KR100289326B1

KR100289326B1 - 신규한엔테로코커스에스피.알케이와이1에의한푸마르산으로부터숙신산제조

Info

Publication number: KR100289326B1
Application number: KR1019980029368A
Authority: KR
Inventors: 류화원; 윤종선; 강귀현
Original assignee: 류화원
Priority date: 1998-07-18
Filing date: 1998-07-18
Publication date: 2006-03-27
Also published as: KR20000009147A

Abstract

숙신산은 식품, 의약, 고분자, 직물, 도금 및 폐가스 세정 등의 폭 넓은 용도를 지니며, 특히 1,4-부탄디올, 테트라하이드로푸란, 감마-부틸로락톤, 2-피롤리돈, n-메칠-2-피롤리돈 등과 같은 공업적으로 매우 중요한 화합물의 원료로서 매우 가치있는 탄소 4개의 디카르복실산이다. 현재 숙신산은 부탄을 산화시켜 말레산 무수물로 만들어 이를 가수화시켜 말레산을 만든 후 수소화반응을 거쳐서 숙신산을 합성하는 복잡한 석유화학공정에 의해서 생산하고 있다. 그러나 전세계 원유 매장량이 1,370억배럴 정도로 현재 원유 소비추세로 보아 약 40여년 후 원유의 고갈이 예상되어 석유화학공정에 의한 숙신산 생산의 대체공정으로서 미생물을 이용하여 숙신산을 생합성하는 생물화학공정이다. 본 특허는 신규 분리한 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 배양하여 푸마르산을 부가가치가 높은 숙신산으로 생물전환하는 기술이다.

Description

신규한 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용한 푸마르산으로부터 숙신산 제조

숙신산은 식품, 의약, 고분자, 직물, 도금 및 폐가스 세정 등의 폭 넓은 용도를 지니며, 특히 반응식 1에 보인 것처럼 1,4-부탄디올, 테트라하이드로푸란, 감마-부틸로락톤, 2-피롤리돈, n-메칠-2-피롤리돈 등과 같은 공업적으로 매우 중요한 화합물의 중간체로서 매우 가치있는 탄소 4개의 디카르복실산인 숙신산의 생물화학적 제조방법이다.

[반응식 1]

현재 숙신산은 부탄을 산화시켜 말레산 무수물을 만들어 이를 가수화시켜 말레산을 만든 후 수소화반응을 거쳐서 숙신산을 합성하는 복잡한 석유화학공정에 의해서 생산하고 있다. 그러나 전세계 원유 매장량이 1,370억배럴 정도로 현재 원유 소비추세로 보아 약 40여년 후 원유의 고갈이 예상되어 석유화학공정에 의한 숙신산 생산의 대체공정 개발이 시급하다.

숙신산은 물론 그 유도체들이 석유화학공정에 의존하고 있기 때문에 원유의 가격상승 또는 고갈에 대비하여 차세대 화학공업의 대체원료로서 숙신산의 안정적인 대량생산을 위하여 생물화학공정의 개발은 매우 중요하다. 최근에 최종 대사산물로서 숙신산을 가장 높은 수율로 생산하는 미생물로 알려진 언에어로바이오스피릴륨 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens)가 개의 목과 분변으로부터 최초로 분리된 후 1980년대 후반에 들어 옥수수로부터 유도되는 포도당과 같은 저가의 탄소원을 이용한 숙신산의 생합성이 전세계적으로 관심을 끌면서 숙신산 생합성을 위한 본격적인 연구가 시작되었다. 특히 미국의 주도하고 있는 생물학적 숙신산 생산에 대한 연구결과를 살펴보면 1992년 다타 등(미국특허 5,143,833)은 엄격한 혐기성 세균인 언에어로바이오스피릴륨 숙시니시프로두센스를 이용한 숙신산의 생물학적 생산 연구에서 포도당 약 40∼50g/L을 이용하여 숙신산염 30∼50g/L, 초산염 4∼10g/L, 개미산염 1∼4g/L를 생산한 바 있으며, 같은 해 글라스너 등(미국특허 5,143,834, 유럽특허 405,707)은 전기투석발효를 병행한 숙신산 발효를 통해 초기 약 51wt%의 숙신산염을 네단계의 정제과정을 거쳐 79wt%로 농축한 사례가 있다. 또한 1995년 나임과 데이비슨(Applied Biochemistry and Biotechnology, 57-58:633)은 포도당 43g/L의 발효배지에 비오틴을 보강해 약 40g/L의 숙신산염을 생산하였으며, 또한 이들은 1997년(Applied Biochemistry and Biotechnology, 63-65:565)에 재생자원인 옥수수추출액을 탄소원으로하여 배양 27시간에 32g/L의 숙신산염을 얻은 바 있다. 한편 1997년에 미국 퍼듀대학의 차오 등(19th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, Colorado Springs, Colorado, USA)은 푸마르산 환원효소가 증폭된 재조합 대장균을 배양하여 발효 24시간후에 푸마르산 40g/L로부터 73%의 수율로 숙신산 30g/L를 생물전환하였으나, 여전히 미생물이 처리 할 수 있는 초기 푸마르산의 농도가 낮기 때문에 배양액중에 최종 숙신산의 농도가 낮고, 생물전환 반응속도가 느린 결점이 있었다.

현재 미생물을 이용한 숙신산 생산에 연구가 집중되고 있는 엄격한 혐기성 세균인 언에어로바이오스피릴륨 숙시니시프로두센스를 이용한 포도당으로부터 숙신산 생합성은 다음과 같은 몇가지 문제점을 안고 있다. (1) 포도당으로부터 숙신산을 생산하기 위해서는 포도당(C₆, C₆H₁₂O₆)이 대사되어 생성된 포스포엔올피루베이트(C₃, CH₂COPO₃H₂COO^-)를 미생물의 이산화탄소 고정효소인 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제의 효소반응에 의해 옥살로아세테이트(C₄, ^-OOCCOCH₂COO^-)로 전환시켜야 하는데 이때 값 비싼 고순도의 이산화탄소(C₁, CO₂)를 발효공정에 계속 공급해주어야 한다. (2) 발효종료후 원하는 생성물인 숙신산과 부산물로서 초산, 개미산등이 생성된다. (3) 기질 및 생성물이 미생물의 성장을 저해하여 고농도의 숙신산 생산이 곤란하여 상대적으로 분리정제비용이 증가한다. (4) 이 미생물은 엄격한 혐기성 세균으로서 산소에 노출시 세균이 치명적이기 때문에 다루기가 힘들어 실제 산업화시 발효공정의 불안정을 초래할 수 있다.

본 발명은 위에 서술된 문제점들을 해결하기 위하여 숙신산보다는 5배정도 값싼 푸마르산을 숙신산으로의 생물전환에 관한 것이다. (1998년 미국 시그마사 카다로그 기준 : 숙신산 킬로그램당 100,000원, 푸마르산 킬로그램당 18,000원)

기존의 언에어로바이오스피릴륨 숙시니시프로두센스와 재조합 대장균의 배양에 의한 숙신산 생산보다는 더 경제성을 갖기 위해서는 다음과 같은 특징을 지닌 푸마르산을 부산물의 생성이 거의 없이 숙신산으로 생물전환하는 미생물이 요구된다. (1) 발효공정에 고순도의 이산화탄소의 공급이 필요없고 발효공정의 안정을 위하여 다루기 쉬운 호기적 또는 혐기적 환경에도 잘 성장 할 수 있는 통성 미생물의 분리가 필요하다. (2) 짧은 반응시간에 고수율로 푸마르산을 숙신산으로 생물전환 할 수 있어야 한다. (3) 분리된 미생물은 고농도의 초기 푸마르산을 처리하여 배양액중의 최종 숙신산 농도를 높여서 숙신산 단위 킬로그램당 분리정제비용을 절감할 수 있어야 한다.

본 발명은 이런 요구사항을 충족시키는 신규한 통성 세균을 분리하였으며, 이는 아직까지 푸마르산을 숙신산으로 생물전환하는 재조합 대장균외에는 보고가 없었던 순수 박테리아의 최초 분리이다. 이 박테리아를 동정한 결과 엔테로코커스 속으로 밝혀져 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1으로 명명하였으며, 현재 이 세균은 한국생명공학연구소 유전자원은행 유전자센터에 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피(Enterococcus sp. RKY1 KCTC 8890P)로 기탁되어 있다.

본 발명은 전자공여체 또는 수소공여체로서 글리세롤 또는 포도당을 이용하여 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 배양하여 전자수용체 또는 수소수용체로서 고농도의 푸마르산을 더 부가가치가 높은 숙신산으로의 생물전환에 관한 것이다.

현재 숙신산은 부탄을 산화시켜 말레산 무수물로 만들어 이를 가수화시켜 말레산을 만든 후 수소화반응을 거쳐서 숙신산을 합성하는 복잡한 석유화학공정에 의해서만 합성되는 숙신산 생산의 대체공정으로서 생물학적 숙신산 생산에 관한 것이다. 신규로 분리된 통성세균 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피를 배양시 전자공여체 또는 수소공여체로서 글리세롤 또는 포도당을 이용하고 전자수용체 또는 수소수용체로서 고농도의 푸마르산을 사용하여 짧은 반응시간에 고수율로 공업에 중요한 화합물로서 부가가치가 높은 숙신산으로 생물전환하므로 배양액 단위 부피당 숙신산 농도가 높아 분리정제 비용을 절감하고 산소의 존재유무에 관계없이 성장하는 통성세균에 의한 숙신산 생산이기 때문에 산업화시 안정성이 있어서 효과적인 숙신산의 제조방법이다.

본 발명은 현재 전세계적으로 석유화학공정에 의해서만 합성되는 숙신산 생산의 대체공정으로서, 신규로 분리된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피를 이용하여 값싼 푸마르산을 부가가치가 높고, 여러가지 공업에 중요한 화합물인 숙신산으로 생물전환하는 효과적인 숙신산의 제조방법이다.

아래에서 이 통성세균 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용한 생물전환에 의해 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생합성을 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예만으로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

전배양은 푸마르산 15g/L, 포도당 15g/L, 효모 추출물 15g/L, 인산2칼륨 1g/L, 염화나트륨 1g/L의 성장배지 14ml이 들어있는 20ml 혈청병에 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1의 글리세롤 냉동보관균주 0.5ml을 주사기로 접종하여 진탕배양기에서 38℃, 200rpm로 6시간동안 배양한 후, 이 배양액 2ml을 성장배지 40ml이 들어있는 50ml 혈청병에 접종하여 같은 조건으로 4시간동안 배양하여 접종균으로 사용하였다.

푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환은 푸마르산 40g/L, 효모 추출물 15g/L, 인산2칼륨 1g/L, 염화나트륨 1g/L, 황산마그네슘 수화물 0.2g/L의 발효배지 1,000ml이 들어있는 2.5L 발효조(KF-2.5L, 한국발효기)에 넣어 121℃에서 15분동안 고압멸균한 후 80℃로 냉각되었을 때 교반없이 CO₂를 발효조에 20ml/min으로 pH가 더 이상 떨어지지 않을 때까지 공급하여 발효조 내부의 산소를 이산화탄소로 치환하고 배양중에는 이산화탄소를 공급하지 않았다. 접종액 30ml을 접종하여 38℃, 200rpm, pH는 3N 탄산나트륨를 첨가하여 7.0으로 조절하였고 미생물 성장을 위한 탄소원 및 전자공여체로서 포도당(200g/L)을 10ml/hr의 유속으로 정량펌프를 이용하여 일정하게 발효조에 공급하여 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 결과를 표1에 나타내었다. 세포농도는 660nm에서 분광광도계(UV-160A, Shimadzu Co., Japan)로 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 0.8이하가 되도록 배양액을 10배 희석하여 측정하였으며, 흡광도 0.5는 건조세포중량 0.55g/L에 해당된다. 숙신산과 푸마르산 등의 유기산 분석은 HPX-87A컬럼(Bio-Rad Co., USA)이 장착된 고압액체크로마토그래피(Waters Ltd., USA)를 사용하여 정량하였으며, 분석조건은 다음과 같다. 이동상은 0.008N 황산, 유량은 0.6ml/min, 검출기는 자외선 210nm, 컬럼온도는 35℃로 유지하였다. 이 세균은 성장속도 및 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 반응속도가 매우 빨랐으며, 고수율로 숙신산을 생산하였다.

실시예 2

실시예 1에 있어서 사용한 푸마르산염 농도를 70g/L로 대체하여 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 결과를 표1에 나타내었다.

실시예 3

실시예 1에 있어서 사용한 푸마르산염 농도를 100g/L로 대체하여 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 결과를 표1에 나타내었다.

실시예 3

실시예 1에 있어서 사용한 푸마르산염 농도를 100g/L로 대체하여 푸마르산 으로부터 숙신산으로의 생물전환 결과를 표1에 나타내었다.

[표 1]

엔테로코커스 에스피. 알케이와이1에 의한 푸마르산으로 부터 숙신산으로의 생물전환에 대한 초기 푸마르산 농도의 영향 (전자공여체 : 포도당)

실시예 4

실시예 1에 있어서 전자공여체로 이용한 포도당 대신 글리세롤 20g/L를 사용하였으며 혐기조건의 조성을 위한 용존 이산화탄소 발생용으로서 탄산나트륨를 각각 다른 농도로 배지에 첨가하여 발효액 15mL의 20mL 혈청병에서 24시간 배양하였다. 탄산나트륨 5g/L에서 세포증식이 가장 좋았으며 탄산나트륨 7g/L에서 숙신산염의 생성량이 가장 많았다. 초기 푸마르산염농도는 50g/L였으며 배양결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

숙신산염, 젖산염생성 및 세포증식에 미치는 초기 탄산나트륨 농도 영향.

실시예 5

실시예 4에 있어서 전자공여체로 이용한 글리세롤 20g/L 이외에 세포증식을 위한 에너지원으로써 포도당이 발효배지에 보충되었다. 숙신산염의 생성은 포도당 6 g/L에서 가장 높았다. 초기 푸마르산염농도는 50g/L였으며 배양결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

숙신산염, 젖산염생성 및 세포증식에 미치는 초기 포도당 농도 영향.

실시예 6

실시예 1에 있어서 용적 부피 1L 발효배양에서 전자공여체로 포도당 대신 글리세롤 20g/L와 용존이산화탄소 발생 시약 탄산나트륨 5g/L가 발효배양배지에 첨가되고 발효과정 동안 유기산의 생성으로 낮아진 pH는 3N 탄산나트륨 대신 2M 탄산나트륨이 사용된다. 또한 접종액 30ml 대신 1L 전배양액에서 세포를 대수증식기 중반까지 성장시켜 10,000 RPM에서 10분동안 원심분리한 후 0.1M 소디움포스페이트완충액(pH 7.0)에 재현탁하여 고농도 휴지세포 배양을 위하여 초기 세포농도 약 2g/L가 되도록 조정하였다. 초기 푸마르산염농도는 30 g/L로 하여 발효배양을 통한 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환결과를 표 4에 나타내었다.

실시예 7

실시예 6에 있어서 초기 푸마르산염 농도는 50 g/L로 대체되며 발효배양을 통한 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 결과를 표 4에 나타내었다.

실시예 8

실시예 6에 있어서 초기 푸마르산염 농도는 80 g/L로 대체되며 발효배양을 통한 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 결과를 표 4에 나타내었다.

실시예 9

실시예 6에 있어서 초기 푸마르산염 농도는 100 g/L로 대체되며 발효배양을 통한 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 4]

엔테로코커스 에스피. 알케이와이1에 의한 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환에 대한 초기 푸마르산의 농도 영향 (전자공여체 : 글리세롤)

Claims

전자공여체를 탄소원으로 하여 배양시 유기산에 전자전달 또는 수소전달 능력이 있어 다른 유기산으로 생물전환 특성이 있는 통성세균인 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피 (Enterococcus sp. RKY1 KCTC 8890P) 미생물.
제1항의 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 유기산의 제조방법.
제2항에 있어서, 미생물을 배양시 글리세롤 또는 포도당을 이용하여 숙신산을 제조하는 방법.