CN104395456A - 生产d-乳酸的新型菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备D-乳酸生产菌株的方法，该菌株被修饰以在L-乳酸生产菌株中抑制L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性并引入D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性；通过上述方法制备的突变的D-乳酸生产菌株；和生产D-乳酸的方法，其包括培养菌株和从培养基中回收D-乳酸的步骤。

Description

生产D-乳酸的新型菌株及其用途
发明背景
1.发明领域
本发明涉及新型D-乳酸生产菌株及其用途。具体地，本发明涉及制备D-乳酸生产菌株的方法，其包括以下步骤：抑制L-乳酸生产菌株中L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性并引入D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性；通过上述方法制备的修饰的D-乳酸生产菌株；和生产D-乳酸的方法，其包括以下步骤：培养菌株和从培养肉汤(culture broth)中回收D-乳酸。
2.相关技术的描述
乳酸在食品、药品、化妆品等方面具有广泛的工业应用。近几年，乳酸已被用作聚乳酸单体，从而对乳酸的需求有了显著的增长。
可通过化学合成或通过使用碳水化合物作为底物的生物发酵方法生产乳酸。从商业角度来看优选后者，因为乳酸的化学合成会引起由气体价格上涨造成的成本增加或环境污染的问题。此外，还存在的问题有生成由等量的D-乳酸和L-乳酸组成的外消旋混合物形式的L-乳酸。不幸的是，无法控制D-乳酸和L-乳酸的组成比率。当使用外消旋混合物形式的乳酸制备聚乳酸时，产生低熔点的无定形聚合物，从而限制了其应用。另一方面，使用微生物的生物发酵方法可依据所使用的菌株而选择性地生产D-乳酸或L-乳酸。例如，诸如乳杆菌(Lactobacillus sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)或肠道球菌(Enterococcus sp.)的微生物通常生产L-乳酸。诸如明串珠菌(Leuconostoc sp.)和Lactobacillusvulgaricus的微生物通常生产D-乳酸。尤其是，由于D-乳酸不在体内代谢，D-乳酸可作为生物材料应用于医药领域并且通过酯化作用和氯化作用还可用作光学活性除草剂。已经知道，光学活性除草剂可以显著提高其药效并且用较小的量也有相同的药效。为此，对D-乳酸的需求不断增加。此外，sc-聚乳酸(立构复合物-PLA)的熔点和热降解温度明显高于已知的聚乳酸。因此，其可用作由纯L-聚乳酸和纯D-聚乳酸的混合物所产生的高耐热性塑料材料。因此，需要D-乳酸单体，并且它的需求正在逐渐增加。
在生产此类光学纯D-乳酸中，优选采用微生物酶的对映选择性底物特异性的生物发酵方法。然而，通常发现于自然界中的野生型D-乳酸生产微生物就光学纯度和生产率而言仍不适用于工业用途。D-乳酸生产微生物的例子为植物乳杆菌(Lb.plantarum)、戊糖乳杆菌(Lb.pentosus)、发酵乳杆菌(Lb.fermentum)、德氏乳杆菌(Lb delbrueckii)等。然而，存在的缺点有，它们不能以高生产率和高收率生产乳酸，并且20～40％的乳酸是作为光学杂质的L-乳酸。为了克服这些缺点，进行了许多尝试，以通过用EMS(甲基磺酸乙酯)处理诱导乳酸生产细菌中的突变从而开发在高葡萄糖培养基中生产高浓度乳酸的变体(J.Industrial Microbiol,11:23-28,1992)。结果，选出显示比对照组高约4.8倍生产率的菌株，但是其活性在长期储存过程中会降低。同时，在使用变体进行菌株开发的情况下，收率改进的菌株倾向于显示降低的生产率，而生产率改进的菌株倾向于显示降低的收率。
基于这样的构思：用于工业乳酸发酵的菌株通常是L-乳酸生产微生物，并且这些微生物相比于D-乳酸生产微生物大多数都有优异的生产率和收率，本发明人发现，可以通过在高L-乳酸生产微生物中使L-乳酸脱氢酶(L-LDH)编码基因失活，然后在其中引入异源D-乳酸脱氢酶(D-LDH)编码基因而以高收率生产D-乳酸，从而完成本发明。
发明概述
本发明的实施方式提供制备修饰的D-乳酸生产菌株的方法，其包括以下步骤：在L-乳酸生产菌株中使L-乳酸脱氢酶活性减弱或失活并使D-乳酸脱氢酶活性引入或增强。
本发明的其它实施方式提供修饰的D-乳酸生产菌株，该菌株通过上述方法制备。
本发明的另一个实施方式提供使用修饰的D-乳酸生产菌株生产D-乳酸的方法。
附图简述
图1显示了一张图表，其呈现出由10种不同类型的野生型乳酸生产微生物生产的D-乳酸和L-乳酸比率的分析结果。
优选实施方式详述
本发明的实施方式提供通过在L-乳酸生产菌株中使L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性减弱或失活并使D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性引入或增强而制备修饰的D-乳酸生产菌株的方法。
具体地，制备本发明的修饰的D-乳酸生产菌株的方法包括：(a)在L-乳酸生产菌株中使L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性减弱或失活，以获得修饰的乳酸生产菌株；和(b)在修饰的乳酸生产菌株中使D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性引入或增强。
在这方面，L-乳酸生产菌株可以是只表达L-LDH编码多核苷酸以生产L-乳酸的菌株，或者是同时表达L-LDH编码多核苷酸和D-LDH编码多核苷酸以生产L-乳酸和D-乳酸的菌株。使L-LDH活性减弱或失活的方法可以通过在一个或多个L-LDH编码多核苷酸的位置进行取代、缺失、插入或添加一个或几个核苷酸来完成。使D-LDH活性引入或增强的方法可以通过以下完成：将D-LDH编码多核苷酸引入到修饰的乳酸生产菌株的染色体中，将编码具有改进活性的D-LDH变体的多核苷酸引入到修饰的乳酸生产菌株的染色体中，将强启动子引入突变的乳酸生产菌株的染色体中的D-LDH编码多核苷酸上游，将强启动子和可操作地连接至启动子的D-LDH编码多核苷酸引入修饰的乳酸生产菌株的染色体中，将强启动子和编码具有改进活性的D-LDH变体的多核苷酸——其可操作地连接至启动子——引入修饰的乳酸生产菌株的染色体中，将包含D-LDH编码多核苷酸的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株中，将包含编码具有改进活性的D-LDH变体的多核苷酸的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株中，将包含强启动子和可操作地连接至启动子的D-LDH编码多核苷酸的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株中，将包含强启动子和编码具有改进活性的D-LDH变体的多核苷酸——其可操作地连接至启动子——的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株中，等等。
本文所使用的术语“乳酸脱氢酶(LDH)”是指一种酶，其通过去除氢催化从乳酸生产丙酮酸或通过还原使用(reductionusing)NADH催化从丙酮酸生产乳酸。LDH具有约140kDa的分子量，并且其可分为生产L-乳酸的L-LDH(EC 1.1.1.27.)、生产D-乳酸的D-LDH(EC1.1.1.28.)和含有FMN和血红素的L-LDH(细胞色素b2，EC 1.1.2.3)。
本文所使用的术语“L-乳酸生产菌株”是指一种菌株，其表达L-LDH编码多核苷酸并使用表达的L-LDH生产L-乳酸。此外，该菌株还包括通过与通过只表达L-LDH编码多核苷酸而生产L-乳酸的菌株同时表达L-LDH编码多核苷酸和D-LDH编码多核苷酸的菌株而生产L-乳酸和D-乳酸的菌株。该L-乳酸生产菌株没有具体限定，只要其可以生产L-乳酸。例如，可以使用短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，具体地，可以使用鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌，更具体地，可以使用副干酪乳杆菌。
使L-乳酸生产菌株中的L-LDH活性减弱或失活的方法可以使用本领域已知的方法来完成。例如，抑制L-LDH编码多核苷酸的表达或生产失活的L-LDH的方法可以是取代、缺失、插入或添加L-乳酸生产菌株中固有的L-LDH编码多核苷酸的一个或几个核苷酸的方法，具体地2至20个核苷酸，更具体地2至10个核苷酸，进一步更具体地2至5个核苷酸。此外，可使用任何方法而没有具体限制，只要其用于使L-乳酸生产菌株中L-LDH活性减弱或失活。
本发明中，将要减弱或失活的L-LDH可以是L-乳酸生产菌株中固有的。L-LDH的氨基酸序列或编码其的多核苷酸序列没有具体限制。L-LDH可以由编码副干酪乳杆菌的LDH的多核苷酸序列(SEQ ID NO:25)和编码副干酪乳杆菌的LDH1的多核苷酸序列(SEQ ID NO:26)、编码干酪乳杆菌的LDH1的多核苷酸序列(SEQ ID NO:27)和编码干酪乳杆菌的LDH2的多核苷酸序列(SEQ ID NO:28)、编码鼠李糖乳杆菌的LGG_02523的多核苷酸序列(SEQ ID NO:29)和编码鼠李糖乳杆菌的LGG_00606的多核苷酸序列(SEQ ID NO:30)表示。
本文所使用的术语“修饰的乳酸生产菌株”是指L-LDH活性减弱或失活的L-乳酸生产菌株。乳酸生产菌株可以通过在正常的L-乳酸生产菌株中诱导人工突变，或通过天然发生突变而没有诱导人工突变被修饰以使L-LDH活性减弱或失活。
使修饰的乳酸生产菌株中D-LDH活性引入或增加的方法可以是，但不具体限于，将D-LDH编码多核苷酸引入修饰的乳酸生产菌株的染色体中的方法、将编码具有改进活性的D-LDH变体的多核苷酸引入突变的乳酸生产菌株中的方法、将强启动子引入修饰的乳酸生产菌株的染色体中的D-LDH编码多核苷酸上游的方法、将强启动子和可操作地连接至启动子的D-LDH编码多核苷酸引入修饰的乳酸生产菌株的染色体中的方法、将强启动子和编码具有改进活性的D-LDH变体的多核苷酸——其可操作地连接至启动子——引入修饰的乳酸生产菌株的染色体中的方法、将包含D-LDH编码多核苷酸的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株中的方法、将包含编码具有改进活性的D-LDH变体的D-LDH编码多核苷酸的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株的方法、将包含强启动子和可操地连接至启动子的D-LDH编码多核苷酸的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株中的方法、将包含强启动子和编码具有改进活性的D-LDH变体的多核苷酸——其可操作地连接至启动子——的表达载体引入修饰的乳酸生产菌株中的方法，等等。
本文所使用的术语“表达载体”是指包含编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA产物，其可操作地连接至合适的调节序列，以在合适的宿主中表达编码靶蛋白的多核苷酸。该调节序列可包括能够启动转录的启动子、调节转录的任意操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及调节转录和翻译终止的序列。一旦载体转化到合适的宿主中，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥功能，或者可以整合到其自身基因组。
只要其在宿主中可复制，任何本领域已知的载体都可用作本发明中的表达载体，而没有具体限制。通常使用的表达载体的例子可包括天然的或重组的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。噬菌体载体或粘粒载体的例子可包括pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A。质粒载体可包括pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。
详细地，本发明实施方式中所使用的载体为pG+host6，其为一种在多种革兰氏阳性细菌中使用的载体。该载体的特征在于，其包含氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌(E.coli)中使用的复制起点、红霉素抗性基因和革兰氏阳性细菌中使用的复制起点。具体地，革兰氏阳性细菌中的复制起点包含热敏突变，因而，在37℃以上的温度下不发生复制。因此，其允许经由革兰氏阳性细菌中的同源序列的基因插入(美国专利申请公开号20060025190)。
本文所使用的术语“转化”意思是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中、在宿主细胞中表达多核苷酸和生产表达产物、mRNA或蛋白质的一系列操作。待引入宿主细胞中的多核苷酸可以是任何形式，只要其可以引入宿主细胞中并且在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞中，该表达盒是一种包含所有自表达需要的元件(可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、翻译终止信号等)的结构。该表达盒可以是自复制表达载体的形式。此外，可以将多核苷酸本身引入宿主细胞中，以可操作地连接至在宿主细胞中表达所需要的序列。
本发明中所使用的D-LDH可以是，但不具体限于，来自生产D-乳酸的菌株。具体地，来自植物乳杆菌或德氏乳杆菌，以及进一步更具体地，由德氏乳杆菌的SEQ ID NO:31的氨基酸序列或植物乳杆菌的SEQ ID NO:32的氨基酸序列所表示的多肽。此外，可包括在SEQ IDNO:31或32的氨基酸序列的一个或多个位置一个氨基酸或几个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位(可取决于蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型，具体地2至20个，更具体地2至10个，进一步更具体地2至5个氨基酸)。只要其可以保持或增强D-LDH活性，可包括与SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列具有80％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、进一步更具体地97％或更多同源性的氨基酸序列。由于酶的氨基酸序列可根据微生物的种类或菌株而有所不同，所以氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位还包括天然发生的突变序列或人工突变序列，但不具体限于此。
本文所使用的术语“同源性”是指两种不同氨基酸序列或两种不同核苷酸序列之间的同一性，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法确定。例如，可以使用BLAST 2.0计算参数，如分数、同一性和相似性，但不具体限于此。
通常，L-乳酸生产菌株以比D-乳酸生产菌株更高的生产收率生产乳酸。因此，本发明人意图通过将L-乳酸生产菌株修饰为D-乳酸生产菌株而制备具有优异D-乳酸生产率的菌株。为此，在野生型乳杆菌菌株之间比较了D-乳酸和L-乳酸的发酵比率。结果，发现副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌显示出优异的乳酸整体生产率，并且它们的L-乳酸比率是极其优异的。因此，本发明人意图制备其修饰的菌株(图1)。例如，将副干酪乳杆菌中L-LDH的ldh和ldh1基因缺失，与此同时，制备用于D-LDH插入的盒sδldh1-ldhA(Lb.db)和δldh-ldhD(Lb.pl)，然后将它们中的每一个引入热敏载体pG+host6中，以制备两种类型的载体pG+host6-δldh1-ldhA(Lb.db)和pG+host6-δldh-ldhD(Lb.pl)(实施例3)。随后，将每个载体引入L-LDH基因缺失的副干酪乳杆菌中，以制备转化体，该转化体被修饰以使L-LDH活性减弱或失活并使D-LDH活性增强(实施例4)。因此，培养所制备的转化体，并分析从其中生产的乳酸。结果，D-乳酸以41.6g/L的浓度生产，而没有生产L-乳酸。本发明中生产的D-乳酸的生产收率高于由已知D-乳酸生产菌株所生产的D-乳酸的生产收率(实施例5)。
因此，当在具有高乳酸生产收率的L-乳酸生产菌株中使L-LDH活性减弱或失活并且使D-LDH活性引入或增强时，可以以比c已知D-乳酸生产菌株更高的收率生产D-乳酸。
本发明的实施方式提供了一种D-乳酸生产菌株，其被修饰以使用上述方法在显示L-LDH活性的L-乳酸生产菌株中使L-LDH活性减弱或失活并使D-LDH活性引入或增强。
修饰的D-乳酸生产菌株可以是一种菌株，其中D-LDH编码多核苷酸在L-乳酸生产菌株染色体中取代L-LDH编码多核苷酸或者过量表达。修饰的D-乳酸生产菌株，虽然没有具体地限制，但可以是一种菌株，其中编码干酪乳杆菌的LDH1的多核苷酸(SEQ ID NO:27)和编码干酪乳杆菌的LDH2的多核苷酸(SEQ ID NO:28)分别用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸进行取代；一种菌株，其中编码鼠李糖乳杆菌的LDH(LGG_02523)的多核苷酸(SEQ ID NO:29)和编码鼠李糖乳杆菌的LDH(LGG_00606)的多核苷酸(SEQ ID NO:30)分别用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸进行取代；一种菌株，其中编码副干酪乳杆菌的LDH的多核苷酸(SEQ ID NO:25)和编码副干酪乳杆菌的LDH1的多核苷酸(SEQ ID NO:26)分别用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸进行取代。具体地，修饰的D-乳酸生产菌株可以是一种菌株，其中编码副干酪乳杆菌的LDH的多核苷酸(SEQ ID NO:25)和编码副干酪乳杆菌的LDH1的多核苷酸(SEQ ID NO:26)分别用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸进行取代，更具体地，副干酪乳杆菌CC02-0095(KCCM11273P)。
本发明人使用每一个转化体来生产D-乳酸，所述转化体被修饰以将副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株中的每个L-LDH编码多核苷酸缺失并将编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸分别引入它们之中。比较D-乳酸的收率、生产率和产量等。结果，确定来自副干酪乳杆菌(Lb.paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD)的转化体的D-乳酸收率、生产率和产量最优异。
因此，本发明人将转化体(Lb.paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD)指定为副干酪乳杆菌CC02-0095，其中该转化体的D-乳酸收率、生产率和产量最优异。CC02-095是一种通过用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸来取代编码副干酪乳杆菌的LDH的多核苷酸(SEQ ID NO:25)和编码副干酪乳杆菌的LDH1的多核苷酸(SEQ ID NO:26)而制备的菌株。根据布达佩斯条约，该转化体于2012年4月2日保藏于韩国微生物保藏中心(在下文中，缩写为“KCCM”)，保藏号为KCCM11273P。
本发明的另一个实施方式提供生产D-乳酸的方法，其包括以下步骤：(a)培养修饰的D-乳酸生产菌株以获得培养肉汤；和(b)从培养肉汤中回收D-乳酸。
为了使菌株生产D-乳酸，本发明的修饰的D-乳酸生产菌株是由具有优异乳酸生产率的L-乳酸生产菌株制备的菌株。因此，当培养该修饰的D-乳酸生产菌株时，生产的D-乳酸可以在菌株内或者在培养基中积累。因此，D-乳酸可以通过回收在培养的菌株中或者在培养基中积累的D-乳酸而获得。
本文所使用的术语“培养”意思是在温和可控制的人工环境条件下生长微生物的所有操作。本发明中，为了从修饰的D-乳酸生产菌株中生产D-乳酸的目的而进行培养，并且具体的培养方法并不受特别限制，只要其可以从修饰的D-乳酸生产菌株生产D-乳酸。可使用本领域广泛已知的任何方法进行。具体地，可通过分批法、分批补料法或连续法进行。
具体地，用于培养的培养基要以适当的方式满足具体菌株的要求，同时在含有适当碳源、氮源、氨基酸、维生素等的典型培养基中在需氧条件下控制温度、pH等。可能的碳源可包括作为主要碳源的葡萄糖和木糖的混合物；糖类和碳水化合物如：蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和维生素；油类和脂肪类如：大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子脂；脂肪酸如：软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇类如：甘油和乙醇；和有机酸如：乙酸。这些物质可单独或组合使用。可能的氮源可包括无机氮源如：氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸如：谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；和有机氮源如：蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼肉或其分解产物和脱脂大豆饼或其分解产物。这些氮源可单独或组合使用。培养基可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。可能的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐。进一步，可以使用无机化合物如氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰和碳酸钙。除上述物质之外，可包括必要的生长物质如：氨基酸和维生素。适当的前体也可添加到培养基。在培养期间，上述物质可以适当地以分批法、分批补料法或连续法添加到培养基，但不具体限于这些。可通过适当地添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或酸性化合物如磷酸和硫酸来调节培养物的pH值。
可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯，以抑制泡沫的形成。为了维持需氧条件，将氧气或含氧气体(例如，空气)引入培养肉汤中。培养肉汤的温度通常为27℃至37℃，具体地30℃至35℃。可以连续培养直到D-乳酸的生产达到预期水平，并且通常连续进行10至100小时。D-乳酸可以被释放到培养基中或包含在细胞内。
此外，从培养肉汤回收D-乳酸可以通过本领域已知的方法进行。具体地，回收D-乳酸的已知方法没有具体限制，只要该方法可以回收培养肉汤中的D-乳酸。具体地，可以使用离心、过滤、萃取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀等)或色谱(如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱和尺寸排阻色谱等)。
下文中，将参考实施例对本发明进行详细描述。但是，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明不意图受这些实施例限制。
实施例1:野生型乳杆菌菌株的D-乳酸和L-乳酸的发酵比率的分 析
将10种类型的野生型乳酸生产菌株每一种接种于50ml GY培养基(5％葡萄糖、1％酵母提取物、0.05％柠檬酸钠、3％CaCO3、0.02％MgSO4、0.001％MnSO4、0.001％FeSO4和0.001％NaCl)中，然后在需氧条件下于37℃培养40小时，然后对发酵肉汤中D-乳酸和L-乳酸的比率进行HPLC分析。图1显示了一张图表，其呈现出由10种类型的野生型乳酸生产菌株生产的D-乳酸和L-乳酸比率的分析结果。
从10种类型的菌株中选出显示高乳酸生产率和更高L-乳酸比率的副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。选出的菌株被修饰以生产D-乳酸。
实施例2:L-乳酸脱氢酶(L-LDH)的核苷酸序列的比较
为了缺失实施例1中所选的每个菌株中诱导L-乳酸过量生产的基因，通过搜索美国国家生物技术信息中心(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov//www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行比较和分析所选菌株的L-LDH编码基因之间的同源性(表1)。
[表1]
副干酪乳杆菌的L-LDH基因和同源基因之间的同源性比较。
如表1所示，3种类型的乳酸生产菌株的L-LDH编码基因彼此具有非常相似的核苷酸序列，尤其是，干酪乳杆菌的ldh1已知是重要的L-乳酸生产基因(J.Ind.Microbiotechnol.,2008,35:579-586)。同时，干酪乳杆菌的ldh2是另一个L-乳酸生产基因。将ldh1和ldh2基因缺失以制备生产光学纯的D-乳酸的菌株。总之，从全部3种类型的亲本菌株之中，选择副干酪乳杆菌的ldh和ldh1基因、干酪乳杆菌的ldh1和ldh2基因和鼠李糖乳杆菌的2种类型的ldh基因作为用于缺失的基因。
实施例3:L-LDH-缺失/D-LDH-插入载体的构建
制备副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的L-LDH基因缺失的载体，L-LDH基因为实施例2中选出的L-LDH基因。为了制备同时缺失L-LDH和插入D-LDH的盒，与副干酪乳杆菌的ldh和ldh1、干酪乳杆菌的ldh1和ldh2和鼠李糖乳杆菌的LGG02523和LGG00606的ORF邻近的序列用作同源核苷酸序列，并制备SEQ ID NOs.1至24的引物(表2)。
[表2]
引物的核苷酸序列
使用副干酪乳杆菌的基因组作为模板和SEQ ID NOS.1和2的引物以及SEQ ID NOS:5和6的引物将ldh基因ORF的5’区(ldh.pc_UP_700)的700个碱基对序列和3’区(ldh.pc_DOWN_700)的700个碱基对序列进行扩增。使用SEQ ID NOS.7和8的引物以及SEQ ID NOS:11和12的引物同样将ldh1基因ORF的5’区(ldh1.pc_UP_700)的700个碱基对序列和3’区(ldh1.pc_DOWN_700)的700个碱基对序列进行扩增。
同时，为了扩增D-LDH基因，使用德氏乳杆菌和植物乳杆菌的基因组作为模板和SEQ ID NOS.3和4的引物，以及SEQ ID NOS:9和10的引物来制备ldhA(Lb.db)和ldhD(Lb.pl)的DNA片段。
随后，使用扩增的DNA片段、ldh.pc_UP_700、ldh.pc_DOWN_700和ldhA(Lb.db)以及SEQ ID NOS.1和6的引物进行重叠PCR，以制备δldh.pc-ldhA(Lb.db)盒。该δldh.pc-ldhA(Lb.db)盒具有与ldh ORF区邻近的序列同源的核苷酸序列，并且D-乳酸脱氢酶位于盒的中心。进一步，ldh1基因经历相同的步骤，以制备δldh1.pc-ldhD(Lb.pl)盒。在这方面，每个盒被设计以包含5’-末端的XhoI限制酶位点和3’-末端的SpeI限制酶位点。
由于干酪乳杆菌的ldh1和ldh2基因分别与副干酪乳杆菌的ldh和ldh1基因非常相似，使用相同的引物。使用干酪乳杆菌的基因组作为模板和SEQ ID NOS.1和2的引物，以及SEQ ID NOS:5和6的引物将ldh1.ca_UP_700和3’区(ldh1.ca_DOWN_700)的700个碱基对序列进行扩增。使用SEQ ID NOS.7和8的引物以及SEQ ID NOS:11和12的引物同样将5’区(ldh2.ca_UP_700)的700个碱基对和3’区(ldh2.ca_DOWN_700)的700个碱基对序列进行扩增。
随后，使用ldh1.ca_UP_700、ldh1.ca_DOWN_700、ldhA(Lb.db)以及SEQ ID NOS.1和6的引物进行重叠PCR，以制备δldh1.ca-ldhA(Lb.db)盒。该δldh1.ca-ldhA(Lb.db)盒具有与ldh ORF区邻近的序列同源的核苷酸序列，并且D-乳酸脱氢酶位于盒的中心。进一步，ldh2基因经历相同的步骤以制备δldh2.ca-ldhD(Lb.pl)盒。
使用鼠李糖乳杆菌的基因组作为模板和SEQ ID NOS.13和14的引物，以及SEQ ID NOS.17和18的引物将LGG_02523基因ORF的5’区(LGG_02523_UP_700)的700个碱基对序列和3’区(LGG_02523_DOWN_700)的700个碱基对序列进行扩增。使用SEQ ID NOS.19和20的引物以及SEQ ID NOS:23和24的引物同样将LGG_00606基因ORF的5’区(LGG_00606_UP_700)的700个碱基对序列和3’区(LGG_00606_DOWN_700)的700个碱基对序列进行扩增。
同时，为了扩增D-LDH基因，使用德氏乳杆菌和植物乳杆菌的基因组作为模板和SEQ ID NOS.15和16的引物，以及SEQ ID NOS:21和22的引物来制备ldhA(Lb.db)和ldhD(Lb.pl)的DNA片段。
随后，使用扩增的DNA片段、LGG_02523_UP_700、LGG_02523_DOWN_700、ldhA(Lb.db)，以及SEQ ID NOs.13和18的引物进行重叠PCR，以制备δLGG_02523-ldhA(Lb.db)盒。该δLGG_02523-ldhA(Lb.db)盒具有与LGG_02523ORF区同源的核苷酸序列，并且D-乳酸脱氢酶位于盒的中心。进一步，LGG_00606基因经历相同的步骤，以制备δLGG_00606-ldhD(Lb.pl)盒。在这方面，每个盒被设计以包含5’-末端的XhoI限制酶位点和3’-末端的SpeI限制酶位点。
随后，使用XhoI和SpeI限制酶位点将6种类型的盒中的每一个克隆到热敏载体pG+host6中，该载体的特征在于，它包含氨苄青霉素-和红霉素-抗性基因，从而用作大肠杆菌-乳酸细菌的穿梭载体，并且它于42℃在乳杆菌中不扩增。因此，制备出6种类型的载体：pG+host6-δldh.pc-ldhA(Lb.db)和pG+host6-δldh1.pc-ldhD(Lb.pl)、pG+host6-δldh1.ca-ldhA(Lb.db)和pG+host6-δldh2.ca-ldhD(Lb.pl)以及pG+host6-δLGG_02523-ldhA(Lb.db)和pG+host6-δLGG_00606-ldhD(Lb.pl)。
实施例4:转化体的制备
将在MRS固体培养基中培养一天的副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌菌株接种于10ml MRS培养基中，然后于37℃静置培养一天。将50ml MRS放于50ml试管中，并在其中接种500μl培养一天的每个菌株，然后于37℃静置培养3小时30分钟。当OD600达到0.8时，将培养肉汤放于冰浴中5分钟。其后，通过离心将培养基从培养肉汤中去除，只获得菌株。用洗涤缓冲液(5mM磷酸钠、1mM MgCl2、pH 7.4)冲洗菌株两次。随后，将25μl 0.5M蔗糖溶液添加到菌株，然后进行悬浮。将其分为各50μl。将每200ng的实施例3中制备的载体添加到菌株，然后在1800v、25F和200Ω的条件下进行电穿孔。其后，将菌株于37℃在500μl MRS中培养2小时，然后涂布于含10μg/ml红霉素的MRS固体培养基(MRSE)上，并于30℃培养3天，得到菌落。
实施例5:D-ldh插入的菌株的制备
在实施例4所获得的菌落中，将一部分从来自副干酪乳杆菌(引入有含来自德氏乳杆菌的ldhA的pG+host6-δldh1-ldhA质粒的乳杆菌菌株)的转化体获得的菌落接种于含10μg/ml红霉素的1ml液体MRS培养基中，然后于42℃静置培养一天，用于诱导初次交换。将100μl培养肉汤涂布于固体MRSE培养基上，并且温育7天，得到菌落。将每个单菌落于42℃在固体MRSE培养基上传代培养2天。将每个获得的菌株接种于含1ml MRS的1.5ml试管中，然后于37℃静置培养一天，用于诱导二次交换。将一部分于37℃培养的菌株进行菌落PCR，以检查在ldh1区的ldhA(Lb.db)基因的插入，并在固体MRS培养基上选出单菌落。将单菌落进行PCR，以检查ldh基因的缺失和D-乳酸脱氢酶的插入，最后，制得ldh1::ldhA(Lb.db)菌株。该菌株用作亲本菌株，并且以相同的方式进行ldh缺失和ldhD(Lb.pl)插入，以制备最终的D-乳酸生产菌株，其中两种类型的L-乳酸脱氢酶缺失。
同时，干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌进行相同的步骤，以制备D-乳酸生产菌株，其中两种类型的L-乳酸脱氢酶缺失。
比较实施例1:新型修饰的D-型乳杆菌的乳酸发酵的检测
在本发明中制备的新型修饰的D-型乳杆菌和2种类型的基于植物乳杆菌的已知重组D-乳酸生产菌株之间的发酵结果。在这方面，基于植物乳杆菌的已知重组D-乳酸生产菌株是一种菌株，其中2种类型的其自己的L-乳酸脱氢酶的任一种或两种均被缺失，并且其通过由Okano等人公开论文(Appl.Environ.Microbiol.(2009)462～467)中的相似方法而制备。这些菌株具有ldhL1或ldhL2基因缺失，并且生产具有光学纯度为99％或更高的D-乳酸。
在具体的对照实验中，将2种类型的基于植物乳杆菌的D-乳酸生产菌株和新型的3种类型的重组乳杆菌菌株在固体MRS培养基上培养一天，并将每一个获得的细胞环接种于液体MRS中，然后于37℃培养一天。将全部5种类型的重组乳杆菌菌株以在600nm处0.1的初始细胞光密度接种于含25ml GY液体培养基的250ml-挡板烧瓶中。该实验是在温度为37℃、以100rpm震荡的培养箱中实施的。总培养时间为42小时。在初始接种时间和最终发酵时间收集培养肉汤样品，并将其适当的量离心，以获得上清液，然后进行HPLC。结果，初始葡萄糖浓度为53g/l。分析的数据为重复两次实验结果的平均值。结果总结于下表3中。酶定量显示所有样品中生产的乳酸均为光学纯的D-乳酸(乳酸，R-Biopharm，德国)。
[表3]
菌株间的乳酸生产率的比较
如表3所示，发现本发明中制备的3种类型的新型重组乳杆菌菌株比已知的菌株(植物乳杆菌ΔldhL1和植物乳杆菌ΔldhL1ΔldhL2)——其中2种类型其自己的L-乳酸脱氢酶的任一种或两种被缺失——具有更高的D-乳酸收率、生产率和产量。尤其是，发现来自副干酪乳杆菌的转化体(副干酪乳杆菌ldh::ldhA ldh1::ldhD)具有最高的D-乳酸收率、生产率和产量。
因此，本发明人将转化体(副干酪乳杆菌ldh::ldhA ldh1::ldhD)指定为副干酪乳杆菌CC02-0095。该转化体——其通过用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸取代编码副干酪乳杆菌的LDH的多核苷酸(SEQ ID NO:25)和编码副干酪乳杆菌的LDH1的多核苷酸(SEQID NO:26)而被修饰——的D-乳酸收率、生产率和产量是最优异的。该转化体于2012年4月2日保藏于韩国微生物保藏中心(在下文中，缩写为“KCCM”，根据布达佩斯条约)，保藏号为KCCM11273P。
在不背离本发明的范围和精神的情况下进行的各种修改和改变将对本领域技术人员是显而易见的。因此，应理解，在所有方面，上述实施方式并不是限制性的，而是说明性的。本发明的范围不仅包括所附的权利要求，还包括权利要求所涵盖范围的所有修改和改变或者等同物。
发明效果
本发明的D-乳酸生产菌株是由具有优异乳酸生产率的L-乳酸生产菌株制备而成，从而其具有优异的D-乳酸生产率。因此，该菌株可广泛用于提高使用D-乳酸作为原料制备的各种产物的生产率。
关于用于专利程序的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约国际表格
CJ第一制糖株式会社
                                原始保藏接收证明
CJ CHEILJEDANG CENTER
                                由本页底部确定的国际保藏
292， SSANGRIM-DONG
                                机构依照第7.1条发布
JUNG-GU，首尔，
大韩民国
                证明上述翻译与原文内容没有相互违背
                         2012年4月24日
                       专利代理人 Son Min印

Claims (24)

1.D-乳酸生产菌株，其被修饰以使L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性减弱或失活并使D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性增强。
2.根据权利要求1所述的菌株，其中L-LDH编码多核苷酸被失活。
3.根据权利要求2所述的菌株，其中所述L-LDH编码多核苷酸选自副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的ldh(SEQ ID NO:25)和ldh1(SEQ ID NO:26)、副干酪乳杆菌的ldh1(SEQ ID NO:27)和ldh2(SEQ ID NO:28)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的ldh(LGG_02523)(SEQ ID NO:29)和ldh(LGG_00606)(SEQ ID NO:30)。
4.根据权利要求1所述的菌株，其中D-LDH编码多核苷酸被引入。
5.根据权利要求4所述的菌株，其中所述D-LDH编码多核苷酸来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)。
6.根据权利要求5所述的菌株，其中所述D-LDH编码多核苷酸是编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸或者编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸。
7.根据权利要求1所述的菌株，其中一个或多个异源D-LDH编码多核苷酸在染色体中取代L-LDH编码多核苷酸并且过量表达。
8.根据权利要求1所述的菌株，其中在修饰之前的所述菌株为生产L-乳酸的菌株。
9.根据权利要求8所述的菌株，其中所述菌株是乳杆菌(Lactobacillus sp)菌株。
10.根据权利要求8所述的菌株，其中编码干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的LDH1的多核苷酸(SEQ ID NO:27)和编码干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的LDH2的多核苷酸(SEQ ID NO:28)分别用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸取代。
11.根据权利要求8所述的菌株，其中编码副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的LDH的多核苷酸(SEQ ID NO:25)和编码副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的LDH1的多核苷酸(SEQID NO:26)分别用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸取代。
12.根据权利要求8所述的菌株，其中编码鼠李糖乳杆菌的LDH(LGG_02523)的多核苷酸(SEQ ID NO:29)和编码鼠李糖乳杆菌的LDH(LGG_00606)的多核苷酸(SEQ ID NO:30)分别用编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸和编码植物乳杆菌的LDHD(SEQ ID NO:32)的多核苷酸取代。
13.根据权利要求12所述的菌株，其中其是保藏号为KCCM11273P的副干酪乳杆菌CC02-0095。
14.制备修饰的D-乳酸生产菌株的方法，包括：
(a)在L-乳酸生产菌株中使L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性减弱或失活，以获得修饰的乳酸生产菌株；和
(b)在所述修饰的乳酸生产菌株中使D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性引入或增强。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述L-乳酸生产菌株是乳杆菌(Lactobacillus sp)菌株。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述L-乳酸生产菌株选自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
17.根据权利要求14所述的方法，其中通过L-LDH编码多核苷酸的取代、缺失、插入或添加使所述L-LDH活性减弱或失活。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述L-LDH编码多核苷酸选自副干酪乳杆菌的ldh(SEQ ID NO:25)和ldh1(SEQ ID NO:26)、干酪乳杆菌的ldh1(SEQ ID NO:27)和ldh2(SEQ ID NO:28)、鼠李糖乳杆菌的ldh(LGG_02523)(SEQ ID NO:29)和ldh(LGG_00606)(SEQ ID NO:30)。
19.根据权利要求14所述的方法，其中通过将D-LDH编码多核苷酸引入所述修饰的乳酸生产菌株的染色体中而使所述D-LDH活性引入或增强。
20.根据权利要求14所述的方法，其中通过将包括D-LDH编码多核苷酸的表达载体引入所述修饰的乳酸生产菌株中而使所述D-LDH活性引入或增强。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述D-LDH编码多核苷酸是编码德氏乳杆菌的LDHA(SEQ ID NO:31)的多核苷酸或编码植物乳杆菌的多肽(SEQ ID NO:32)的多核苷酸。
22.生产D-乳酸的方法，包括：
(a)培养权利要求1至13任一项所述的修饰的D-乳酸生产菌株，以获得培养肉汤；和
(b)从所述培养肉汤中回收D-乳酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述修饰的D-乳酸生产菌株是保藏号为KCCM11273P的副干酪乳杆菌CC02-0095。
24.根据权利要求22所述的方法，其中通过选自以下的方法回收所述D-乳酸：离心、过滤、萃取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解、色谱及其组合。
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