254016A; CN1252244C

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なリゾプス属に属するアンモニア耐性を
有するＬ（＋）−乳酸産生能菌、およびこれを用いた高
収率でＬ（＋）−乳酸を製造する方法を提供する。【解決手段】リゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus
sp.MK96）株をニトロソグアニジンで変異して得られ
たアンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸産生能菌、特
に、リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６（Rhizopus
sp.MK96-1156）菌株を使用すること好ましい。Ｌ
（＋）−乳酸は、上記菌株を好気的に培養してＬ（＋）
−乳酸を生産することができ、培養液のｐＨの調整がア
ンモニアの添加によることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リゾプス属に属す
るアンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸産生菌および
当該菌を用いてＬ（＋）−乳酸を生産する方法に関し、
より詳細には、親株であるリゾプス・エスピーＭＫ９６
（Rhizopus sp.MK96）をニトソログアニジンで変異し
て得られたアンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸産生
菌、すなわちリゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６自
体、及びこれを用いて好気的な条件においてアンモニア
を中和剤として培養液のｐＨを調整し、高収率でＬ
（＋）−乳酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】乳酸は、食品添加物として清酒、清涼飲
料、漬物、醤油、製パン、ビールなどの製造に使用さ
れ、また、皮革、繊維、プラスチックなどの工業用に利
用される有用な化合物である。

【０００３】現在、発酵法による乳酸の生産には、分裂
菌類に含まれるラクトバシラス（Lactobacillus）、ラ
クトコッカス（Lactococcus）などのいわゆる乳酸菌と
呼ばれる細菌を嫌気的に培養する乳酸発酵が一般的に行
われている。乳酸菌培養は、糖、澱粉などを主原料とし
て、これに酵母エキスなどの栄養源を副原料として加え
た培地が使用されている。これらラクトバシラス（Lact
obacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）などのバ
クテリアによる乳酸発酵は簡単で、しかも乳酸が高収率
で得られるという利点があるが、一般に酵母エキスなど
の副原料は高価であるため、得られるＬ（＋）−乳酸も
高価となる。また、これらのバクテリアは１μｍ以下程
度の大きさのため培地との分離が容易でなく、培養処理
の作業性が悪い。

【０００４】一方、リゾプス属などの糸状菌を用いて炭
酸カルシウムを含む培養液中で、好気的培養により乳酸
を生産する方法がある。糖からの乳酸の収率は７０〜８
０％程度であるが、グルコースなどの単糖を炭素源とで
きかつ培地成分として糖以外に少量の無機塩のみの要求
ですむことから、発酵後の培地中の不純物を比較的少な
くできる。例えば、クリストコフ等（L.Kristofikova,
M.Rosenberg, A.Vlnove, J.Sajbidor and M.Certik Fol
ia Microbiol, 36(5), 451-455 (1991)）は、リゾプス
・アリズスＣＣＭ８１０９(Rhizopus arrhizus CCM810
9)から、グルコースを炭素源として７９ｇ／リットルの
乳酸を生産している。

【０００５】また、リゾプス・オリゼＮＲＲＬ３９５
（Rhizopus oryzae NRRL395）の菌体を用いて乳酸を生
産する方法もある。例えば、ヤング等により（C. W. Ya
ng, Zhongjing Lu and Geroge T. Tsaso; Applid Bioc
hemistry and Biotechnology vol 51/52 p57-71, 199
5）、当該菌体を好気的条件下で培養し、炭酸カルシウ
ムを添加した培養液で収率７８％で乳酸を産生する方法
が開示されている。

【０００６】また上記リゾプス属の菌体は集合体（ペレ
ット）となりやすく、簡単に培地と分離できるため発酵
後の培地から乳酸と当該ペレットとの分離精製が容易で
ある。こうしたペレットの利点を利用したものとして、
リゾプス・オリゼＮＲＲＬ３９５(Rhizopus oryzae NRR
L395)を用いて、キシロースを炭素源とする液体培養で
菌体ペレットを形成させ、このペレットを用いてグルコ
ースから乳酸を生産させる方法がある。例えば、ソッコ
ル等（C.R.Soccol, B.Marin, M.Raimbault; Appl Micro
biol Biotechnol 41, 286-290 (1991)）は、得られた菌
体ペレットを中和剤たる炭酸カルシウムを含有する培養
液中で好気的に発酵培養し約７５％の収率で乳酸を得て
いる。この方法によれば、このペレットを炭酸カルシウ
ムを含む培養液中で培養し、炭素源たるグルコースが消
費される毎に新たな培養液で培養することにより、連続
的に乳酸が生産されている。

【０００７】この様に、リゾプス属の菌株を好気的に培
養しグルコースやデンプンを原料としてＬ（＋）−乳酸
を生産する場合、乳酸菌を用いる場合と比較して種々の
利点がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、リゾプ
スによる好気的培養によるＬ（＋）−乳酸の産生は一般
に収率が低く、発酵に７〜１０日を要するものが多く乳
酸生産に長持間を要する。このため乳酸菌を用いた嫌気
的発酵に比較して工業的実用性に欠ける。

【０００９】また、上記ソッコル等により、リゾプスを
再使用した連続培養も報告されているが、かかる菌株を
使用した場合は、３回目以降で乳酸産生の減退が大きく
なり、これを防ぐため培養液に窒素源として尿素を添加
する必要がある。

【００１０】また、一般に乳酸産生菌によるＬ（＋）−
乳酸の生産方法では、生産されたＬ（＋）−乳酸による
生成物阻害を抑制しかつ培養液の酸性度を中和すべく、
炭酸カルシウムや水酸化ナトリウムを中和剤としてＬ
（＋）−乳酸を中和する必要がある。高収率で乳酸を得
る場合、現在知られているリゾプス属による乳酸発酵は
殆どが炭酸カルシウムを中和剤として用いるものであ
り、生成する乳酸カルシウムから乳酸を分離精製するに
は、硫酸を添加して硫酸カルシウムを沈澱分離する方法
を用いる以外になく、大量の硫酸カルシウムを副生する
ため工業的に問題がある。かかる場合、アンモニアを中
和剤に用いて乳酸アンモニウムを得る場合には、アンモ
ニアによる菌体活性阻害により、収率および生産性の面
でも不十分なものとなりやすい。更に、上記ソッコル等
は、生成する酸の中和剤として炭酸カルシウム等を使用
せず、ポリ４−ビニルピロリドン（ＰＶＰ）樹脂でＬ
（＋）−乳酸を吸着分離しているが、細胞が損傷を受け
るため生産量が低下するという問題点を指摘している。

【００１１】また、乳酸は、多糖を含む糖類から菌体内
の諸酵素により産生されるが、使用する菌株自体の栄養
要求性が複雑であれば、培養液中に各種の成分を配合し
なければならず、かかる培養液から乳酸産生菌株が産生
した乳酸を単離することは困難であり、収率よく高純度
の乳酸を製造することは容易でない。また、培養条件に
よっては副生物が生じるため、乳酸の精製段階を簡便に
するには、副生物の発生が少ない培養条件を選択する必
要がある。一方、菌体を効率よく使用するためには乳酸
産生菌体を再使用することが好ましいが、一般に菌株を
再使用すると栄養要求性を十分に満たすことが困難で、
乳酸産生能が低下する場合が多い。このため、再使用に
強い菌株を選択する必要がある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は上記課題に鑑
み、リゾプス・エスピーＭＫ９６（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｓｐ．ＭＫ９６）をニトロソグアニジンで変異して得
られたアンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸産生能菌
を提供するものである。

【００１３】また、リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１
５６（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐ．ＭＫ９６ー１１５６）
菌株を提供するものである。

【００１４】また、前記菌株を好気的に培養してＬ
（＋）−乳酸を生産する方法を提供するものである。

【００１５】また、培養液のｐＨの調整がアンモニアの
添加によることを特徴とする前記Ｌ（＋）−乳酸を生産
する方法を提供するものである。

【００１６】また、前記好気的培養が、空気または酸素
の導入により連続的に、新たな培養液毎に回分式に、ま
たは新たな培養液を供給し半回分式に培養することを特
徴とする前記のＬ（＋）−乳酸を生産する方法を提供す
るものである。

【００１７】また、前記好気的培養が回分式に行われる
場合において、前培養することなく菌体を再使用し回分
式に培養することを特徴とする前記Ｌ（＋）−乳酸を生
産する方法を提供するものである。

【００１８】また、前記好気的培養が、通気撹拌型バイ
オリアクターまたは気泡塔型バイオリアクターにより行
われることを特徴とする前記Ｌ（＋）−乳酸を生産する
方法を提供するものである。

【００１９】また、リゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhiz
opus sp.MK96）を提供するものである。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明では、リゾプスに属しアン
モニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸生産菌であればいず
れも使用できる。リゾプスに属する乳酸発酵能を有する
微生物としては、例えば、リゾプス・アリズス（Rhizop
us arrhizus）、リゾプス・デレマ（Rhizopus delema
r）、リゾプス・ジャバニクス（Rhizopus javanicu
s）、クロネ（Rhizopus nigricans）、リゾプス・オリ
ゼ（Rhizopus oryzae）、クモノスカビ（リゾプス）（R
hizopus stolonifer）等が挙げられ、これらの中でもリ
ゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）やリゾプス・アリ
ズス（Rhizopus arrhizus）が好ましい。Ｌ（＋）−乳
酸産生能が高いからである。これらのリゾプス属に属す
る乳酸発酵能を有する菌類は、ペレット状、塊状で培養
できるからである。

【００２１】本発明で使用するＬ（＋）−乳酸生産菌
は、更にアンモニア耐性を有することが必要である。こ
の様な菌株として、本発明者らによって新たに土壌から
分離された親株リゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus
sp.MK96）を以下に述べる方法で突然変異して得られ
た変異株リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６（Rhiz
opus sp.MK96−１１５６）菌株がある。即ち、本発明者
は上記目的を解決すべく、アンモニア耐性を有するＬ
（＋）−乳酸産生菌の取得を目的として新たに自然界か
らＬ（＋）−乳酸を生産するリゾプス属の菌体を分離
し、変異処理によりアンモニア耐性を付与し、高いＬ
（＋）−乳酸産生能を示す菌株を得るに至った。これに
よりアンモニアを中和剤として用いた場合にも、収率の
低下を招くことなくＬ（＋）−乳酸を産生させることが
できるからである。

【００２２】（１）親株の１次スクリーニング水田土壌から採取した試料１ｇを５ｍｌの滅菌蒸留水に
懸濁し、試料原液を調製した。これを適当に希釈した最
終希釈液を０．１ｍｌづつコンラージ棒を用いて、Ｌ
（＋）−乳酸を含む表１に示すポテト寒天培地の分離用
寒天培地に塗布した。接種後２４℃の恒温槽中で培養
し、３日目位から発達してくるコロニーを白金耳を用い
て釣り上げ表１に示す組成の斜面培養寒天培地に移植し
た。土壌試料１点について約５０株、土壌試料１００点
について実施し、合計約３５００のカビと推定される菌
株を分離した。これらの菌株のうち、斜面培養寒天培地
での菌の形態がリゾプス属に近いと思われる菌株を８０
０本選択し、一次スクリーニング通過株とした。なお表
１に示す各寒天培地の組成は、蒸留水１リットル中のｇ
数を示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】（２）試験管振盪培養による２次スクリ
ーニング１０ｍｌの表２に示す前培養培地に、前記斜面培養寒天
培地上の胞子を１白金耳接種し、試験管振盪培養装置で
２日間培養した。この前培養培地１ｍｌを表２に示す生
産培地１０ｍｌを入れた試験管に接種し、前培養と同様
の方法で１日間振盪培養した。その後、炭酸カルシウム
を１ｇ添加し、更に２日間振盪培養した。培養上澄につ
いてバーカーサマーソン法でＬ（＋）−乳酸を比色定量
した。１次スクリーニング通過株８００株全てについて
Ｌ（＋）−乳酸蓄積量を調べたところ、静岡県藤枝市付
近の水田から採取した土壌サンプルから得た菌株がその
中で最も高いＬ（＋）−乳酸蓄積量を示すことが判明
し、本菌株をリゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus s
p.MK96）と命名した。

【００２５】

【表２】

【００２６】（３）リゾプス・エスピーＭＫ９６の菌
学的特徴本菌株の菌学的性質を以下に述べる。

【００２７】（ａ）形態的特徴；ポテト寒天培地で２４
℃で生育したリゾプス・エスピーＭＫ９６株の形態学的
特徴は、以下の通りである。

【００２８】イ）胞子（sporangium）に中軸がある。

【００２９】ロ）胞子嚢のみを形成し、球形である。

【００３０】ハ）胞子嚢柄（sporangiophore）は蒼白色
である。

【００３１】ニ）仮根（Rhizoid）と走出根（stolon）
がある。

【００３２】ホ）胞子嚢柄は仮根の基部から生じてい
る。

【００３３】ヘ）胞子嚢も菌糸層もよく発達している。

【００３４】（ｂ）生理学的特徴；表３に示すツアペッ
ク（Czapek）培地を用いて本菌の生育に与える培地温度
並びに初発ｐＨの影響を調べた。結果を表４〜７に示
す。

【００３５】

【表３】

【００３６】

【表４】

【００３７】

【表５】

【００３８】

【表６】

【００３９】

【表７】

【００４０】（４）同定以上の形態学的ならびに生理学的特徴から本菌（リゾプ
ス・エスピーＭＫ９６株）の菌学的同定を試みた。チシ
ャ等の分類基準（Zycha,H.,Siepmann and G.Limmemann:
Mucorales,lehre(1969)）に従い、本菌の胞子嚢形態が
球形または扁球形であること、多胞子からなること、中
軸があることから、本菌は明らかにムコラッセ（Mukora
ceae）（ケカビ）科の接合菌であるとした。またヘセル
チン（Hesseltine）およびエリス（Ellis）らの提案し
たムコラッセ（Mucoraceae）目の検索に従い、本菌の胞
子嚢がアポフィーゼを備えていること、胞子嚢柄は、葡
萄菌糸より生じ、仮根を伴い、かつ菌糸の仮根形成部よ
り直立していることから本菌は、リゾプス（Rhizopus）
（クモノスカビ）に属するものとした。

【００４１】リゾプス属は現在１５種報告されている
が、イヌイ等（Inui,T.,Takeda,Y.andIizuka,H.,Taxono
mical studies on genus Rhizopus, The Journal of G
eneral and Applied Microbiology, 11,1-121(1965)）
が提案した検索表に従い、本菌に近縁していると思われ
るリゾプス・オリゼ・ウェント・アンド・プリンセン・
ゲーリングス（Rhizopus oryzae Went and Prinsen-Gee
rlings）と対比しながら本菌の詳細な同定を行った。

【００４２】本菌は、形態学的特徴およびツアペック培
地での生理学的特徴などから判断して、リゾプス・オリ
ゼ・ウェント・アンド・プリンセン・ゲーリングス株に
極めて近縁の菌株と思われた。しかし、表８で示したご
とくＬ（＋）−乳酸の生産量がリゾプス・オリゼ（Rhiz
opus oryzae）のタイプカルチャーに比較して４倍近く
高い。この結果、本菌は新規な菌株であるとみなし、リ
ゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus sp.MK96）株と
命名した。リゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus s
p.MK96）は、以下に述べる有用な変異株リゾプス・エス
ピーＭＫ９６−１１５６菌株の親株として有用である。
なお、この菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄託第９０２号（ＦＥＲＭＰ−１６８７６）
として寄託されている。

【００４３】

【表８】

【００４４】（５）リゾプス・エスピーＭＫ９６菌株
の突然変異処理によるアンモニア耐性を有するＬ（＋）
−乳酸産生菌の誘導ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）変異；上記リゾプス・エ
スピーＭＫ９６菌株を、表１で示した組成を有する斜面
培養寒天培地で２４℃、１０日間培養した。斜面に滅菌
水５ｍｌを添加しよく胞子をかきとった後、この胞子懸
濁水をガーゼで包んだ綿の層を通過させ、胞子編を除い
た液を遠心分離して胞子のみを集めた。これをトリス−
マレート懸濁液に懸濁し、ＮＴＧを１ｍｇ／ｍｌとなる
ように添加した後、胞子懸濁液を２．５時間、１５０分
間、２４℃で振盪した。その後、遠心分離した胞子に滅
菌水５ｍｌを加えて再び遠心分離を行った。この操作を
２回行い、胞子を完全に洗浄した後、Ｌ（＋）−乳酸ア
ンモニウムの濃度勾配が０〜１００ｇ／ｌとなるように
作成した寒天培地（ペトリ皿）に塗布して２４℃、３日
間培養を行った（濃度勾配プレート培養法、Science,11
6,46-48(1952)）。次いで、Ｌ（＋）−乳酸アンモニウ
ム濃度が比較的高い部分に生育してきたコロニーを釣菌
して２４℃で１０日間培養した。

【００４５】（６）Ｌ（＋）−乳酸高生産菌の選別上記（５）で得た変異株を表２で示した生産培地１０ｍ
ｌを含む試験管に１白金耳接種して、試験管振盪培養装
置で３５℃で１日間培養後、滅菌した炭酸カルシウム１
ｇを添加し、更に２日間培養した。培養上澄中のＬ
（＋）−乳酸をバーカーエマーソン法で比色定量した。
菌株中フラスコ培養しＬ（＋）−乳酸の生産量が比較的
高い菌株を１０株選別し、後述する実施例１で示したジ
ャーファーメンターでアンモニアで中和する方法で比較
培養し、その中で最もＬ（＋）−乳酸生産量が高かった
菌株をリゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６（Rhizop
us sp.MK96-1156）とした。この菌株は、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄託第９０３号（ＦＥＲ
ＭＰ−１６８７７）として寄託されている。

【００４６】（７）Ｌ（＋）−乳酸の生産方法本発明においてはアンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳
酸産生能菌を用いて好気的培養によりＬ（＋）−乳酸を
産生させる。本発明で分離されたリゾプス・エスピーＭ
Ｋ９６−１１５６菌株の胞子または菌糸を用いて、栄養
源含有培地に接種して好気的に増殖させることによって
Ｌ（＋）−乳酸を生産することができる。

【００４７】本発明においてはアンモニア耐性を有する
Ｌ（＋）−乳酸産生能菌を分離育成し、これを通気撹拌
型もしくは気泡塔型バイオリアクターで好気的に回分、
半回分または連続培養することにより、さらには、菌体
の再利用を伴う反復回分培養を行うことによりＬ（＋）
−乳酸を収率よく、しかも効率的に生産することができ
る。以下、Ｌ（＋）−乳酸の製造方法を説明する。

【００４８】アンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸産
生能菌の栄養源としては、通常使用される例えば炭水化
物、窒素源、無機物などの同化できる栄養源を使用でき
る。例えば炭素源としては、コーンスターチ、コーンミ
ール、デンプン、デキストリン、麦芽、ブドウ糖、グリ
セリン、シュクロース、糖蜜等が単独で又は混合物とし
て用いられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝
酸ナトリウム、大豆粉、コーンスティープリカー、グル
テンミール、肉エキス、脂肉骨粉、酵母エキス、乾燥酵
母、綿実粉、ペプトン、小麦胚芽、魚粉、ミートミー
ル、脱脂米糠、脱脂肉骨粉、麦芽エキス、コーングルテ
ンミール等の無機又は有機の窒素源を単独で又は混合物
として使用できる。無機塩としては、炭酸カルシウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、臭
化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム又はリン酸第一カリウ
ム、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の各種無機塩が単独
でまたは混合物として使用できる。また、必要に応じ
て、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、モリブデン酸等の
重金属を微量添加することもできる。その他Ｌ（＋）−
乳酸を生産するものであれば、いずれの栄養源も使用で
き公知のカビの培養材料いずれも使用できる。また、加
熱滅菌時および培養中における発泡を押さえるため、大
豆油、亜麻仁油などの植物油、オクタデカノール等の高
級アルコール類、各種シリコン等の消泡剤を添加しても
よい。上記のごとき栄養源の配合割合は、特に制限され
るものではなく、広範囲に亘って変えることができ、使
用する条件によって最適の栄養源の組成および配合割合
は、簡単な小規模実験によって容易に決定することがで
きる。

【００４９】また、栄養培地は、培養に先立ち滅菌後の
ｐＨが５〜７前後になるように水酸化ナトリウムの水溶
液、アンモニア水またはアンモニアガスを用いてｐＨを
調整することが好ましい。

【００５０】また、本発明に係るリゾプス属に属するの
アンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸産生菌の胞子の
植菌の方法としては、特に限定されるものでなく、通
常、上記胞子を以下に液体中に懸濁し、この懸濁液体を
そのまま発酵用の液体培地に接種するなどして植菌する
方法などを用いることができる。

【００５１】上記胞子の懸濁方法としては、例えば、寒
天斜面培地上に生育し、該胞子を形成しているリゾプス
属のアンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸生成菌の菌
体に液体を加えてミキシングする方法などを用いること
ができる。なお上記液体としては、通常、無菌水が用い
られるが、さらに生化学領域で使用されるものとして、
例えば、トゥイーン８０などのトゥイーン系界面活性
剤、トリトンＸシリーズなどのトリトン系界面活性剤、
アシルソルビタンなどを少量（例えば、液体全体に対
し、０．０１重量％程度）添加した無菌水を用いること
もできる。これにより効果的に胞子を無菌水中に分散す
ることができ均質な懸濁液を得ることができるものであ
る。

【００５２】かかる栄養培地での本菌株の培養は原則的
には、一般のカビによるＬ（＋）−乳酸の製造において
通常使用されている液体培養に準じて行うことができ
る。液体培養の場合は、静置培養、撹拌培養、振盪培養
又は通気培養などのいずれを実施してもよい。本発明で
は、特に振盪培養、深部通気撹拌培養が好ましい。培養
においては、好気的な培養が好ましく、酸素または純酸
素の導入量は、０．０５〜３．０ｖｖｍであることが好
ましく、より好ましくは０．２〜１．０ｖｖｍである。
この様な条件を満たすものとして培養装置に特に制限は
ないが、空気または純酸素あるは両者の混合気体を通気
しながら撹拌型リアクターあるいは気泡塔型リアクター
のいずれかで培養することが好ましい。特に、気泡塔型
リアクターは、菌糸が撹拌翼にからみつくことがなく、
菌糸自体の破損を防止できる点でも優れている。

【００５３】更に、培養操作としては、空気または酸素
の導入により連続的に、新たな培養液毎に回分式に、ま
たは新たな培養液を供給し半回分式に培養してもよい。
更に、回分式に行われる場合に菌体を再使用することも
できる。

【００５４】培養温度は、本菌株の増殖が実質的に阻害
されずＬ（＋）−乳酸を生産しうる範囲であれば特に制
限されるものではないが、一般に２０〜４０℃、好まし
くは３５〜４０℃の範囲内の温度が好適である。

【００５５】また、培養時間はグルコース等の炭水化物
源の消費やＬ（＋）−乳酸の生産の時間的推移、リアク
ターの種類などにより総合的に判断すればよい。特に本
発明のリゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６は、Ｌ
（＋）−乳酸産生活性に優れるため、例えば回分式で実
施する場合には、２０〜１００時間、より好ましくは２
０〜８０時間、更には３０〜５０時間でも十分なＬ
（＋）−乳酸量を得ることができる。その一方、当該Ｌ
（＋）−乳酸菌は連続によってもＬ（＋）−乳酸産生活
の低下が少ないため、回分式、半回分式での再使用や連
続的使用も可能である。連続使用する場合には、当該菌
のＬ（＋）−乳酸産生活性を経時的に調べ、適宜培養時
間を調整することができる。

【００５６】また、培地のｐＨは４〜８の範囲が好まし
く、より好適には５〜７の範囲である。この範囲での産
生に優れるからである。この目的のため培地を滅菌する
前に炭酸カルシウムを添加するかあるいは培養中にｐＨ
センサーおよびｐＨコントローラーを用いて水酸化ナト
リウム水溶液またはアンモニア水又はアンモニアガスな
どを添加し、自動的に適切なｐＨの値に維持することが
好ましい。特に、本発明ではアンモニア水又はアンモニ
アガスの導入によりｐＨを調整することが好ましい。こ
の理由は以下の通りである。

【００５７】即ち、大規模に生産を行う場合には、Ｌ
（＋）−乳酸発酵では炭酸カルシウムを使用することが
一般的であるが、培養液から遊離のＬ（＋）−乳酸を分
離精製する際に非常に困難をもたらす場合が多い。炭酸
カルシウムを中和剤として用いた場合、生成したＬ
（＋）−乳酸がＬ（＋）−乳酸カルシウムの形態をなす
ため、遊離のＬ（＋）−乳酸を生産する場合には硫酸を
添加して難溶性の硫酸カルシウムを生成させ分離する必
要が生じる。従って、大量生産により大量に生じた硫酸
カルシウムを処理するため、膨大な労力と経費とが必要
となる。

【００５８】一方、アンモニア水またはアンモニアガス
を中和剤として用いた場合には、生成したＬ（＋）−乳
酸はアンモニウム塩の形態をとる。このＬ（＋）−乳酸
アンモニウム塩は、バイポーラ電気透析により遊離のＬ
（＋）−乳酸を生ずると共に、同時に発生したアンモニ
アを回収して発酵に再利用することもできる。また、ブ
タノール等のアルコールを添加してＬ（＋）−乳酸アン
モニウムを直接エステル化し、Ｌ（＋）−乳酸エステル
を得ると同時にアンモニアを回収し発酵に再利用するこ
ともできる。更に、計算量の硫酸を添加して肥料として
有用な硫酸アンモニウムを生成させ、Ｌ（＋）−乳酸を
抽出などで分離する方法等が可能であり、アンモニア処
理に多様性がある。

【００５９】アンモニアは一般に微生物の増殖に対して
阻害的に働き、アンモニアの濃度が一定以上であれば殆
ど増殖が阻害される。しかし本発明で使用するリゾプス
属に属する乳酸産生菌は、アンモニア耐性を有するＬ
（＋）−乳酸産生菌であり、アンモニア存在下において
も優れたＬ（＋）−乳酸産生能を発揮する。従って、こ
れによりＬ（＋）−乳酸の収率よく生産しうると共に、
生じた塩類の処理、Ｌ（＋）−乳酸の分離精製等を含
むその後の処理を容易にすることができるのである。

【００６０】

【実施例】以下、実施例をもって本発明を説明するが、
本発明はこれらに制限されるものではない。なお、
「％」は「重量％」を示す。

【００６１】実施例１；Ｌ（＋）−乳酸の回分発酵生産
（通気撹拌型リアクター）リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６を表１に示す斜
面培養寒天培地で培養し、次いで胞子を採取した。胞子
濃度が１０^６個／ｍｌとなるように表９に示す前培養
培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容三角フラスコに接
種した。これを３０℃でロータリーシェイカー（回転数
１７０ｒｐｍ、回転半径２ｃｍ）で１５時間培養した。

【００６２】次いで、表９に示す生産培地１．５リット
ルを入れた２．５リットルジャーファーメンター（丸菱
バイオエンジ（株）、東京）に、前記前培養液を培地量
の１０％（ｖ／ｖ）となるように添加した。これを、回
転数３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍ、培養温度３５
℃で通気撹拌培養した。培養開始直後から、ｐＨを５．
５に維持するために１０％のアンモニア水をｐＨコント
ローラーにより添加した。発酵経過を表１０に示す。

【００６３】前培養液を接種した後２４時間位から糖の
活発な消費が始まり、これと平行してＬ（＋）−乳酸の
生産が始まった。７２時間でグルコースが完全に消失
し、７６ｇ／リットル（終了時培地量１．６４リット
ル）のＬ（＋）−乳酸が生産された。この時のＬ（＋）
−乳酸の生産量は２５ｇ／リットル／日であり、Ｌ
（＋）−乳酸の生成収率は仕込みグルコース基準で６
９．２％を越える。これはアンモニア中和によるＬ
（＋）−乳酸の生産として極めて高収率であった。

【００６４】

【表９】

【００６５】

【表１０】

【００６６】比較例１リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６菌株の親株であ
るリゾプス・エスピーＭＫ９６菌株を用いて、実施例１
と同じ培養条件でジャーファーメンターを用いて培養を
行った。その結果を表１１に示した。

【００６７】表１１からもわかるように、リゾプス・エ
スピーＭＫ９６菌株は、培養開始後の７２時間後におい
てもＬ（＋）−乳酸の蓄積量はリゾプス・エスピーＭＫ
９６−１１５６の５０％以下であり、３０ｇ／リット
ル、最終液量１．５４リットルのＬ（＋）−乳酸を蓄積
したのみであった。仕込みグルコース基準の生産収率
は、７２時間後に２５．７％であった。この比較例から
みてもリゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６菌株は、
Ｌ（＋）−乳酸の生産菌として非常に優れていることが
わかった。

【００６８】

【表１１】

【００６９】比較例２リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６に代えてリゾプ
ス・オリゼＮＲＲＬ３９５を使用した以外は、実施例
１と同様に操作した。１４７時間時の最終液量は１．５
０リットルであり、収率は４４．２％であった。結果を
表１２に示す。

【００７０】表１２から、従来菌株であるリゾプス・オ
リゼＮＲＲＬ３９５と比較すると、本リゾプス・エス
ピーＭＫ９６−１１５６菌株によるＬ（＋）−乳酸産生
は極めて収率の高い乳酸産生菌であることが判明した。

【００７１】

【表１２】

【００７２】実施例２；Ｌ（＋）−乳酸の気泡塔型リア
クターでの回分生産リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６を表１に示す組
成の斜面培養寒天培地で培養し、次いで胞子を採取し
た。胞子濃度が１０^６個／ｍｌとなるように表９に示
す前培養培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容三角フラ
スコに接種した。これを３０℃でロータリーシェイカー
（回転数１７０ｒｐｍ、回転半径２ｃｍ）で１５時間培
養した。

【００７３】次いで、表９で示す生産培地１．５リット
ルを入れた２．５リットル気泡塔型リアクターに前記前
培養液を培地量の１０％（ｖ／ｖ）となるように添加し
た。通気量は、１．０ｖｖｍ、培養温度３５℃で通気の
みの培養を行った。培養開始直後から、ｐＨ５．５に維
持するため１０％のアンモニア水をｐＨコントローラー
により添加した。表１３に培養経過を示す。

【００７４】表１３からもわかるように、実施例１で示
した通気撹拌型リアクターに比較してＬ（＋）−乳酸の
生産速度が大きく、５０時間では８１ｇ／リットル（終
了時培地量１．７２リットル）を蓄積し、仕込みグルコ
ースあたりの生産収率は、７７．４％であった。発酵槽
の製作コスト、ランニングコスト並びにスケールアップ
の容易さ等を総合すると気泡塔型リアクターが優れた。

【００７５】

【表１３】

【００７６】実施例３；Ｌ（＋）−乳酸の反復回分発酵
生産（気泡塔型リアクター）実施例２と同じ方法で、１００リットル容の大型気泡塔
型リアクターによる反復回分培養を行った。１回目の生
産培地仕込量は６５リットルとした。なおｐＨ調整は２
８％のアンモニア水で行った。表１４に示すように培養
開始後２日目に炭素源であるグルコースが完全に消失し
ていることを確認してから、通気を停止し、生成した菌
糸塊をリアクター底部に沈降させた。次いで上澄を抜き
出し、菌糸塊を含む沈澱部を約１０リットルとした。新
たに滅菌した生産培地を入れて全量を６５リットルとし
再び通気を行って培養を再開した。この反復回分培養を
最初を含めて９回繰り返した。

【００７７】表１４からわかるように１回分の回分培養
に必要な日数は回を経るに従って短くなり、２回目から
６回目までは１．５日間、７回目以降は２日で培養が終
了した。結局１５．５日間で、９回の反復回分培養を行
った。通常の回分培養では、発酵に２．５日、リアクタ
ーの洗浄その他に０．５日かかるため、１５．５日で
は、約５回の回分生産しか行えない。これに比し、本発
明にかかるリゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６菌株
は９回の反復回分培養にも優れた生産性を示し、これに
より既存の方法に比較して概ね１．５倍の乳酸生産性を
示し、極めて高収率であった。なお、本反復回分培養で
は前培養は最初の一回だけよいため、従来の回分培養に
おいて毎回前培養液を調製しなければならないことと比
較すると、労務コストを大幅に減少させることができ
た。

【００７８】

【表１４】

【００７９】実施例４；Ｌ（＋）−乳酸の気泡塔型リア
クターでの回分生産生産培地として、実施例２で使用した組成に更にコーン
ミール１ｇ／リットルを添加した以外は、全く同様に操
作して気泡塔型リアクターによる発酵を行った。３６時
間時の最終液量は１．６５リットルであり、収率は８
１．６％であった。結果を表１５に示す。生産速度が大
幅に改善されると共に高い生産収率を得ることができ
た。

【００８０】

【表１５】

【００８１】

【発明の効果】本発明によれば、アンモニア耐性を有す
るＬ（＋）−乳酸産生菌が提供される。かかる菌株を使
用して好気的培養により、収率よくＬ（＋）−乳酸を生
産することができる。また、アンモニアを培地中に添加
することにより、中和剤又は生成物阻害を除去すること
ができ、しかもアンモニアによるＬ（＋）−乳酸産生能
の低下を生ずることなく収率よくＬ（＋）−乳酸を生産
することができる。当該菌株の反復回分発酵は、前培養
が１回ですむため、生産時間が短縮されしかも収率が高
い。

【００８２】上記Ｌ（＋）−乳酸の製造方法により、比
較的安価にＬ（＋）−乳酸を得ることができるため、食
品添加物として清酒、清涼飲料、漬物、醤油、製パン、
ビールなどの製造に使用され、また、工業用として皮
革、繊維、プラスチックなどの製造に幅広く利用でき
る。

【手続補正書】

【提出日】平成１１年７月２７日（１９９９．７．２
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４２】本菌は、形態学的特徴およびツアペック培
地での生理学的特徴などから判断して、リゾプス・オリ
ゼ・ウェント・アンド・プリンセン・ゲーリングス株に
極めて近縁の菌株と思われた。しかし、表８で示したご
とくＬ（＋）−乳酸の生産量がリゾプス・オリゼ（Rhiz
opus oryzae）のタイプカルチャーに比較して４倍近く
高い。この結果、本菌は新規な菌株であるとみなし、リ
ゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus sp.MK96）株と
命名した。リゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus s
p.MK96）は、以下に述べる有用な変異株リゾプス・エス
ピーＭＫ９６−１１５６菌株の親株として有用である。
なお、この菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄託第９０２号（ＦＥＲＭＰ−１６８７６）
として寄託され、該寄託は、ブタペスト条約に基づく寄
託に切り換えられて受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６７７６
として同所に保管されている。

【補正の内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４５】（６）Ｌ（＋）−乳酸高生産菌の選別上記（５）で得た変異株を表２で示した生産培地１０ｍ
ｌを含む試験管に１白金耳接種して、試験管振盪培養装
置で３５℃で１日間培養後、滅菌した炭酸カルシウム１
ｇを添加し、更に２日間培養した。培養上澄中のＬ
（＋）−乳酸をバーカーエマーソン法で比色定量した。
菌株中フラスコ培養しＬ（＋）−乳酸の生産量が比較的
高い菌株を１０株選別し、後述する実施例１で示したジ
ャーファーメンターでアンモニアで中和する方法で比較
培養し、その中で最もＬ（＋）−乳酸生産量が高かった
菌株をリゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６（Rhizop
us sp.MK96-1156）とした。この菌株は、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄託第９０３号（ＦＥＲ
ＭＰ−１６８７７）として寄託され、該寄託は、ブタ
ペスト条約に基づく寄託に切り換えられて受託番号ＦＥ
ＲＭＢＰ−６７７７として同所に保管されている。☆
受

【書類名】受託番号変更届

【整理番号】９８Ｐ０３５９

【提出日】平成１１年０７月２７日（１９
９９．０７．２７）

【旧寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ− １６８７６

【新寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ− ６７７６

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ− １６８７７

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ− ６７７７

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:845）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus
sp.MK96）株をニトロソグアニジンで変異して得られ
たアンモニア耐性を有するＬ（＋）−乳酸産生能菌。
【請求項２】リゾプス・エスピーＭＫ９６−１１５６
（Rhizopus sp.MK96-1156）菌株。
【請求項３】請求項１または２記載の菌株を好気的に
培養してＬ（＋）−乳酸を生産する方法。
【請求項４】培養液のｐＨの調整がアンモニアの添加
によることを特徴とする請求項３記載のＬ（＋）−乳酸
を生産する方法。
【請求項５】前記好気的培養が、空気または酸素の導
入により連続的に、新たな培養液毎に回分式に、または
新たな培養液を供給し半回分式に培養することを特徴と
する請求項４記載のＬ（＋）−乳酸を生産する方法。
【請求項６】前記好気的培養が回分式に行われる場合
において、前培養することなく菌体を再使用し回分式に
培養することを特徴とする５記載のＬ（＋）−乳酸を生
産する方法。
【請求項７】前記好気的培養が、通気撹拌型バイオリ
アクターまたは気泡塔型バイオリアクターにより行われ
ることを特徴とする請求項６記載のＬ（＋）−乳酸を生
産する方法。
【請求項８】リゾプス・エスピーＭＫ９６（Rhizopus
sp.MK96）。