KR100957772B1

KR100957772B1 - ４―ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（４ＨＢ）생성능을가지는 변이체 및 이를 이용한 ４ＨＢ의 제조방법

Info

Publication number: KR100957772B1
Application number: KR1020060026593A
Authority: KR
Inventors: 박시재; 조준형; 이상엽
Original assignee: 주식회사 엘지화학; 한국과학기술원
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2006-03-23
Publication date: 2010-05-12
Also published as: KR20070096347A

Abstract

본 발명은 4HB(4-hydroxybutyrate) 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 ４HB의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 숙신산 고생성능을 가지는 미생물에 숙신산(succinate)을 4HB(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소의 유전자가 도입되어 있고, 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자가 결실되어 있는 4HB 고생성능 변이체 및 상기 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 4HB(4-hydroxybutyrate)를 수득하는 것을 특징으로 하는 4HB의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 사용되고 있는, 1,4-BDO(1,4-butanediol), GBL(gammabutyrolactone), THF(tetrahydrofuran) 등 다양한 탄소수 4개의 화학물질로 쉽게 전환할 수 있는 4HB를 제조하는 것이 가능하다.

4HB(4-hydroxybutyrate), 숙신산, 변이체

Description

４―ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（４ＨＢ）생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 ４ＨＢ의 제조방법 {Mutants Having a Producing Ability of 4―hydroxybutyrate and Method for Preparing 4HB Using the Same}

도 1은 숙신산으로부터 4HB를 생산하는 경로를 나타낸 모식도이다.

생분해성 고분자 물질은 심각한 공해문제의 한 축을 이루는 합성고분자 소재를 대체할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 이에 따라 다양한 생분해성 고분자 물질이 개발되고 있다. 그 중 하나인, 폴리-베타-하이드록시부탄산(poly-β-hydroxybutyrate)은 영양불균형 상태에서 다양한 미생물들이 축적하는 생분해성 고분자 물질로서 생분해성, 내습성, 압전성 그리고 생체 적합성 등 우수한 특성을 갖고 있다. 그 중, 4HB(4-hydroxybutyrate)는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 대표적인 예로, 폴리에스테르와 유사한 특성을 지니고 있어, 결정질의 플라스틱으로부터 고탄성의 고무에 이르기까지 폭넓은 물성을 나타내므로, 미생물 분해성 플라스틱으로서 많은 연구가 진행중이다.

또한, 4HB는 1,4-butanediol, gammabutyrolactone (GBL) 및 THF 등의 다양한 탄소수 4개의 화학물질로 쉽게 전환될 수 있다. 상기, 다양한 화학물질은 고분자, 솔벤트, 정밀화학 중간물질 등으로 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 쓰이고 있다. 현재 대부분의 탄소수 4개 화학물질은 1,4-butanediol, maleic anhydride 등으로부터 유래되어 합성되고 있지만, 유가가 올라감에 따라 생산비용이 증대되고 있어 화학생산공정을 보완 및 대체하는 공정의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 상기 화학생산공적의 대안으로 생물학적 공정이 제시되고 있다.

한편, 숙신산은 탄소수 4개의 dicarboxylic acid로서 미생물이 혐기조건에서 배양될 때 생산되는 유기산의 일종이다. 현재 다양한 미생물이 숙신산 생산균주로서 이용되어지고 있으며, 효율적인 발효공정 및 분리정제공정의 개발에 따라 생산가격이 낮아지고 있는 추세이다. 또한, 숙신산으로부터 4HB가 생성될 수 있으며, 일단 생성된 4HB는 다양한 탄소수 4개의 유기산이 유도될 수 있다.

숙신산의 생산 효율을 높이기 위한 방법과 관련된 대표적인 특허 출원으로는 본 출원인의 출원인 국제 특허 출원 공개번호 WO 2005/052135이 있고, 상기 특허 출원에서는 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생산하는 루멘 박테리아 변이균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 대하여 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허출원 제 10-2004-60149호에서는, 숙신산을 고농도로 생산할 수 있는 대장균 변이체의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2005-0076301호, 제10-2005-0076317호 및 제10-2005-0076348호에서는 신규 유전자를 이용한 숙신산의 제조방법에 대하여 개시되어 있다.

이에, 당업계에서는 상기 특허에 개시된 숙신산을 고농도로 생산할 수 있는 미생물을 이용하여, 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 사용되고 있는 탄소수 4개의 화학물질의 전구체인 4HB(4-hydroxybutyrate) 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 4HB의 생물학적 제조방법이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 숙신산을 고농도로 생산할 수 있는 미생물을 이용하여 4-hydroxybutyrate(4HB)를 제조하고자 예의 노력한 결과, 클로스트리디움(Clostridium) 균주로부터 유래된 4HB 생합성 관련 유전자를 숙신산을 대량으로 생산할 수 있는 미생물에 도입시켜, 4HB 생성 미생물 변이체를 수득하고, 상기 미생물 변이체가 4HB를 효율적으로 생산하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었 다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 숙신산(succinate)을 4HB(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고, 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4HB 고생성능을 가지는 변이체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 4HB(4-hydroxybutyrate)를 수득하는 것을 특징으로 하는 4HB의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 숙신산 고생성능을 가지는 미생물에서, 숙신산(succinate)을 4HB(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고, 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4HB 고생성능을 가지는 변이체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 숙신산 고생성능을 가지는 변이체는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 박테리아는 루멘박테리아, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 루멘박테리아는, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 루멘박테리아는, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl), 포스포트랜스아세틸화효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산 키나제를 코딩하는 유전자(ackA)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 루멘박테리아는, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl) 및 포스포피루브산 카르복실라제를 코딩하는 유전자(ppc)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 루멘 박테리아는 맨하이미아 속(Mannheimia sp .), 액티노바실러스 속(Actinobacillus sp.) 및 언에어로바이오스피리륨 속(Anaerobiospirillum sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 루멘 박테리아의 경우, 맨하이미아 속(Mannheimia sp.)인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E(KCTC 0769BP), 맨하이미아 속 LPK(KCTC 10558BP), LPK4 및 LPK7(KCTC 10626BP)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대장균은 포도당 인산전이효소를 코딩하는 유전자(ptsG) 및 피루베이트 키나아제를 코딩하는 유전자(pykA 및 pykF)가 모두 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 상기 대장균 변이체는 W3110GFA인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 숙신산을 4HB로 전환하는 효소의 유전자와 상기 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙신산을 4HB로 전환하는 효소의 유전자는 Cat1(succinyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, SucD(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 4hbD(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 GHB(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Cat1를 코딩하는 유전자는 서열번호 1, SucD를 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 4hbD를 코딩하는 유전자는 서열번호 3 및 GHB를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자는 GabD(succinic semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 GabD를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 가 지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 숙신산의 운송에 관여하는 DctA(C4-dicarboxylate transport protein)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 DctA를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 숙신산 고생성능을 가지는 미생물에서 GabD를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, Cat1을 코딩하는 유전자, SucD를 코딩하는 유전자, 4hbD를 코딩하는 유전자 및 GHB를 코딩하는 유전자가 모두 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4HB 고생성능을 가지는 미생물 변이체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 숙신산의 운송에 관여하는 DctA(C4-dicarboxylate transport protein)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 4HB(4-hydroxybutyrate)를 수득하는 것을 특징으로 하는 4HB의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 숙신산 고생성 미생물 중 루멘박테리아는 본 출원인의 특허 출원인 WO 2005/052135에 개시된 방법대로 제조하였다. 즉, 루멘 박테리아의 일종인 Mannheimia succiniciproducens 55E에서 젖산 탈수소화효소 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)를 결실시켜 변이균주인 Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP)를 제작하였고, 상기 LPK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta)와 아세트산 키나제 유전자(ackA) 및 포스포피루브산 카르복실라제 유전자(ppc)를 각각 결실시켜 변이균주들(Mannheimia sp. LPK7 및 LPK4)을 제작한 다음, 이를 혐기적 조건에서 배양한 결과, 숙신산이 고수율로 생산되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 숙신산 고생성 미생물 중, 대장균은 본 출원인의 출원인 국내 특허 공개번호 제10-2006-0011345에 개시된 방법대로 제조하였다. 즉, 박테리오파아지 레드오페론(red operon, exo-beta-gam)을 발현하는 재조합 발현벡터 pTrcEBG로 형질전환된 W3110 균주에서 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase)를 코딩하는 유전자(ptsG)와 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 두 개의 유전자(pykA, pykF)가 결실시켜, 대장균 변이균주 W3110GFA를 수득하여, 이를 혐기적 조건에서 배양한 결과, 모균주인 W3110 균주를 사용하는 경우보다, W3110GFA를 사용하는 경우 생산성이 크게 향상되는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 숙신산을 4HB로 전환하는 효소는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri)에서 유래된 4HB(4-hydroxybutyate) 생합성에 이용되는 효소들이다. 물론 클로스트리디움 클루이베리가 4HB를 생산하는 것은 아니지만 상 기 균주에서 클로닝된 효소들이 4HB 생산에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 있어서, 숙신산을 4HB로 전환하는 효소는 도 1에 나타난 바와 같이, succinate를 succinyl-CoA로 전환하는 효소인 Cat1(succinyl-CoA transferase)와 succinyl-CoA를 succinate semialdehyde로 전환하는 SucD(succinate semialdehyde dehydrogenase) 및 succinate semialdehyde를 4-hydroxybutyrate로 전환하는 4hbD(4-hydroxybutyrate dehydrogenase) 및 GHB(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)가 있다.

또한, 본 발명의 목적을 목적을 달성하기 위하여, 숙신산을 효율적으로 이용하는 것이 매우 중요한 데 이것을 충족하기 위해, 숙신산 고생성 미생물은 Succinic semialdehyde를 Succininate로 전환하는데 관여하는 gabD(succinic semialdehyde dehydrogenase)가 소실시키는 것을 특징으로 한다. 또한, 미생물 체내로 빠져나온 숙신산의 효율적인 체내전달을 위해 숙신산의 전달(transport)에 관여하는 DctA 효소를 증폭시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 루멘박테리아 중, Mannheimia 속 균주로부터 유전 자를 결실시킨 숙신산 고농도 생성 변이균주 Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP), LPK7 및 LPK4과 대장균 변이균주 W3110GFA를 이용하여, 4HB를 제조하는 방법만을 예시하였으나, 다른 루멘 박테리아 균주를 사용하여 변이균주를 수득하고, 이를 이용하여 숙신산을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법 만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이(Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001), 유청(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 숙신산 고생성능을 가지는 미생물의 제조방법

1-1 숙신산 고생성능을 가지는 루멘박테리아의 제조

본 발명의 숙신산 고생성 미생물인 루멘박테리아는 본 출원인의 특허 출원인 WO 2005/052135에 개시된 방법대로 제조하였다. 즉, 루멘 박테리아의 일종인 Mannheimia succiniciproducens 55E에서 젖산 탈수소화효소 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)를 결실시켜 변이균주인 Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP)를 제작하였고, 상기 LPK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta)와 아세트산 키나제 유전자(ackA) 및 포스포피루브산 카르복실라제 유전자(ppc)를 각각 결실시켜 변이균주들(Mannheimia sp. LPK7 및 LPK4)을 제작하였다.

1-2 숙신산 고생성능을 가지는 대장균의 제조

본 발명의 숙신산 고생성 미생물인 대장균은 본 출원인의 출원인 국내 특허 공개번호 제10-2006-0011345에 개시된 방법대로 제조하였다. 즉, 박테리오파아지 레드오페론(red operon, exo-beta-gam)을 발현하는 재조합 발현벡터 pTrcEBG로 형질전환된 W3110 균주에서 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase)를 코딩하는　유전자(ptsG)와 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 두 개의 유전자(pykA, pykF)가 결실시켜, 대장균 변이균주 W3110GFA를 수득하였다.

실시예 2: 4 HB 전환 효소 클로닝

2-1 4HB 전환 효소(Cat1, SucD, 4hbD, GHB)를 코딩하는 유전자의 클로닝

본 발명자들은 클로스트리디움 클루이베리 DSM 555로부터 Cat1을 코딩하는 유전자 cat1을 클로닝하고자 알려진 유전자 시퀀스(L21902)에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 cat1 유전자를 증폭시켰다.

PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.

[서열번호 7] cat1f-BspHI aaaaatcaat gagtaaaggg ataaagaatt cac

[서열번호 8] cat1b-XbaI gctctagatt atttcatact accagttttt ataaa

발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 cat1 유전자를 NcoI/XbaI 로 절단한pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech) 발현 벡터에 삽입함으로써 pTrc99Cat1를 제조하였다.

또한 SucD, 4hbD operon 유전자를 클로닝하고자 알려진 유전자 시퀀스 (L21902) 에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 sucD4hbD 유전자를 증폭시켰다.

PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.

[서열번호 9] SucDf-BspHI aaaaatcaat gagtaatgaa gtatctataa aag

[서열번호 10] 4hbDb-XabI gctctagatt agataaaaaa gaggacattt cacaatatgg

발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 sucD4hbD 유전자를 NcoI/XbaI 로 절단한pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech) 발현 벡터에 삽입함으로써 pTrc99SucD4hbD를 제조하였다.

또한, 서열번호 4의 GHB 유전자를 클로닝하고자 알려진 유전자 시퀀스 (L36817)에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합효소반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 ghb 유전자를 증폭시켰다.

PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.

[서열번호 11] H16 GHBf-BspHI aaaaatcaat ggcgtttatc tactatctg

[서열번호 12] H16 GHBb-XbaI gctctagatt acatggactg ctcaagcata c

2-2 숙신산의 운송에 관여하는 DctA를 코딩하는 유전자의 클로닝

대장균에서 숙신산의 운송에 관여하는 DctA를 코딩하는 유전자의 클로닝을 위하여 대장균 W3110로부터 서열번호 6의 DctA을 코딩하는 유전자 dctA을 클로닝하고자 알려진 유전자 시퀀스 (NC_000913) 에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 dctA 유전자를 증폭시켰다.

PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.

[서열번호 13] DctAf-EcoRI ggaattcatg aaaacctctc tgtttaaaag c

[서열번호 14] DctAb-XbaI gctctagatt aagaggataa ttcgtgcgtt ttgcc

발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 dctA 유전자를 p10499A (Park et al ., FEMS Microbiol. Lett 214:217, 2002) 발현 벡터에 EcoRI/XbaI로 절단해 삽입함으로서 p10499DctA를 제조하였다.

실시예 3: 4 HB 고생성능을 가지는 변이체 제작

3-1 숙신산 고생능 미생물에서 GabD 코딩하는 유전자 결실

본 발명의 숙신산 고생성 미생물인 대장균은 본 출원인의 출원인 국내 특허 공개번호 제10-2006-0011345에 개시된 방법대로 제조하였다. 즉, 박테리오파아지 레드오페론(red operon, exo-beta-gam)을 발현하는 재조합 발현벡터 pTrcEBG로 형질전환된 W3110GFA 균주에서 서열번호 5의 GabD 유전자를 소실시킨 대장균 변이균주 W3110GFA-1를 수득하였다.

3-2 실시예 2에서 제조된 유전자들의 도입

실시예 2에서 클로닝한 4HB 전환 효소 클로닝를 3-1에서 제조된 GabD가 제거된 W3110GFA-1에 도입시켰다.

실시예 4: 4 HB 수득

실시예 3에서 제조한 cat1, sucD, 4 hbD, dctA 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드를 형질전환 시킨 W3110GFA-1를, 본 출원인의 출원인 특허 10-2006-0011345에 제시한 대로 배양을 실시하였다. 즉, 상기 실시예 3에서 제작된 대장균 변이균주(W3110GFA-1)를 CaCO₃ 과량 함유된 배지조건에서 호기적으로 배양하고, 이로부터 생산되는 산물을 분석하였다.

먼저, LB 배지 10㎖를 제조하고, 대장균을 접종한 후, 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 이어, 증류수 1리터당 30g glucose, 2g KH₂PO₄, 10g (NH₄ )₂SO₄·7H₂O, 10mg MnCl₂·4H₂O, 10mg FeSO₄·4H₂O, 20g CaCO₃, 50mg FeSO₄·7H₂O, 10mg CaCl₂, 11mg ZnSO₄·7H₂O, 2.5mg MnSO₄·5H₂O, 5mg CuSO₄·5H₂O, 0.5mg(NH₄)Mo₇O₂₄·4H₂0, 0.1mg NaB₄O₇·10H₂O 의 성분이 있고 KOH로 pH를 7.0으로 맞춘 배지 100㎖을 함유한 250㎖ 플라스크에 대장균 W3110GFA 돌연변이주 5㎖을 접종하여, 30℃에서 120rpm으로 72시간동안 배양한 후, 생성된 4HB는 황산으로 배양액의 pH를 2로 낮춘 후 클로로포름 또는 에틸아세테이트로 추출하였다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 사용되고 있는 탄소수 4개의 화학물질의 전구체인 4HB(4-hydroxybutyrate) 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 4HB의 생물학적 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조된 4HB는 1,4-BDO(1,4-butanediol), GBL(gammabutyrolactone) 및 THF(tetrahydrofuran) 등의 다양한 탄소수 4개의 화학물질로 쉽게 전환할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> LG Chem, Ltd. <120> Mutants Having a Producing Ability of 4-Hydroxybutyrate and Method for Preparing 4HB Using the Same <130> P06-B024 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1617 <212> DNA <213> Clostridium kluyveri <400> 1 atgagtaaag ggataaagaa ttcacaattg aaaaaaaaga atgtaaaggc tagtaatgtg 60 gcagaaaaga ttgaagagaa agttgaaaaa acagataagg ttgttgaaaa ggcagctgag 120 gttactgaaa aacgaattag aaacttgaag cttcaggaaa aagttgtaac agcagatgtg 180 gcagctgata tgatagaaaa cggtatgatt gttgcaatta gcggatttac tccttccggg 240 tatcctaaag aagtacctaa agcattgact aaaaaagtta atgccttaga ggaagaattc 300 aaggtaacac tttatacagg ttcatctaca ggagccgata tagacggaga atgggcaaaa 360 gcaggaataa tagaaagaag aattccatat cagacaaatt ctgatatgag gaaaaaaata 420 aatgatggtt ctattaagta tgctgatatg catttaagcc atatggctca atatattaat 480 tattctgtaa ttcctaaagt agatatagct ataatagagg cagtagctat tacagaagaa 540 ggggatatta ttccttcaac aggaattgga aatacagcta cttttgtgga aaatgcagat 600 aaggtaatag tggaaattaa tgaggctcaa ccgcttgaat tggaaggtat ggcagatata 660 tatacattaa aaaaccctcc aagaagagag cccataccta tagttaatgc aggcaatagg 720 atagggacca catatgtgac ctgtggttct gaaaaaatat gcgctatagt gatgacaaat 780 acccaggata aaacaagacc tcttacagaa gtgtctcctg tatctcaggc tatatccgat 840 aatcttatag gatttttaaa taaagaggtt gaagagggaa aattacctaa gaacctgctt 900 cctatacagt caggagttgg aagtgtagca aatgcagttt tggccggact ttgtgaatca 960 aattttaaaa atttgagttg ttatacagaa gttatacagg attctatgct gaagcttata 1020 aaatgtggta aagcagatgt ggtgtcaggc acttccataa gtccttcacc ggagatgttg 1080 cctgagttca taaaggacat aaatttcttt agagaaaaga tagtattaag accacaggaa 1140 ataagtaata atccagagat agcaagaaga ataggagtta tatccataaa cactgctttg 1200 gaagtagata tatatggtaa tgtaaactcc actcatgtta tgggaagcaa aatgatgaat 1260 ggtataggcg gttctggaga ctttgccaga aatgcatatt tgactatatt cactacagag 1320 tctatcgcca aaaaaggaga tatatcatct atagttccta tggtatccca tgtggatcat 1380 acagaacatg atgtaatggt aattgttaca gaacagggag tagcagattt aagaggtctt 1440 tctcctaggg aaaaggccgt ggctataata gaaaattgtg ttcatcctga ttacaaggat 1500 atgcttatgg aatattttga agaggcttgt aagtcatcag gtggaaatac accacataat 1560 cttgaaaaag ctctttcctg gcatacaaaa tttataaaaa ctggtagtat gaaataa 1617 <210> 2 <211> 1419 <212> DNA <213> Clostridium kluyveri <400> 2 atgagtaatg aagtatctat aaaagaatta attgaaaagg caaaggcggc acaaaaaaaa 60 ttggaagcct atagtcaaga acaagttgat gtactagtaa aagcactagg aaaagtggtt 120 tatgataatg cagaaatgtt tgcaaaagaa gcagttgaag aaacagaaat gggtgtttat 180 gaagataaag tagctaaatg tcatttgaaa tcaggagcta tttggaatca tataaaagac 240 aagaaaactg taggcataat aaaagaagaa cctgaaaggg cacttgttta tgttgctaag 300 ccaaagggag ttgtggcagc tactacgcct ataactaatc cagtggtaac tcctatgtgt 360 aatgcaatgg ctgctataaa gggcagaaat acaataatag tagcaccaca tcctaaagca 420 aagaaagttt cagctcatac tgtagaactt atgaatgctg agcttaaaaa attgggagca 480 ccagaaaata tcatacagat agtagaagca ccatcaagag aagctgctaa ggaacttatg 540 gaaagtgctg atgtagttat tgctacaggc ggtgctggaa gagttaaagc tgcttactcc 600 agtggaagac cagcttatgg cgttggacct ggaaattcac aggtaatagt tgataaggga 660 tacgattata acaaagctgc acaggatata ataacaggaa gaaaatatga caatggaatt 720 atatgttctt cagagcaatc agttatagct cctgctgaag attatgataa ggtaatagca 780 gcttttgtag aaaatggggc attctatgta gaagatgagg aaacagtaga aaagtttaga 840 tcaactttat ttaaagatgg aaaaataaac agcaagatta taggtaaatc cgtccaaatt 900 attgcggatc ttgcaggagt aaaagtacca gaaggtacta aggttatagt acttaagggt 960 aaaggtgcag gagaaaaaga tgtactttgt aaagaaaaaa tgtgtccagt tttagtagca 1020 ttgaaatatg atacttttga agaagcagtt gaaatagcta tggctaatta tatgtatgaa 1080 ggagctggtc atacagcagg catacattct gacaatgacg agaacataag atatgcaaga 1140 actgtattac ctataagcag attagttgta aatcagcctg caactactgc tggaggaact 1200 gtattaccta taagcagatt agttgtaaat cagcctgcaa ctactgctgg aggaagtttc 1260 aataatggat ttaaccctac tactacacta ggctgcggat catggggcag aaacagtatt 1320 tcagaaaatc ttacttacga gcatcttata aatgtttcaa gaatagggta tttcaataaa 1380 gaagcaaaag ttcctagcta tgaggaaata tggggataa 1419 <210> 3 <211> 1116 <212> DNA <213> Clostridium kluyveri <400> 3 atgaagttat taaaattggc acctgatgtt tataaatttg atactgcaga ggagtttatg 60 aaatacttta aggttggaaa aggtgacttt atacttacta atgaattttt atataaacct 120 ttccttgaga aattcaatga tggtgcagat gctgtatttc aggagaaata tggactcggt 180 gaaccttctg atgaaatgat aaacaatata attaaggata ttggagataa acaatataat 240 agaattattg ctgtaggggg aggatctgta atagatatag ccaaaatcct cagtcttaag 300 tatactgatg attcattgga tttgtttgag ggaaaagtac ctcttgtaaa aaacaaagaa 360 ttaattatag ttccaactac atgtggaaca ggttcagaag ttacaaatgt atcagttgca 420 gaattaaaga gaagacatac taaaaaagga attgcttcag acgaattata tgcaacttat 480 gcagtacttg taccagaatt tataaaagga cttccatata agttttttgt aaccagctcc 540 gtagatgcct taatacatgc aacagaagct tatgtatctc caaatgcaaa tccttatact 600 gatatgttta gtgtaaaagc tatggagtta attttaaatg gatacatgca aatggtagag 660 aaaggaaatg attacagagt tgaaataatt gaggattttg ttataggcag caattatgca 720 ggtatagctt ttggaaatgc aggagtggga gcggttcacg cactctcata tccaataggc 780 ggaaattatc atgtgcctca tggagaagca aattatctgt tttttacaga aatatttaaa 840 acttattatg agaaaaatcc aaatggcaag attaaagatg taaataaact attagcaggc 900 atactaaaat gtgatgaaag tgaagcttat gacagtttat cacaactttt agataaatta 960 ttgtcaagaa aaccattaag agaatatgga atgaaagagg aagaaattga aacttttgct 1020 gattcagtaa tagaaggaca gcagagactg ttggtaaaca attatgaacc tttttcaaga 1080 gaagacatag taaacacata taaaaagtta tattaa 1116 <210> 4 <211> 1149 <212> DNA <213> Clostridium kluyveri <400> 4 atggcgttta tctactatct gacccacatc cacctggatt tcggcgcggt aagcctgctc 60 aagtccgaat gcgagcgcat cggcatccgc cgcccgttgc tggtgaccga caagggcgtg 120 gtcgccgcgg gagtggcgca gcgtgccatc gatgcaatgc agggcctgca ggttgcggta 180 ttcgatgaaa ccccgtcgaa cccgaccgag gccatggtgc gcaaggccgc cgcacaatac 240 cgcgaggccg gctgcgacgg gctggtggca gtgggcggcg gctcgtcgat cgacctcgcc 300 aagggcatcg ccatcctggc cacgcatgag ggcgagctga ccacctatgc caccatcgaa 360 ggcggcagcg ccaggatcac cgacaaggcg gcgccgctga tcgcggtgcc caccacctcg 420 ggcaccggca gcgaggtggc gcgcggcgcc atcatcatcc tggacgacgg ccgcaagctg 480 ggcttccatt cctggcattt gctgcccaag tccgccgtct gcgacccgga actgacgctg 540 gggctgccgg ccgggctgac cgcggccacc ggcatggatg cgatcgcgca ctgcatcgag 600 accttcctgg cccccgcctt caacccgccc gcggacggca ttgcgctgga cgggctggag 660 cgcggctggg gccatatcga acgcgccacc cgcgacggtc aggaccgcga cgcacgcctg 720 aacatgatga gcgcgtcgat gcagggcgca atggcgttcc agaaggggct gggctgcgtg 780 cattcgctgt cgcacccgct gggcgggctg aagatcgacg gccgcaccgg cctgcaccac 840 ggcacgctca acgcggtggt gatgccggcg gtgctgcgct tcaacgccga tgcgcccacg 900 gtggtgcgcg acgaccgcta cgcacgcctg cgccgcgcca tgcacctgcc cgacggcgcc 960 gatatcgcgc aggccgtgca cgacatgacc gtgcgcctgg gcctgcccac cgggctgcgt 1020 cagatgggtg tcaccgagga catgttcgac aaggtgattg ccggtgcgct ggtcgaccat 1080 tgccacaaga ccaacccgaa agaagccagc gccgcggatt atcggcgtat gcttgagcag 1140 tccatgtag 1149 <210> 5 <211> 1449 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 atgaaactta acgacagtaa cttattccgc cagcaggcgt tgattaacgg ggaatggctg 60 gacgccaaca atggtgaagc catcgacgtc accaatccgg cgaacggcga caagctgggt 120 agcgtgccga aaatgggcgc ggatgaaacc cgcgccgcta tcgacgccgc caaccgcgcc 180 ctgcccgcct ggcgcgcgct caccgccaaa gaacgcgcca ccattctgcg caactggttc 240 aatttgatga tggagcatca ggacgattta gcgcgcctga tgaccctcga acagggtaaa 300 ccactggccg aagcgaaagg cgaaatcagc tacgccgcct cctttattga gtggtttgcc 360 gaagaaggca aacgcattta tggcgacacc attcctggtc atcaggccga taaacgcctg 420 attgttatca agcagccgat tggcgtcacc gcggctatca cgccgtggaa cttcccggcg 480 gcgatgatta cccgcaaagc cggtccggcg ctggcagcag gctgcaccat ggtgctgaag 540 cccgccagtc agacgccgtt ctctgcgctg gcgctggcgg agctggcgat ccgcgcgggc 600 gttccggctg gggtatttaa cgtggtcacc ggttcggcgg gcgcggtcgg taacgaactg 660 accagtaacc cgctggtgcg caaactgtcg tttaccggtt cgaccgaaat tggccgccag 720 ttaatggaac agtgcgcgaa agacatcaag aaagtgtcgc tggagctggg cggtaacgcg 780 ccgtttatcg tctttgacga tgccgacctc gacaaagccg tggaaggcgc gctggcctcg 840 aaattccgca acgccgggca aacctgcgtc tgcgccaacc gcctgtatgt gcaggacggc 900 gtgtatgacc gttttgccga aaaattgcag caggcagtga gcaaactgca catcggcgac 960 gggctggata acggcgtcac catcgggccg ctgatcgatg aaaaagcggt agcaaaagtg 1020 gaagagcata ttgccgatgc gctggagaaa ggcgcgcgcg tggtttgcgg cggtaaagcg 1080 cacgaacgcg gcggcaactt cttccagccg accattctgg tggacgttcc ggccaacgcc 1140 aaagtgtcga aagaagagac gttcggcccc ctcgccccgc tgttccgctt taaagatgaa 1200 gctgatgtga ttgcgcaagc caatgacacc gagtttggcc ttgccgccta tttctacgcc 1260 cgtgatttaa gccgcgtctt ccgcgtgggc gaagcgctgg agtacggcat cgtcggcatc 1320 aataccggca ttatttccaa tgaagtggcc ccgttcggcg gcatcaaagc ctcgggtctg 1380 ggtcgtgaag gttcgaagta tggcatcgaa gattacttag aaatcaaata tatgtgcatc 1440 ggtctttaa 1449 <210> 6 <211> 1287 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atgaaaacct ctctgtttaa aagcctttac tttcaggtcc tgacagcgat agccattggt 60 attctccttg gccatttcta tcctgaaata ggcgagcaaa tgaaaccgct tggcgacggc 120 ttcgttaagc tcattaagat gatcatcgct cctgtcatct tttgtaccgt cgtaacgggc 180 attgcgggca tggaaagcat gaaggcggtc ggtcgtaccg gcgcagtcgc actgctttac 240 tttgaaattg tcagtaccat cgcgctgatt attggtctta tcatcgttaa cgtcgtgcag 300 cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt agcggtttac 360 gccgatcagg cgaaagacca gggcattgtc gccttcatta tggatgtcat cccggcgagc 420 gtcattggcg catttgccag cggtaacatt ctgcaggtgc tgctgtttgc cgtactgttt 480 ggttttgcgc tccaccgtct gggcagcaaa ggccaactga tttttaacgt catcgaaagt 540 ttctcgcagg tcatcttcgg catcatcaat atgatcatgc gtctggcacc tattggtgcg 600 ttcggggcaa tggcgtttac catcggtaaa tacggcgtcg gcacactggt gcaactgggg 660 cagctgatta tctgtttcta cattacctgt atcctgtttg tggtgctggt attgggttca 720 atcgctaaag cgactggttt cagtatcttc aaatttatcc gctacatccg tgaagaactg 780 ctgattgtac tggggacttc atcttccgag tcggcgctgc cgcgtatgct cgacaagatg 840 gagaaactcg gctgccgtaa atcggtggtg gggctggtca tcccgacagg ctactcgttt 900 aaccttgatg gcacatcgat atacctgaca atggcggcgg tgtttatcgc ccaggccact 960 aacagtcaga tggatatcgt ccaccaaatc acgctgttaa tcgtgttgct gctttcttct 1020 aaaggggcgg caggggtaac gggtagtggc tttatcgtgc tggcggcgac gctctctgcg 1080 gtgggccatt tgccggtagc gggtctggcg ctgatcctcg gtatcgaccg ctttatgtca 1140 gaagctcgtg cgctgactaa cctggtcggt aacggcgtag cgaccattgt cgttgctaag 1200 tgggtgaaag aactggacca caaaaaactg gacgatgtgc tgaataatcg tgcgccggat 1260 ggcaaaacgc acgaattatc ctcttaa 1287 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aaaaatcaat gagtaaaggg ataaagaatt cac 33 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctctagatt atttcatact accagttttt ataaa 35 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaaaatcaat gagtaatgaa gtatctataa aag 33 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctctagatt agataaaaaa gaggacattt cacaatatgg 40 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aaaaatcaat ggcgtttatc tactatctg 29 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gctctagatt acatggactg ctcaagcata c 31 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggaattcatg aaaacctctc tgtttaaaag c 31 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctctagatt aagaggataa ttcgtgcgtt ttgcc 35

Claims

포도당 인산전이효소를 코딩하는 유전자(ptsG) 및 피루베이트 키나아제를 코딩하는 유전자(pykA 및 pykF)가 모두 결실되어 있는 숙신산 고생성능을 가지는 대장균 변이체에서,

Cat1(succinyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, SucD(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 4hbD(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 GHB(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 숙신산(succinate)을 4HB(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고,

숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자인 GabD(succinic semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는

4HB 고생성능을 가지는 변이체.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 숙신산 고생성능을 가지는 대장균 변이체는 W3110GFA인 것을 특징으로 하는 변이체.
제1항에 있어서, 상기 숙신산을 4HB로 전환하는 효소의 유전자와 상기 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 유래인 것을 특징으로 하는 변이체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 Cat1을 코딩하는 유전자는 서열번호 1, SucD를 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 4hbD를 코딩하는 유전자는 서열번호 3 및 GHB를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 GabD를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
제1항, 제11항, 제12항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 숙신산의 운송에 관여하는 DctA(C4-dicarboxylate transport protein)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
제17항에 있어서, 상기 DctA를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
제1항에 있어서, 상기 숙신산 고생성능을 가지는 대장균 변이체에서 GabD를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, Cat1을 코딩하는 유전자, SucD를 코딩하는 유전자, 4hbD를 코딩하는 유전자 및 GHB를 코딩하는 유전자가 모두 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4HB 고생성능을 가지는 변이체.
제19항에 있어서, 숙신산의 운송에 관여하는 DctA(C4-dicarboxylate transport protein)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
제1항, 제11항, 제12항, 제14항, 제16항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항의 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 4HB(4-hydroxybutyrate)를 수득하는 것을 특징으로 하는 4HB의 제조방법.
제17항의 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 4HB(4-hydroxybutyrate)를 수득하는 것을 특징으로 하는 4HB의 제조방법.