KR100385015B1

KR100385015B1 - 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용한 젖산의제조방법

Info

Publication number: KR100385015B1
Application number: KR10-2000-0071730A
Authority: KR
Inventors: 류화원; 윤종선
Original assignee: 류화원; 윤종선
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2000-11-29
Publication date: 2003-05-22
Also published as: US20020098558A1; KR20010008380A

Abstract

젖산은 식품, 제약, 화장품, 화학, 금속, 전자, 페인트, 잉크, 직물, 염색, 피혁 공업 등에 폭넓은 용도를 지니며 특히 석유화학에서 유도된 난분해성 고분자인 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스틸렌 등을 대체할 수 있는 생분해성 고분자 물질인 폴리락타이드의 원료로서 그 수요가 증가하고 있다. 또한 원유의 가격상승 및 고갈에 대비하여 프로필렌글리콜, 프로필렌옥시드, 젖산에스테르, 아세트알데히드, 아크릴산, 2,3-펜탄디온 등과 같은 공업적으로 중요한 화합물의 중간체로서 매우 가치있는 탄소 3개로 된 유기산이다. 본 특허는 젖산 생산성 및 수율이 높은 젖산균인 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용하여 탄수화물로부터 젖산을 제조하는 기술이다.

Description

엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용한 젖산의 제조방법 {Manufacture of lactic acid using Enterococcus sp. RKY1}

본 발명은 생물공학적 발효공정에 의한 젖산의 제조방법에 관한 것이다. 젖산은 식품, 제약, 화장품, 화학, 금속, 전자, 페인트, 잉크, 직물, 염색, 피혁 공업 등의 폭넓은 용도를 지니며 특히 석유화학에서 유도된 난분해성 고분자인 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스틸렌 등을 대체할 수 있는 생분해성 고분자 물질인 폴리락타이드의 원료이다. 또한 젖산(CH3CHOHCOOH)은 수산기와 카르복실기를 동시에 가지고 있어 반응성이 매우 크기 때문에 간단한 에스테르화, 수소화, 탈수, 축합, 중합반응 등에 의해 젖산에스테르, 아세트알데히드, 프로필렌글리콜, 프로필렌옥시드, 아크릴산, 2,3-펜탄디온, 폴리락타이드 등 공업적으로 중요한 화합물로 전환할 수 있어 원유가격 상승 또는 원유의 고갈에 대비하여 화학공업의 차세대 대체원료로서 중요한 유기산이다.

젖산은 무색, 무취이며 부드러운 신맛이 있고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질로서 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제, 흡습제, 보습제, pH 조절제, 피부미백제, 용매, 정맥주사액, 투석액, 치석제거제, 칼슘보강제, 빈혈치료제, 여드름치료제, 무좀치료제, 세정제 등의 다양한 용도로 폭넓게 응용되고 있을 뿐만 아니라 석유화학에서 유도되는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스틸렌 등과 같은 난분해성 플라스틱의 환경친화적인 대체 고분자 물질로서 생분해성 고분자인 폴리락타이드의 단량체로서 매우 중요한 물질이다. 그리고 폐수처리공정의 산도 조절제로 사용되어 왔던 인산이 강이나 바다의 부영양화 현상 유발로 환경에 악영향을 미침에 따라 사용을 규제하면서 인산 대체 화합물로서 사용될 뿐만 아니라 인체에 유해한 휘발성 유기용매를 대체할 수 있는 환경친화적인 무독성 및 생분해성 용매의 원료로서도 젖산의 수요가 크게 증가하고 있다.

젖산은 석유화학적 합성공정과 생물공학적 발효공정에 의해 제조되고 있다. 석유화학적 합성공정은 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시켜 아세트알데히드를 제조하고 이 아세트알데히드에 시안화수소 첨가반응에 의해 락토니트릴을 제조하여 증류시켜 정제한 후 염산이나 황산을 사용하여 가수분해시킴으로써 젖산을 제조한다. 그러나 합성공정에 의한 젖산은 디(D)형 젖산 50퍼센트와 엘(L)형 젖산 50퍼센트로 구성된 라세믹 혼합물로서 광학적 활성이 없는 디엘(DL)형 젖산이 제조되고, 그 혼합물의 조성을 조절할 수 없다. 디형 젖산은 인체내에서 쉽게 대사되지 않아 많은 양의 디형 젖산의 섭취는 소변의 과산성화 현상을 유발하여 세계보건기구에서는 1일 섭취량을 체중 1 킬로그램당 0.1 그램 이하로 제한하고 있다. 반면에 생물공학적 발효공정에 의해 제조된 젖산은 전분, 맥아당, 포도당, 과당 등과 같은 재생가능한 탄수화물을 기질로 하며 사용된 미생물에 따라서 디형 젖산 또는 엘형 젖산을 선택적으로 순수하게 제조할 수 있다. 예를 들면 류코노스톡 메센테로이데스, 락토바실러스 불가리쿠스 등과 같은 미생물은 디형 젖산을 생산하고, 엔테로코커스 피칼리스, 스트렙토코커스 크레모리스, 락토바실러스 카제이, 리조퍼스 오리제 등과 같은 미생물은 엘형 젖산만을 생산한다. 본 발명자에 의해 신규한 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1에 의한 푸마르산으로부터 숙신산 제조에서는 부산물로서 젖산이 0~4g/L 정도가 생산되었으나(국내공개 2000-9147), 젖산만을 대량으로 생산하기 위하여 이때 사용한 배지에서 푸마르산을 공급해 주지 않고 이 균주에게 내산성(耐酸性)을 부여하기 위하여 배지에 젖산을 30, 60, 90g/L로 첨가하여 각각 5회씩 배양한 결과 고농도의 젖산에 적응한 균주를 얻었으며 또한 이 내산성이 있는 균주에 내당성(耐糖性)을 부여하기 위하여 배지에 젖산 30g/L을 첨가한 후 포도당을 100, 150, 200, 250g/L에서 각각 5회씩 배양하여 내산성과 내당성이 향상된 균주에 의해 생물공학적 발효공정에 의한 젖산제조의 문제점인 기질 및 생성물저해를 동시에 해결하여 고농도의 젖산을 제조할 수 있었다. 한국과학기술원에서 젖산 제조를 위하여 대장균의 초산 생산 결핍 변이주를 이용하여 발효 57시간만에 젖산 60g/L를 제조하였으나 발효시간이 길고 젖산 농도가 낮을 뿐만 아니라 디형 젖산을 생산하였으며 (국내특허 0122428), 또한 삼양제넥스에서 락토바실러스 카제이 서브스페시스 람노서스를 배양하여 발효 48시간에 젖산 120g/L를 생산하여 평균 부피 생산속도가 2.5g/L/hr이었으나 (국내특허 0122436), 본 발명은 내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피(Enterococcussp. RKY1 KCTC 8890P)를 이용하여 젖산의 제조시 발효 27시간에 거의 엘형 젖산 143g/L를 생산하여 평균 부피 생산속도가 5.3g/L/hr로서 약 2배 정도 높은 생산성을 지니고 있다.발효공정에 의한 젖산 제조시 사용된 미생물은 주로 락토바실러스속, 락토코커스속 세균을 이용하고 있으며, 엔테로코커스속 세균을 이용한 젖산의 제조는 1993년 기우르카와 레빈 (Journal of Food Biochemistry, 1993,16:277~289)에 의해 엔테로코커스 피시움을 배양하여 젖산 11g/L를 생산하였으나 전체 유기산중 젖산이 45%이고 평균 부피생산속도가 0.1g/L/hr으로서 젖산의 수율, 순도 및 생산성이 낮았다. 이외 엔테로코커스속 세균을 이용한 젖산 제조는 거의 연구되지 않았다.

생물공학적 발효공정에 의해 제조된 엘형 젖산으로 중합된 폴리엘락타이드 (PLLA)는 용융점이 약 180℃ 이상인 결정성 고분자 물질로서 기계적 강도, 투명성, 내열성, 내유성이 우수하여 필름, 섬유 등의 가공이 용이한 반면에 석유화학적 합성공정에 의한 디엘형 젖산으로 중합한 폴리디엘락타이드(PDLLA)는 용융점이 약 120℃이하인 무정형 고분자 물질이 되어 필름, 섬유의 가공이 어렵다. 따라서 생분해성 고분자 폴리락타이드의 단량체로서 광학적으로 순수한 디형 젖산 또는 엘형 젖산이 요구되므로 디엘형 젖산을 제조하는 석유화학적 합성공정에 의한 젖산제조보다 디형 또는 엘형 젖산을 선택적으로 제조할 수 있는 생물공학적 발효공정에 의한 젖산제조가 이성질체의 순도 면에서 적합하다. 뿐만 아니라 젖산이 주로 식품용으로 많이 이용되고 있어 인체에 유해한 디형 젖산보다는 엘형 젖산이 더 다양한 응용성을 가지고 있다.

본 발명은 위에 서술된 석유화학적 합성공정에 의해 제조된 젖산의 문제점을 해결하기 위한 방법으로서 생물공학적 발효공정에 의한 젖산의 제조에 관한 것이다.

기존의 젖산발효에 비해 더 경제성을 갖기 위해서는 다음과 같은 특성을 지닌 미생물이 요구된다. (1) 동형 젖산발효를 수행하는 미생물이어야 한다. 즉 젖산균의 배양시 기질로 사용된 저가의 탄수화물을 이엠피 해당경로에 의해 해당경로의 최종대사산물인 피루브산으로 대사시킨 후 이 피루브산을 젖산균이 가지고 있는 젖산 탈수소효소에 의해 젖산으로 전환시킨다. 동형발효 젖산균은 포도당 1몰당 젖산 2몰을 생성하므로 젖산의 수율이 높고 발효대사산물중 개미산, 초산, 에탄올과 같은 부산물이 거의 생성되지 않는다. (2) 젖산을 식품첨가제, 의약용, 폴리락타이드의 원료 등 다양한 응용을 위해서는 디형 젖산 또는 디엘형 젖산보다는 엘형 젖산을 생산하여야 한다. (3) 기질저해 및 생성물저해에 의해 젖산의 수율 및 생산성이 저하되므로 젖산균은 고농도의 기질 및 생성물에 대한 내당성 및 내산성을 가지고 있어야 한다. (4) 짧은 발효시간에 고수율로 젖산을 생합성할 수 있어야 한다. (5) 발효액 중 부산물이 없어야 하고 최종 젖산농도를 높여서 젖산 단위 킬로그램당 분리정제비용을 절감할 수 있어야 한다.

본 발명은 이런 요구사항을 충족시키는 젖산균인 내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피(Enterococcussp. RKY1 KCTC 8890P)를 배양하여 포도당, 과당, 맥아당과 같은 저가의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 부가가치가 높은 젖산의 생물공학적 제조방법이다.

현재 젖산은 석유화학적 합성공정과 생물공학적 발효공정에 의해 제조되고있다. 그러나 석유화학적 합성공정에 의한 젖산 제조는 에틸렌, 아세트알데히드 등 원유에서 유래되는 원료를 사용하고 있으므로 원유의 가격상승 또는 고갈에 따른 원료 수급의 불안정을 초래할 수 있다. 또한 젖산의 주요 용도가 되는 식품첨가제, 화장품, 의약품, 폴리락타이드의 원료로 사용이 곤란한 광학적으로 활성이 없는 디엘형 젖산이 제조되며, 시안화수소, 염산, 황산과 같은 독성물질 사용 등의 문제점이 있다. 본 발명은 통성 혐기성 젖산균인 내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용하여 재생가능한 옥수수, 보리, 밀, 목재로부터 유도할 수 있어 원료수급이 용이하고 저렴한 포도당, 과당, 맥아당 등의 탄수화물로부터 환경친화적인 생물공학적 발효공정에 의해 짧은 반응시간에 부산물이 거의 없이 고농도의 젖산을 높은 수율로 생물공학적 발효공정에 의해 제조하는 방법이다.

본 발명은 내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피를 이용하여 원료수급이 용이하고 저렴한 탄수화물로부터 부가가치가 높고 식품, 화장품, 제약, 화학공업 등의 폭넓은 용도를 지니고 있으며, 특히 생분해성 플라스틱인 폴리락타이드의 원료로서 중요한 유기산인 젖산의 효과적인 제조방법이다.

아래에서 내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용한 탄수화물로부터 젖산 제조방법을 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 만으로 본 발명을 한정한 것은 아니다.

실시예 1

전배양은 내산성과 내당성을 지속적으로 유지시키기 위하여 젖산 30g/L, 포도당 100g/L, 효모추출물 10g/L, 인산이칼륨 10g/L, 염화나트륨 1g/L의 성장배지 14ml이 들어있는 20ml 혈청병에 내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1의 글리세롤 냉동보관균주 0.5ml을 주사기로 접종하여 진탕배양기에서 38℃, 200rpm으로 6시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 포도당 30g/L, 효모추출물 10g/L, 인산이칼륨 10g/L, 염화나트륨 1g/L의 성장배지 37ml이 들어있는 50ml 혈청병에 3ml을 접종하여 동일한 조건으로 6시간 동안 배양하여 접종균으로 사용하였다.

포도당 150g/L, 효모추출물 20g/L, 인산이칼륨 10g/L, 염화나트륨 1g/L의 멸균된 발효배지 960ml이 들어있는 2.5L 발효조에 접종균 40ml을 접종하여 배양온도 38℃, 교반속도 200rpm, pH는 6N 탄산나트륨을 이용하여 pH 조절기에 의해 7.0으로 유지하면서 무통기 상태로 내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1을 이용하여 포도당으로부터 젖산을 제조한 결과를 표1에 나타내었다. 세포농도는 분광광도계(UV-106A, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 660nm에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도 0.5는 건조세포중량 0.55g/L에 해당된다. 젖산농도는 HPX-87H 컬럼(Bio-Rad Co., USA)이 장착된 고압액체크로마토그래피(Waters Ltd., USA)를 사용하여 정량하였으며, 분석조건은 다음과 같다. 이동상은 0.008N 황산, 유량은 0.6ml/min, 검출기는 자외선 210nm, 칼럼온도는 35℃로 유지하였다. 이 젖산균은 성장속도 및 젖산 생산속도가 매우 빨랐으며 고수율, 고생산성으로 젖산을 제조하였다.

실시예 2

실시예 1에 있어서 발효배지의 조성중 포도당을 과당 150g/L로 대체하여 과당으로부터 젖산의 제조 결과를 표1에 나타내었다.

실시예 3

실시예 1에 있어서 발효배지의 조성중 포도당을 맥아당 150g/L로 대체하여 맥아당으로부터 젖산의 제조 결과를 표1에 나타내었다.

내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피에 의한 포도당, 과당, 맥아당으로부터 젖산의 제조 결과

구 분	탄수화물/농도[g/L]	발효시간[hour]	젖 산[g/L]	세포농도[OD₆₆₀]	질량수율[%]	평균부피 생산속도[g/L/hr]
실시예 1	포도당 150	39	143.7	13.9	95.8	3.68
실시예 2	과 당 150	35	144.7	12.8	96.5	4.13
실시예 3	맥아당 150	39	141.1	14.9	94.1	3.62

실시예 4

실시예 1에 있어서 발효배지의 조성중 질소원으로 사용된 효모추출물의 농도를 각각 달리하여 포도당으로부터 젖산의 제조 결과를 표2에 나타내었다.

내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피에 의한 포도당부터 젖산의 제조에서 효모추출물 농도의 영향

구 분	효모추출물 농도[g/L]	발효시간[hour]	젖 산[g/L]	세포농도[OD₆₆₀]	질량수율[%]	평균부피 생산속도[g/L/hr]
실시예 4	10	55	129.8	7.4	86.5	2.36
	15	43	142.8	9.9	95.2	3.32
	20	39	143.7	13.9	95.8	3.68
	30	27	143.2	16.1	95.5	5.30

실시예 5

실시예 1에 있어서 발효배지의 조성중 포도당 150g/L를 포도당 75g/L와 과당 75g/L의 혼합물로 대체하여 포도당+과당 혼합물부터 젖산의 제조 결과를 표3에 나타내었다.

실시예 6

실시예 1에 있어서 발효배지의 조성중 포도당 150g/L를 과당 75g/L와 맥아당 75g/L의 혼합물로 대체하여 과당+맥아당 혼합물부터 젖산의 제조 결과를 표3에 나타내었다.

실시예 7

실시예 1에 있어서 발효배지의 조성중 포도당 150g/L를 포도당 125g/L와 맥아당 25g/L의 혼합물로 대체하여 포도당+맥아당 혼합물부터 젖산의 제조 결과를 표3에 나타내었다.

실시예 8

실시예 1에 있어서 발효배지의 조성중 포도당 150g/L를 포도당 25g/L와 맥아당 125g/L의 혼합물로 대체하여 포도당+맥아당 혼합물부터 젖산의 제조 결과를 표3에 나타내었다.

내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피에 의한 포도당+과당, 포도당+맥아당, 과당+맥아당으로부터 젖산의 제조

구 분	탄수화물 종류/농도[g/L]	발효시간[hour]	젖 산[g/L]	세포농도[OD₆₆₀]	평균부피 생산속도[g/L/hr]
실시예 5	포도당 75 + 과 당 75	27	145.5	15.8	5.38
실시예 6	과 당 75 + 맥아당 75	39	111.7	13.4	2.86
실시예 7	포도당 125 + 맥아당 25	35	139.5	16.5	3.99
실시예 8	포도당 25 + 맥아당 125	55	139.2	15.3	2.53

Claims

내산성 및 내당성이 부여된 엔테로코커스 에스피. 알케이와이1 케이씨티씨 8890피(Enterococcussp. RKY1 KCTC 8890P)를 이용하는 것을 특징으로 하여 고농도 젖산을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 탄소원으로 포도당, 과당, 맥아당 및 포도당과 맥아당 혼합물, 포도당과 과당 혼합물, 과당과 맥아당 혼합물을 이용하는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조 방법.