KR100453758B1

KR100453758B1 - 신규한 젖산발효 미생물 락토바실러스 에스피.알케이와이2 케이씨티씨 10353비피

Info

Publication number: KR100453758B1
Application number: KR10-2002-0076358A
Authority: KR
Inventors: 류화원; 윤종선; 위영중; 오후록
Original assignee: 류화원; 윤종선
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2004-10-26
Also published as: KR20030011032A

Abstract

본 발명은 우리 민족의 전통 발효식품인 된장에서 분리한 신규한 젖산균 락토바실러스 에스피. 알케이와이2를 이용한 젖산제조에 관한 것이다. 젖산은 식품, 제약, 화학, 금속, 전자, 화장품, 페인트, 잉크, 직물, 염색, 피혁 공업 등에 폭넓은 용도를 지니며 특히 석유화학에서 유도되는 난분해성 고분자인 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스틸렌 등을 대체할 수 있는 생분해성 플라스틱인 폴리락타이드의 원료로 이용되고 있다. 또한 원유의 가격상승 및 고갈에 대비하여 석유화학으로 제조되고 있는 프로필렌글리콜, 프로필렌옥시드, 아세트알데히드, 아크릴산, 2,3-펜탄디온, 젖산에스테르, 락타이드 등과 같은 공업적으로 중요한 화합물을 제조할 수 있는 매우 중요한 유기산이다.

Description

신규한 젖산발효 미생물 락토바실러스 에스피. 알케이와이2 케이씨티씨 10353비피{Newly isolated Lactobacillus sp. RKY2 KCTC 10353BP as a lactic acid bacterium}

본 발명은 신규한 젖산균을 이용한 생물공학적 젖산제조에 관한 것이다. 더 구체적으로는 탄소원으로 글루코스와 질소원으로 효모추출물로 구성되어 있는 발효배지에 우리 민족의 전통 발효식품인 된장에서 분리한 신규한 젖산균 락토바실러스 에스피. 알케이와이2 KCTC 10353BP를 배양하여 젖산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

젖산은 식품, 제약, 화장품, 화학, 금속, 전자, 페인트, 잉크, 직물, 염색, 피혁 공업 등 폭 넓게 응용되는 산업적으로 중요한 유기산이다. 또한 젖산은 무색, 무취이며 부드러운 신맛이 있고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질로서 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제, 흡습제, 보습제, 피부미백제, pH 조절제, 용매, 정맥주사액, 투석액, 치석제거제, 칼슘보강제, 빈혈치료제, 여드름치료제, 무좀치료제, 세정제 등의 다양한 용도로 폭 넓게 응용되고 있을 뿐만 아니라 석유화학에서 유도되는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스틸렌 등과 같은 난분해성 플라스틱의 환경친화적인 대체 고분자 물질로서 전세계적으로 관심이 대두되고 있는 생분해성 플라스틱 폴리락타이드의 원료로서 젖산의 수요가 크게 증가하고 있다. 특히 젖산(CH₃CHOHCOOH)은 수산기(-OH)와 카르복실기(-COOH)를 동시에 가지고 있어 반응성이 매우 크기 때문에 간단한 에스테르화, 수소화, 탈수, 축합 반응 등에 의해 젖산에스테르, 아세트알데히드, 프로필렌글리콜, 프로필렌옥시드, 아크릴산, 2,3-펜탄디온, 락타이드 등과 같이 공업적으로 중요한 화합물로 전환할 수 있어 원유가격상승 또는 원유의 고갈에 대비하여 화학공업의 차세대 대체 화학원료로서도 중요한 유기산이다.

현재 젖산은 산업적으로 석유화학적 합성공정과 생물공학적 발효공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성공정은 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시켜 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가반응에 의해 락토니트릴을 만들고 증류시켜 정제한 후 염산이나 황산을 사용하여 가수분해시킴으로써 젖산을 제조한다. 그러나 합성공정에 의해 제조된 젖산은 디(D)형 젖산 50퍼센트와 엘(L)형 젖산 50퍼센트로 구성된 라세믹 혼합물로서 광학활성이 없는 디엘(DL)형 젖산이 제조되고 그 혼합물 조성을 조절할 수 없다. 게다가 디형 젖산은 인체 내에서 쉽게 대사 되지 않아 많은 양의 디형 젖산 섭취는 인체의 과산성화를 유발하여 세계보건기구(WHO)에서는 디형 젖산의 1일 섭취량을 체중 1킬로그램당 0.1그램으로 제한하고 있다. 반면에 생물공학적 발효공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등과 같은 재생가능한 탄수화물을 기질을 하여 사용된 미생물에 따라서 디형 젖산 또는 엘형 젖산을 선택적으로 순수하게 제조할 수 있다. 예를 들면 류코노스톡 메센테로이데스, 락토바실러스 불가리쿠스 등과 같은 젖산균은 디형 젖산을 주로 생산하고, 엔테로코커스 피칼리스, 스트렙토코커스 크레모리스, 락토바실러스 카제이 등과 같은 젖산균은 엘형 젖산을 주로 생산한다.

또한 생분해성 고분자 폴리락타이드 중합하는데 단량체의 이성체 함량에 따라 플라스틱의 물성이 크게 달라진다. 즉 생물공학적 발효공정에 의해 생산된 엘형 젖산으로 중합한 폴리엘락타이드는 고분자 용융점이 약 180℃이상인 결정형 고분자가 제조되어 기계적 강도, 투명성, 내열성, 내유성이 우수하여 플라스틱 제품, 필름, 섬유 등의 가공이 용이한 반면에, 석유화학적 합성공정에 의해 생산된 디엘형 젖산으로 중합한 폴리디엘락타이드는 용융점이 120℃이하인 무정형 고분자가 제조되어 내열성, 성형성, 가공성 등이 결여되어 생분해성 고분자 폴리락타이드의 응용면에서 많은 문제점이 있다. 따라서 생분해성 고분자 폴리락타이드 중합을 위해서는 이성질체 순도가 높은 젖산을 제조할 수 있는 생물공학적 발효공정에 의해 인체에 유해한 디형 젖산 제조보다는 엘형 젖산의 제조가 더 유리하다.

따라서 경제성있는 생물공학적 젖산제조를 위해서는 엘형 젖산을 주로 생합성하고 탄수화물 대비 젖산 수율이 높은 동형젖산발효를 수행할 뿐만 아니라 발효종료 후 발효액 중 젖산농도가 높고 부피생산성이 큰 우수한 젖산균의 분리 및 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 산업적으로 중요한 젖산을 생물공학적 발효공정에 의해 효율적으로 제조하기 위하여 우리 민족의 전통 발효식품인 된장으로부터 세포성장 및 젖산 제조능력이 우수한 젖산균을 신규로 분리하였으며 본 발명은 이에 기초하여 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 생물공학적 젖산 제조공정에서 엘형젖산을 주로 생합성하고 탄수화물 대비 젖산 수율이 높은 동형젖산발효를 수행할 뿐만 아니라 발효종료 후 발효액 중 젖산농도가 높고 발효시간이 짧아 부피생산성이 큰 젖산균을 제공하는 것이다.

도 1은 탄소원으로서 글루코스 100, 150, 200g/ℓ와 질소원으로서 효모추출물 15g/ℓ로 되어있는 배양액을 이용하여 락토바실러스 에스피. 알케이와이2를 이용한 젖산발효에서 발효시간에 따른 세포농도, 글루코스 농도, 젖산농도의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 탄소원으로서 글루코스 150g/ℓ와 질소원으로서 효모추출물 15g/ℓ로 되어있는 배양액을 이용하여 락토바실러스 에스피. 알케이와이2를 이용한 젖산발효에서 발효시간에 따른 젖산농도의 변화를 고압액체크로마토그래피 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

실시예 1 : 젖산균의 분리 및 동정

우리 민족의 전통 발효식품인 된장을 생리식염수(8.5g/ℓ NaCl)로 10배수 간격으로 10^-1부터 10^-10까지 단계적으로 희석한 후, 프로테오스 펩톤 10g/ℓ, 쇠고기추출물 10g/ℓ, 효모추출물 5g/ℓ, 글루코스 20g/ℓ, 폴리솔베이트 80 1g/ℓ, 암모늄시트르산 5g/ℓ, 아세트산나트륨 5g/ℓ, 황화마그네슘 0.1g/ℓ, 황화망간 0.05g/ℓ, 인산 제2칼륨 2g/ℓ으로 구성되어 있는 Lactobacilli MRS 배지(Difco Co., 미국)에 한천 20g/ℓ, 탄산나트륨 10g/ℓ를 첨가하여 121℃로 15분간 멸균 후 페트리 디쉬 고체배지에 상기 희석액 25㎕씩을 분주하여 유리막대로 균일하게 분산시켜 38℃로 2일간 배양하여 생성된 콜로니 주위의 투명환의 크기가 가장 큰 콜로니 7개를 분리하였다. 각각 콜로니를 MRS 액체배지에서 38℃로 24시간 동안 배양하여 세포성장 및 젖산 생합성 능력이 가장 우수한 균주 RKY2를 분리하여 대전광역시 유성구 어은동 한국생명공학연구원내 소재하는 (주)마이크로아이디에 분리한 균주 동정을의뢰하여 분리된 RKY2 균주의 16S rDNA의 부분 염기서열(772bp)을 결정하여 10가지의 락토바실러스속 표준균주의 DNA 염기서열 데이터베이스와 비교한 결과 표 1에서 볼 수 있듯이 분리된 RKY2 균주는 락토바실러스속 표준균주와 DNA 염기서열이 90%이상 유사도를 가지고 있었다. 특히 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosusJCM 1588)와 99.74%의 매우 높은 16S rDNA 염기서열 유사도를 보였으며 락토바실러스 프란타륨(Lactobacillus plantarumJCM 1149)과는 99.61%의 매우 높은 16S rDNA 염기서열 유사도를 보여 이 두 젖산균과 매우 유사한 16S rDNA 염기서열을 가진 신규한 락토바실러스속 미생물로 판명되었다. 따라서 본 균주는 신규한 락토바실러스속 젖산균을 락토바실러스 에스피. 알케이와이2(Lactobacillussp. RKY2)로 명명하였으며 2002년 10월 18일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행에Lactobacillussp. RKY2 KCTC 10353BP의 수탁번호로 기탁되어있다.

분리된 RKY2 균주와 락토바실러스속 표준균주의 16S rDNA 염기서열의 유사도

표 준 균 주	유사도 (%)
락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosusJCM 1588)	99.74
락토바실러스 프란타륨 (Lactobacillus plantarumJCM 1149)	99.61
락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakeisubsp.sakeiATCC 15521)	91.98
락토바실러스 콜리노이드 (Lactobacillus collinoidesJCM 1123)	91.92
락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevisATCC 14869)	91.62
락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevisNCDO 1749)	91.31
락토바실러스 알리멘타리우스 (Lactobacillus alimentariusJCM 29643)	91.21
락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosusATCC 7469)	90.74
락토바실러스 힐가르디 (Lactobacillus hilgardiiATCC 8290)	90.74
락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosusDSM 2002)	90.62

실시예 2 : 신규한 미생물의 젖산발효 특성 (글루코스 100g/ℓ+ 효모추출물15g/ℓ)

실시예 1의 신규한 젖산균 락토바실러스 에스피. 알케이와이2를 변형된 MRS 배지(글루코스 30g/ℓ, 효모추출물 15g/ℓ, 트윈 80 1g/ℓ, 황화마그네슘 0.1g/ℓ, 황화망간 0.05g/L, 인산 제2칼륨 2g/ℓ) 14㎖이 들어있는 20㎖ 혈청병에 접종하여 200rpm으로 회전하는 진탕배양기(K.M.C.-8480SF, 비젼과학)에서 10시간 동안 혐기적으로 배양한 후 글리세롤 2㎖이 들어있는 6㎖ 혈청병에 배양액 2㎖을 분주하여 -20℃ 냉동고에 보관하여 종균으로 이용하였다. 접종균은 변형된 MRS 배지 14㎖이 들어있는 20㎖ 혈청병에 종균 1㎖을 접종하여 8시간 동안 일차 배양한 후 변형된 MRS 배지 36㎖이 들어있는 50㎖ 혈청병에 상기 배양액 4㎖을 접종하여 8시간 동안 배양하여 접종균으로 이용하였다.

세포농도는 매 3시간마다 발효조에서 채취한 시료를 30배 희석하여 분광광도계(UV-120A, Shimadzu Co., 일본)를 이용하여 660nm에서 흡광도를 측정하였으며 흡광도 1.0단위는 건조세포중량 0.82g/ℓ에 해당된다. 생성된 젖산농도는 수소이온교환칼럼(Aminex HPX-87H, Bio-Rad Co., USA)이 장착된 고압액체크로마토그래피(HPLC, 영린과학)를 사용하여 정량하였으며, 그 분석조건은 다음과 같다. 이동상은 0.01N 황산, 유량은 0.6㎖/min, 검출기는 자외선 검출기(210nm), 소비된 글루코스 농도는 글루코스 측정용 시약(Glucose-E kit, 영동제약)을 이용하여 효소법으로 정량하였다.

포도당 100g/ℓ, 효모추출물 15g/ℓ, 트윈 80 1g/ℓ, 황화마그네슘 0.1g/ℓ, 황화망간 0.05g/L, 인산 제2칼륨 2g/ℓ으로 구성된 발효배지 0.97ℓ가 들어있는 발효조(KFC-2.5L, 한국발효조)에 접종균 30㎖을 접종하였다. 배양시간이 경과함에 따라 생성된 젖산을 중화시키기 위하여 10N 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH 6.0으로 조절하고 교반속도 200rpm, 배양온도 38℃를 유지하면서 무통기 상태로 배양한 결과 도 1의 글루코스 100g/ℓ ()로 나타낸 것과 같이 배양 21시간 후에 글루코스 100g이 고갈되었고 이때 세포성장은 흡광도(A₆₆₀) 20.9이었으며 젖산 94.7g/ℓ가 생성되어 젖산수율은 94.7%이었고, 평균 부피생산성은 4.51g/ℓ·hr이었다.

실시예 3 : 신규한 미생물의 젖산발효 특성 (글루코스 150g/ℓ+ 효모추출물 15g/ℓ)

발효배지내의 초기 글루코스 농도를 150g/ℓ로 하여 실시예 2와 동일한 방법으로 배양한 결과, 도 1의 글루코스 150g/ℓ (◇)로 나타낸 것과 같이 배양 36시간 후에 글루코스가 고갈되었고 이때 세포성장은 흡광도(A₆₆₀) 21.1이었으며 젖산 143.5g/ℓ가 생성되어 젖산수율은 95.7%이었고, 평균 부피생산성은 3.99g/ℓ·hr이었다. 도 1에서 볼 수 있듯이 실시예 2에 비해 평균 부피생산성의 저하는 배양초반부의 기질저해와 배양 후반부의 생성물저해에 의해 발효시간이 약간 더 걸렸기 때문이다. 그러나 실시예 2에 비해 평균 부피생산성이 저하되었음에도 불구하고 최종 발효액 중의 젖산농도가 상대적으로 높아 분리정제 비용을 절감할 수 있어 젖산의 kg당 제조단가 면에서 더 유리하다. 도 2는 발효 0, 15, 36시간 후의 배양액 중의 젖산을 고압액체크로마토그래피 분석한 결과로서 신규한 젖산균 락토바실러스 에스피. 알케이와이2는 탄소원으로서 글루코스를 대사하여 거의 젖산만을 거의 순수하게 생산하는 동형발효를 수행함을 알 수 있었다.

실시예 4 : 신규한 미생물의 젖산발효 특성 (글루코스 200g/ℓ+ 효모추출물 15g/ℓ)

발효배지내의 초기 글루코스 농도를 200g/ℓ로 하여 실시예 2와 동일한 방법으로 배양한 결과, 도 1의 글루코스 200g/ℓ ()로 나타낸 것과 같이 배양 초반부의 심한 기질저해와 배양 후반부의 심한 생성물 저해에 의해 배양 69시간 후에도 글루코스가 18.4g/ℓ가 남아 있었으며 이때 세포성장도 흡광도(A₆₆₀) 16.5에 불과하였으며 젖산 174.0g/ℓ가 생성되어 젖산수율은 87.0%이었고, 평균 부피생산성은 2.52g/ℓ·hr이었다. 따라서 발효종료 후 발효액 중의 최종 젖산농도는 가장 높았음에도 불구하고 실시예 2 또는 3에 비해 평균 부피생산성이 크게 저하되었을 뿐만아니라 글루코스가 대사되지 못하고 배양액 중에 남아 있어 초기 글루코스 농도 200g/ℓ에서는 초기 기질농도가 너무 높아 효율적인 젖산제조가 어려움을 알 수 있었다.

본 발명은 산업적으로 중요한 유기산인 젖산의 생물공학적 제조방법을 제공한다. 탄소원으로서 글루코스과 질소원으로 효모추출물로 구성된 발효배지에 우리 민족의 전통 발효식품인 된장에서 분리한 신규한 젖산균 락토바실러스 에스피. 알케이와이2를 배양하여 발효종료 후 발효액 중 젖산농도가 높고 부피 생산성이 커 젖산을 대량 제조할 수 있는 생물공학적 젖산 제조방법이다.

Claims

신규한 젖산발효 미생물 락토바실러스 에스피. 알케이와이2 케이씨티씨 10353비피 (Lactobacillussp. RKY2 KCTC 10353BP)