ITMI972080A1 - Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale avente per titolo: "CEPPI DI LIEVITO PER LA PRODUZIONE DI ACIDO LATTICO"
Sfondo dell'invenzione
Le applicazioni dell'acido lattico e dei suoi derivati comprendono molti campi di attività industriali (cioè, chimica, cosmetica, e farmaceutica) così come importanti aspetti di produzione e uso di alimenti. Inoltre, vi è oggi un crescente interesse nella produzione di tale acido organico da impiegarsi direttamente per la sintesi di materiali polimerici biodegradabili.
L'acido lattico può essere prodotto per sintesi chimica o per fermentazione di carboidrati usando microorganismi. Quest'ultimo metodo oggi è commercialmente preferibile poiché sono disponibili microorganismi che producono esclusivamente un isomero, mentre la sintesi chimica conduce alla miscela racemica. I microorganismi industrialmente più importanti, quali le specie del genere Lactobacillus, Bacillus, e Rhizopus, producono acido L(+)-lattico. Tuttavia è nota anche la produzione fermentativa di acido D(-)-lattico o di miscele di acido L(+)- e D(-)- lattico.
Durante una tipica fermentazione di acido lattico, vi è un effetto inibente provocato dall'acido prodotto sulle attività metaboliche dei microorganismi produttori. Oltre alla presenza di acido lattico, l'abbassamento del valore di pH comporta un’ulteriore inibizione della crescita cellulare e dell'attività metabolica. Come conseguenza, la produzione di acido lattico viene notevolmente ridotta.
Pertanto, l'aggiunta di Ca(0H)2, CaC03, NaOH, o NH4OH per neutralizzare l'acido lattico e quindi impedire l'abbassamento del ph è un'operazione convenzionale nei processi industriali per combattere gli effetti negativi dell'accumulo di acido lattico libero.
Questi processi permettono la produzione di lattato, mantenendo il pH ad un valore costante nell'intervallo circa da 5 a 7; questo è molto sopra il pKa dell’acido lattico, che è 3,86.
La neutralizzazione dell'acido lattico durante la fermentazione provoca grossi inconvenienti.
Principalmente, sono necessarie ulteriori operazioni per rigenerare l'acido lattico libero dal suo sale e per eliminare o riciclare il catione neutralizzante; questo è un processo costoso. Tutti gli ulteriori costi ed operazioni potrebbero essere eliminati se si potesse accumulare l'acido lattico libero da microorganismi capaci di crescere e metabolizzare a bassi valori di pH, minimizzando così la produzione di lattato.
Ε' stato pertanto proposto l'uso di lieviti ricombinanti esprimenti il gene della lattato deidrogenasi così da spostare il flusso glicolitico verso la produzione di acido lattico (Schema).
Schema
FR-A-2692 591 (Institut Nationale de la Recherche Agronomique) descrive ceppi di lievito, in particolare ceppi di Saccharomyces. contenenti almeno una copia di un gene codificante per una lattato deidrogenasi di lattobacillo, detto gene essendo sotto il controllo di sequenze regolanti la sua espressione in lievito.
Detti ceppi possono dare sia la fermentazione alcolica sia la fermentazione lattica e questa fermentazione cosiddetta "intermedia" o "bilanciata" può essere sfruttata nella produzione di birra, vino e nella panificazione.
Porro et al., (Biotechnol. Prog. H , 294-298, 1995) hanno anche descritto la trasformazione di S. cerevisiae con un gene che codifica per l'enzima lattico deidrogenasi bovina. Tuttavia, per entrambi i processi, a causa della produzione contemporanea di grosse quantità di etanolo, la resa in acido lattico non era considerata competitiva con quella ottenibile dall'uso di batteri lattici.
Sommario dell' invenzione
Secondo una prima realizzazione, questa invenzione fornisce ceppi di lievito privi di capacità di produzione di etanolo o aventi una capacità di produzione di etanolo sostanzialmente ridotta e trasformati con uno o più geni che codifica/codificano per l'enzima lattico deidrogenasi (LDH) funzionalmente legato a sequenze promotrici che permettono l'espressione di detto gene nei lieviti.
Più particolarmente, l'invenzione fornisce ceppi di lieviti mancanti di attività piruvato decarbossilasica (PDC) o aventi una attività PDC sostanzialmente ridotta e trasformati con almeno una copia di un gene che codifica per lattico deidrogenasi (LDH) funzionalmente legato a sequenze promotrici che permettono l'espressione di detto gene in lievito.
L'invenzione fornisce inoltre vettori di espressione che comprendono una sequenza di DNA codificante per una lattico deidrogenasi funzionalmente legata a una sequenza promotore di lievito.
Secondo un'.ulteriore realizzazione, l'invenzione fornisce anche un processo per la preparazione di acido lattico che comprende la coltivazione di detti ceppi di lievito in un terreno di fermentazione contenente una fonte di carbonio e il recupero di acido lattico dal terreno di fermentazione.
Descrizione dell'invenzione
Si è trovato che si ottengono rese molto elevate nella produzione di acido lattico per mezzo di ceppi di lievito ingegnerizzati così da sostituire la fermentazione etanolica con la fermentazione lattica.
Questi ceppi possono essere ottenuti con metodi diversi, per esempio con tecniche di ingegneria genetica con lo scopo di inattivare o sopprimere attività enzimatiche implicate nella produzione di etanolo, ad esempio attività piruvato decarbossilasica ed alcol deidrogenasica. Dal momento che la piruvato decarbossilasi catalizza il primo passaggio nella via che porta ad etanolo, sono preferiti ceppi di lievito aventi un'attività piruvato decarbossilasica sostanzialmente ridotta ed esprimenti un gene eterologo che codifica per l'enzima lattato deidrogenasi.
L'espressione del gene LDH in ceppi di lievito permette la produzione di acido lattico a valori acidi di pH così da ottenere direttamente l'acido libero e ridurre al minimo la complicata conversione e recupero dei sali di lattato. In questa invenzione il pH del terreno di fermentazione inizialmente può essere superiore a 4,5,ma al termine della fermentazione si abbassa a pH 4,5 o meno, preferibilmente a pH 3 o meno. Secondo l’invenzione si può impiegare un qualunque ceppo di lievito, ma sono preferite le specie Saccharomvc.es e Kluweromvces. poiché questi ceppi possono crescere e/o metabolizzare a pH molto bassi, specialmente nell'intervallo di pH 4,5 o meno; i metodi di ingegneria genetica sono molto sviluppati per questi ceppi, e l'uso di questi ultimi per applicazioni connesse al settore alimentare è diffusamente accettato.
Il termine "attività piruvato decarbossilasica sostanzialmente ridotta" significa o una diminuita concentrazione di enzima nella cellula o un'attività catalitica ridotta o nulla dell’enzima.
Secondo l'invenzione, si preferisce l'uso di ceppi in cui l'attività piruvato decarbossilasica è o si avvicina a zero. E' particolarmente preferita un'attività ridotta di almeno il 601 inferiore, preferibilmente almeno l'80% inferiore e ancor più preferibilmente di almeno il 90% inferiore rispetto al valore di ceppi "wild type".
Esempi di ceppi di Saccharomvces aventi una ridotta attività PDC sono disponibili dall'ATCC ai numeri di accesso 200027 e 200028.
Un esempio di Saccharomvces cerevisiae avente attività PDC nulla è stato descritto in Yeast 12, 247-257, 1996.
Un esempio di K. lactis avente attività PDC nulla è stato descritto in Mol.Microbiol.12 (1),27-36,1996.
L'attività piruvato decarbossilasica può essere misurata con metodi noti, per esempio Ulbrich J., Methods in Enzymology, Voi. 18. pp. 109-115, 1970,Academic Press,New York.
Ceppi adatti possono essere ottenuti per selezione di mutanti e/o ingegnerizzazione di ceppi "wild-type" o di collezione. La modulazione dell'attività piruvato decarbossilasica impiegando terreni di coltura che permettono diverse velocità di flusso glicolitico (Biotechnol.Prog.
1995, 11,294-298)non si è dimostrata soddisfacente.
Un metodo preferito per diminuire o distruggere l'attività piruvato decarbossilasica in un ceppo di lievito secondo l'invenzione consiste nella delezione del gene o dei geni corrispondenti che codificano per questo enzima.
La delezione può essere effettuata con metodi noti, quali quelli descritti in Bianchi et al., (Molecular Microbiol. 12 (1), 27-36, 1996) e Flikweert M.T. et al. (Yeast (1996), 12_: 247-257), per delezione o inserzione per mezzo di marcatori, per esempio il marcatore URA3, preferibilmente il marcatore URA3 da Saccharomvces cerevisiae. Alternativamente, si possono introdurre delezioni, mutazioni puntiformi e mutazioni frame-shift nel gene o geni PDC, allo scopo di ridurre l'attività piruvato decarbossilica. Queste tecniche sono note per esempio da Nature,305, 391-397 (1983).
Un ceppo di Kluweromvces lactis in cui il gene PDC è stato sostituito dal gene URA3 di S. cerevisiae è già stato descritto in Molecular Microbiology 12 (1), 27-36, 1996.
Il gene codificante per la lattico deidrogenasi può essere di una specie qualunque, e può codificare per la L(+)-LDH o la D(-)-LDH. In alternativa, entrambi i tipi di gene per la LDH possono essere espressi contemporaneamente.
La trasformazione dei ceppi di lievito può essere effettuata per mezzo di vettori sia integrativi o replicativi, lineari o plasmidici.
Le cellule ricombinanti dell'invenzione possono essere ottenute con ogni metodo che permetta l'introduzione di DNA estraneo all'interno di una cellula. Tale metodo può essere in particolare una tecnica di trasformazione, elettroporazione, coniugazione, fusione di protoplasti o una qualunque altra tecnica nota alla persona del ramo. Per quanto riguarda la trasformazione, sono stati descritti nella tecnica diversi protocolli: in particolare, essa può essere effettuata trattando le cellule integre in presenza di acetato di litio e di polietilenglicole secondo la tecnica descritta da Ito H et al. {J. Bacteriol. (1983) 153:163),oppure in presenza di etilenglicol e dimetilsolfossido secondo la tecnica di Durrens P. et al. (Curr. Genet. (1990) 18:7). Un protocollo alternativo è già stato descritto in EP 361991. Per quanto riguarda l'elettroporazione, questa può essere effettuata secondo Becker D.M. e Guarente L. (in:Methods in Enzymology (1991) 194:182).
L'uso di vettori non batterici può essere preferito quando si impieghi la biomassa di lievito, alla fine del processo di fermentazione, come mangime animale o per altri scopi agricoli, alimentari o di allevamento.
In una particolare realizzazione dell'invenzione, il DNA ricombinante è parte di un plasmide di espressione che può essere di replicazione autonoma o integrativa.
In particolare, sia per S.cerevisiae che per K. lactis. vettori di replicazione autonoma possono essere ottenuti impiegando sequenze in grado di garantire una replicazione autonoma di molecole di DNA nell'ospite prescelto. In particolare nei lieviti, questi possono contenere origini di replicazione derivate da plasmidi endogeni (2 y, pKDl, ecc.)o persino sequenze cromosomiche (ARS).
I vettori integrativi possono essere ottenuti in particolare impiegando sequenze omologhe in certe regioni del genoma dell'ospite così da permettere l'integrazione del vettore per ricombinazione omologa.
Strumenti genetici per l'espressione genica sono molto ben sviluppati per S. cerevisiae e recentemente descritti nella rassegna di Romanos (Romanos, M.A. et al. Yeast (1992) 8: 423). Sono inoltre stati sviluppati strumenti genetici per permettere l'uso dei lieviti Kluweromvces come cellule ospiti per la produzione di proteine ricombinanti. Sono disponibili alcuni esempi di vettori autonomamente replicanti in K. lactis. sia basati sul plasmide lineare pKGl di IL. lactis (de Lovencourt L. et al. J. Bacteriol. (1982) i54: 737), sia contenenti una sequenza cromosomica di K. lactis stesso (KARS), che conferiscono al vettore l'abilità di autoreplicazione e di corretta segregazione (Das S.Hollenberg C.P.Curr.Genet. (1982)fi: 123).
Inoltre, l'individuazione di un plasmide nativo simile a 2μ di IL drosophilarum (plasmide pKDl - US 5166070; EP 361991)ha permesso lo sviluppo di un sistema ospite/vettore molto efficiente per la produzione di proteine ricombinanti. Vettori ricombinanti basati su pKDl contengono l'intera sequenza originale, fusa ad opportuni marcatori di lievito e batterici. Alternativamente, è possibile combinare parte di pKDl con comuni vettori di espressione di S. cerevisiae (Romanos M.A. et al. Yeast (1992)fi:423) (Chen et al.Curr.Genet. (1989)lfi : 95).
Si può inpiegare secondo 1'invenzione un qualsiasi promotore di lievito, sia inducibile che costitutivo. Ad oggi, promotori impiegati per l'espressione di proteine in S. cerevisiae sono stati descritti da Romanos et al. (suora). Promotori comunemente impiegati nell'espressione di proteine eterologhe in K. lactis sono PGK e PH05 di S. cerevisiae (Romanos et al., suora) o promotori omologhi,come LAC4 (van den Berg J. A. et al., Biotechnology (1990) 8:135) e K1PDC (US 5631143). Il promotore del gene piruvato decarbossilasi di K. lactis (K1PDC) è particolarmente preferito.
Vettori per 1'espressione di geni eterologhi che sono particolarmente efficienti per la trasformazione di ceppi di Kluweromvces lactis sono descritti in US 5 166 070, che è qui incorporato per riferimento.
Secondo l'invenzione si può impiegare un qualunque promotore, sia ìnducihile che costitutivo. Sono particolarmente preferiti promotori di geni codificanti per la piruvato decarbossilasi, preferibilmente da specie di Kluweromvces e ancora più preferibilmente da Kluweromvces lactis.descritto in Molecular Microbiol.12 (1),27-36,1996.
Per la produzione di acido lattico, i ceppi di lievito dell'invenzione sono coltivati in un terreno contenente una fonte di carbonio e altri nutrienti essenziali,e l'acido lattico è recuperato ad un pH di 7 o meno,preferibilmente a un pH di 4,5 o meno,ed ancora più preferibilmente a un pH di 3 o meno. Diminuendo il pH del brodo del prodotto, si ha che: la quantità aggiunta di agente neutralizzante viene ridotta; la frazione di acido lattico in forma di sale diminuisce; proporzionalmente è richiesta una minore rigenerazione di acido libero per recuperare l'acido lattico dal suo sale. Il processo di recupero può sfruttare qualsiasi dei metodi noti. Tipicamente, i microrganismi vengono separati per filtrazione o centrifugazione prima del recupero di acido lattico. I metodi conosciuti per il recupero di acido lattico includono,ma non sono limitati a: l'estrazione di acido lattico in una fase di solvente immiscibile; la distillazione di acido lattico o di un estere di acido lattico.
La presente invenzione offre i seguenti vantaggi nella produzione di acido lattico:
(1) Quando la fermentazione è effettuata a pH 4,5 o meno, si ha minor pericolo di contaminazione da parte di microorganismi estranei, in confronto al processo convenzionale. Inoltre, l'impianto di fermentazione può essere semplificato e il controllo della fermentazione può essere facilitato.
(2) Poiché si aggiunge una minore quantità di agente neutralizzante al terreno di coltura per la neutralizzazione, si ha corrispondentemente minore necessità di usare acidi minerali o altri agenti rigeneranti per la conversione del sale di lattato in acido lattico.Pertanto, si riducono i costi di produzione.
(3) Poiché si aggiunge una minore quantità dell'agente di neutralizzazione al terreno di coltura, si riduce la viscosità del brodo di coltura. Di conseguenza, la lavorazione del brodo di coltura è più semplice.
(4) Le cellule separate secondo la presente invenzione possono essere utilizzate di nuovo come inoculo per un'ulteriore fermentazione di acido lattico.
(5) Le cellule possono essere separate in continuo e recuperate durante la fermentazione di acido lattico, secondo la presente invenzione,e pertanto la fermentazione può essere effettuata continuativamente. (6) Poiché i ceppi di lievito ricombinanti non sono in grado di produrre etanolo o lo producono in maniera ridotta, la produzione di acido lattico può essere effettuata con rese migliori/più alte che nel caso della produzione da ceppi di lievito con capacità naturale di produrre etanolo.
Breve descrizione delle Figure
Fig.1.Diagramma del plasmide pVCl;
Figg. 2a e 2b. Diagramma del plasmide pK5MD8/7 e pKSEXH/16, rispettivamente;
Fig. 3.Diagramma del plasmide pEPL2;
Fig. 4A. Produzione di acido L(+)-lattico da PM6-7A[pEPL2] durante la crescita su terreni a base di Glu-YNB. La concentrazione di glucosio residua a T=49 non era rilevabile. La produzione di acido D(-)-lattico non era rilevabile. L'attività LDH era superiore a 3U/mg di estratto proteico durante tutto l'esperimento.
(A ) cellule/ml; (-») pH; {§) Etanolo prodotto,g/1
acido L(+)-Lattico prodotto g/1
Fig. 4B. Produzione di acido L(+)-lattico in PM6-7A[pEPL2] durante la crescita su terreno a base di YNB e glucosio. Il terreno è stato tamponato al tempo T=0 (pH 5,6) usando 200 mM di tampone fosfato. In questo test il decremento nel tempo del valore di pH è inferiore a quello mostrato in Fig. 4A.La concentrazione residua di glucosio a T=49 non era rilevabile, così come la produzione di acido D-lattico. L'attività LDH era superiore a 3U/mg di estratto proteico durante tutto l'esperimento.
(A) cellule/ml; (—) pH; (·) Etanolo prodotto, g/1
(B) acido L{+)-lattico prodotto g/1
Fig. 5A. Produzione di acido L(+)-lattico in PMl/Cl[pEPL2] durante la crescita su terreno a base di YNB e glucosio. La concentrazione residua di glucosio a T=60 era 12,01 g/1. Anche per tempi di incubazione maggiori non si osservano aumenti nella produzione di biomassa e acido L(+)-lattico.L'attività LDH era superiore a 3U/mg di estratto proteico durante tutto l'esperimento.
(A) cellule/ml; (—) pH; (·) Etanolo prodotto,g/1
(0 acido L(+)-Lattico prodotto g/1
Fig. 5B. Produzione di acido L(+)-lattico in PMl/Cl[pEPL23 durante la crescita su terreno a base di YNB e glucosio. In questo test il decremento nel tempo del valore di pH è inferiore a quello mostrato in Fig. 5A. La concentrazione residua di glucosio a T=87 non era rilevabile. L'attività LDH era superiore a 3U/mg di estratto proteico durante tutto l'esperimento.
(A) cellule/ml; (—J PH; (·) Etanolo prodotto,g/1
(H )acido L(+)-lattico prodotto g/1
Descrizione dettaoliata dell'invenzione
Definizioni
Delezione:le procedure che hanno lo scopo di eliminare un gene o parte di esso da un genoma.La delezione fa parte delle tecniche di mutagenesi (cioè uno strumento per alterare o abolire una funzione enzimatica nella cellula)con mutazioni frame-shift {l'alterazione del codice di un gene) e mutazioni puntiformi (la mutazione in un singolo punto della sequenza di DNA).
Vettore di espressione: una sequenza di DNA che contiene un gene funzionalmente legato (cioè sotto il controllo) a un promotore capace di controllare l'espressione del gene nell'ospite di interesse.
LDH: lattato deidrogenasi:un enzima capace di convertire il piruvato e NADH in acido lattico e NAD+. L(+)-LDH fornisce acido L(+)-lattico. D(-)-LDH fornisce acido D(-)-lattico.
PDC: piruvato decarbossilasi,un enzima capace di convertire piruvato in acetaldeide, il primo stadio per la produzione di etanolo in lievito. Promotore:una sequenza di DNA capace di controllare l'espressione di un gene fuso a valle. L'espressione può essere continua (promotore costitutivo)o controllata da segnali precisi (promotore inducibile). Repair minus: un ceppo particolare di Escherichia coli, incapace di effettuare tutte le normali operazioni di riparazione del suo genoma, adatto per operazioni di DNA ricombinante.
Marker selezionabile: un gene che permette la discriminazione fra cellule con o senza un particolare plasmide che lo trasporta.
Vettore: una sequenza di DNA extra-genomico mantenuto nell'ospite nel corso delle duplicazioni cellulari (segregazione). I vettori sono inseriti nell'ospite (trasformazione) e sono capaci di replicarsi autonomamente (vettore replicativo, plasmide) o sono sottoposti ad integrazione nel genoma dell'ospite (vettore integrativo) che diventa parte del genoma stesso.
Mutagenesi sito-diretta del gene della Lattato deidrogenasi-A bovina (LDH-AL.
Al fine di isolare dalla sequenza del cDNA full-lenght, la sola sequenza nucleotidica codificante per l'enzima bovino LDH-A (EC 1.1.1.27), è stata effettuata una mutagenesi sito-diretta. La mutagenesi sito-diretta guidata da oligonucleotidi consiste nell'ibridare in vitro un DNA a singola elica con un oligonucleotide sintetico che è complementare al DNA a singola elica eccetto per una regione centrale di mismatch corrispondente al nucleotide o ai nucleotidi che si vogliono sostituire. Per introdurre mediante mutagenesi un sito di restrizione Xba I in posizione 67, un cDNA di 1743 coppie di basi, corrispondente alla LDH bovina, è stato exciso dal plasmide pLDH12 (Ishiguro N. et al. Gene (1991), 91 281-285) mediante digestione con gli enzimi di restrizione EcoRI e Hind III (New England Biolabs), ed è stata clonata in un vettore d'espressione denominato pALTER(<R>)-l (Promega, cat. # 96210; lot. # 48645, 1996), plasmide che possiede una origine per la replicazione del DNA di batteriofagi come M13 e R408 (kit Promega) e due geni per l'antibiotico resistenza. Uno di questi geni, quello per la tetraciclina resistenza, è sempre funzionante. L'altro, per l'ampicillina resistenza,è invece inattivo. In seguito ad infezione con R408 di una coltura di E. coli precedentemente trasformata con il costrutto sopra citato, è possibile ottenere particelle fagiche contenenti DNA plasmidico a singola elica (ssDNA). La mutagenesi si basa sull'utilizzo di due oligonucleotidi (Tab.l). Uno in grado di ripristinare la resistenza all'ampicillina (oligoAMP; kit Promega), l'altro appositamente progettato con uno o più mismatches necessari per determinare la sostituzione amminoacidica desiderata nel prodotto genico d'interesse (oligoLDH). Dopo sintesi in vitro della seconda elica di DNA, viene trasformata una coltura di un ceppo di E. coli. selezionando in terreno liquido LB+ampiciliina (Sambrook et al., Molecular cloning a laboratory manual Ed. Cold Spring Harbor Laboratory). Tale ceppo è mutato nel meccanismo di riparazione del DNA (BMH 71-18 mutS; kit Promega)al fine di poter mantenere in vivo i mismatches introdotti con gli oligonucleotidi sintetici. Un secondo ciclo di trasformazione in JM109 (kit Promega) assicura una corretta segregazione di plasmidi mutanti e wild-type determinando un'elevata proporzione di plasmidi con il costrutto mutato. Ulteriori dettagli possono essere trovati nel libretto di istruzioni che accompagna il kit.
Il plasmide così ottenuto contenente il cDNA mutato dell'LDH bovina è stato denominato pVCl (Fig.1).
Sarà chiaro a coloro con esperienza nell'arte che ogni altro metodo scelto per effettuare la mutagenesi può essere utilizzato restando nei limiti della presente invenzione.
Tabella 1: Sequenza nucleotidica degli oligonucleotidi utilizzati durante la mutagenesi sito-diretta. La sequenza sottolineata nell’oligoLDH indica il sito di restrizione Xba I introdotto mediante mutagenesi.
Costruzione del vettore replicativo PEPL2 contenente il promotore di K1PDCA e il cDNA di LDH bovino
Il promotore di K1PDCA e la sequenza codificante furono subclonati come frammento Hind III di 4 Kbp da un clone di libreria genomica di 5L.
lactis che conplementa la mutazione raa6 di K. lactis (Bianchi et al., Mol. Macrobiol. 1996, 19: 27-36). La regione del promotore è stata quindi subclonata nei siti di clonaggio Sai I e Xba I del vettore pBluescript II KS (Stratagene # 212205) utilizzando l'enzima T4 DNA ligasi e seguendo i procedimenti standard di clonaggio molecolare (Sambrook et al., Molecular Cloning, suora). Utilizzando lo stesso procedimento, il cDNA del gene bovino LDH, isolato come frammento Xba I-Hind III di 1675 coppie di basi dal vettore pVCl è stato clonato nei corrispondenti siti di clonaggio del vettore pBluescript II KS.Entrambi i nuovi vettori,chiamati rispettivamente pKSMD8/7 e pKSEXH/16 (Figg.2a e 2b)sono stati trasformati nel ceppo di E. coli GM 82 Mairi- don-).
Il promotore di K1PDCA e il cDNA di LDH bovino sono stati entrambi isolati come frammenti Sai I e Xba I dai vettori pKSMD8/7 e pKSEXH/16 rispettivamente, secondo i procedimenti sopra descritti e sono stati ligati tra loro in vitro con T4 DNA ligasi a temperatura ambiente in presenza dell'endonucleasi Sai I, allo scopo di favorire la ligazione dell'estremità Xba I. Il prodotto di questa ligazione è stato quindi clonato nel sito Sai I del vettore pEl. Questo vettore (Bianchi M.M.et al., Curr. Genet. (1987), 12 : 185-192; Chen X.J. et al., Curr. Genet. (1989), 16: 95-98 e United States Patent # 5166070), è composto a sua volta dal vettore integrativo YIp5, contenente il marcatore genetico URA3 di Saccharomvces cerevisiae. e dal plasmide pKDl (United States Patent # 5166070). Quest'ultimo è stato isolato dal lievito Kluweromvces_ drosophilarum. presenta un'organizzazione funzionale analoga al DNA 2 p di S, cerevisiae ed è in grado di replicare stabilmente in Kluweromvces lactis (Chen X.J. et al., SUBES)· Il marcatore URA3 complementa la mutazione uraAl-1 di K. lactis (de Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1982), 154: 737-742). Il nuovo vettore è stato chiamato pEPL2 (Fig. 3) e trasformato nel ceppo di E. coli DH5_ (Life Technologies Ine.Gaitherburg,Ma.USA).
Isolamento del ceppo di Kluweromvces lactis PMI/C1
Il ceppo PM1 è stato ottenuto per delezione del gene K1PDCA con il marcatore URA3 di S. cerevisiae. nel ceppo PM6-7A (MATa, adeT-600. uraAl-1. Wesolowski et al., Yeast (1992), S : 711). I trasformanti stabili ura<+ >ottenuti non hanno attività PDC e non producono etanolo ma crescono in terreno contenente glucosio (Bianchi M.M.et al., suora).
Da 1x10^ a 3x10^ cellule di una coltura stazionaria del ceppo PM1 sono state piastrate su terreno sintetico solido contenente acido fifluoro orotico (McCuster e Davis, Yeast 2 : 607-608 (1991)). Dopo 5 giorni di incubazione a 28<*>C, sono stati isolati alcuni mutanti ura-(denominati PMI/C1). Questo nuovo ceppo è risultato essere mutato nel gene URA3 precedentemente introdotto per trasformazione integrativa, come è risultato sia da un test di complementazione per trasformazione con un vettore contenente il suddetto marcatore (vettore Kep6; Chen et al., J. Basic Microbiol. (1988) 28: 211-220), sia da formazione di diploidi ura<- >per incrocio con alcuni ceppi MATa, uraAl-Ί (ad esempio MW98-8C: MATa, uraAl-1. arg, lys, rad . raa2). Il genotipo di PM I/Cl è pertanto il seguente:MATa, adeT-600.uraAl-1.pdea::ura3.
Trasformazione dei ceppi PM6-7A e PMI/C1 con il vettore replicativo PEPL2
Colture di PM6-7A e di PMI/C1, cresciute in terreno YPD (estratto di lievito 1% p/v, peptone 2% p/v, glucosio 2% p/v) fino alla concentrazione di 0,5xl0<8 >cellule/ml, sono state raccolte, lavate con acqua, con sorbitolo 1 M e risospese in sorbitolo 1 M ad una concentrazione di 2,5xl0<9 >cellule/ml. Le cellule sono state quindi trasformate per elettroporazione (7,5 kV/cm, 25 yF, 200 Ω; GenePulser, BIORAD) in presenza di 0,5 yg di pEPL2 e i trasformanti ura<+ >sono stati selezionati su terreno solido sintetico in assenza di uracile (0,7% p/v Yeast Nitrogen Base, 2% p/v glucosio, 200 mg/1 adenina, 2% p/v agar).
Coltura batch dei_ trasformanti ΡΜ6-7ΑΓρΕΡί21 e PMI/CirpEPL21 con il plasmide PEPL2
Alcuni dei cloni isolati sono stati testati in condizioni batch in terreno minimo sintetico (1,3% p/v Yeast Nitrogen Base -aa (Difco), 200 mg/1 adenina, 50 g/1 glucosio), tamponato o meno a pH 5,6 con tampone fosfato 200 mM.
Le cellule sono state preinoculate nello stesso terreno.. dell'esperimento e, giunte in fase di attiva crescita, inoculate in beute (voi. 300 mi), contenenti 100 mi di terreno fresco.
Le beute sono state incubate in bagnetti Dubnoff a 30<e>C, 150 rpm, e la fermentazione è stata monitorata a intervalli regolari.
La crescita cellulare è stata determinata con un contatore elettronico di particelle (Coulter Counter ZBI, Porro et al., Res. Microbiol. (1991), 142, 535-539), previa eliminazione di eventuali aggregati cellulari ottenuta sonicando la sospensione per 10 secondi (Sonicatore Fisher 300,puntale medio,Potenza 35%).
Dosaggio dell'attività LDH
Circa 1x10® cellule sono raccolte, lavate con tampone fosfato 50 mM, pH 7,5, e risospese nel medesimo tampone. Le cellule vengono Usate con 5 cicli di violenta agitazione su vortex in presenza di microsfere di vetro con diametro 400 pm (SIGMA, G-8772) a 4". I debris cellulari sono allontanati mediante centrifugazione in microcentrifuga Eppendorf 5415 C (13600 RCF, 10 min), e la concentrazione degli estratti proteici è valutata con il metodo Micro Assay,BIORAD (cat. 500-0006).
Circa 0,2 microgrammi di estratto vengono testati per attività LDH e con il kit SIGMA (DG1340-UV) seguendo le procedure raccomandate dalla casa.
Dosaggio dei metaboliti presenti nel medium di crescita
Campioni del medium di crescita, ottenuti allontanando le cellule per centrifugazione, sono stati analizzati per la presenza di glucosio, etanolo, acido L e D lattico con i kit Boehringer n. 716251, 176290, 1112821 rispettivamente, seguendo le procedure raccomandate dalla casa.
I dati sperimentali sono illustrati nelle Figure 4A, 4B, 5A e 5B. I risultati sono riassunti in Tabella 2.La resa è uguale alla quantità di acido lattico prodotto diviso per la quantità di glucosio consumato.
La percentuale di acido lattico libero è ottenuta dalla equazione di Renderson-Hasselbach:
pH= pKa log[(% lattato)/(% acido lattico libero)],
dove il pKa dell'acido lattico è 3,86.
La produzione di acido lattico da parte di PMI/Cl[pEPL2] è stata ulteriormente testata attraverso la coltura in un fermentatore da 14 litri dotato di agitatore. Gli inoculi per le fermentazioni sono stati preparati crescendo pre-colture di PMI/Cl[pEPL2] in 50 mi di terreno minimo sintetico (1,3% w/v "Yeast Nitrogen Base"-aa (Difco, Detroit,MI), adenina 200 mg/1, ammonio solfato 5 g/1, glucosio 50 g/1) in beute di Erlenmeyer con deflettore per 30 h a 30°C e a 300 rpm in un incubatore agitato (modello G-24, New Brunswick Scientific Co., Ine., Edison, NJ, USA). 80 mi di inoculo totale sono stati trasferiti in un fermentatore da 14 litri dotato di agitatore (BioFlo 3000 System, New Brunswick Scientific Co., Ine., Edison, NJ) contenente 8 litri di terreno nutritivo (30 g di solidi secchi / litro di acqua di macerazione di cereali leggeri ("light com steep water"), A.E. Staley Manufacturing Co., Decatur, IL,USA; 10 g/1 di estratto di lievito Difco, Detroit,MI; 200 mg/1 di adenina, 50 g/1 di glucosio). Il fermentatore è stato mantenuto a 30’C, agitato a 400 rpm,e estesamente areato a 2 litri/min. E' stata aggiunta antischiuma (Antifoam 1520, Dow Corning Corp., Midland, MI, USA) necessaria per controllare la formazione di schiuma. E' stato aggiunto il glucosio necessario per mantenere una concentrazione residua nel terreno di fermentazione di circa 25-50 g/1. Quando controllato, il pH è stato stabilizzato per aggiunta automatica di idrossido d'ammonio 14,8 M.La produzione di acido lattico a diversi valori di pH è stata testata come segue: (caso 1) Il pH di fermentazione è stato regolato a 4,5 durante tutta la fermentazione, (caso 2) Il pH di fermentazione iniziale è stato mantenuto a 4,0 fino a che sono stati aggiunti 80 mi di idrossido d'ammonio 14,8 M. Quindi la regolazione del pH è stata sospesa, (caso 3) Il pH iniziale della fermentazione era 5,0 e durante la fermentazione non è stato aggiunto alcun agente neutralizzante. I risultati sono mostrati in Tabella 3. Il tempo trascorso è stato misurato dal momento dell'inoculo. Dei campioni presi dalla fermentazione, dopo rimozione delle cellule per filtrazione, sono stati analizzati per la presenza di glucosio e acido L(+)-lattico usando un "Select Biochemistry Analizer" modello YSI 2700 (Yellow Springs Instrument Co., Ine., Yellow Springs, OH). La presenza di etanolo, misurata per gas cromatografia, non è stata rilevata in nessuna fermentazione. La resa e la percentuale di acido lattico libero sono stati calcolati come descritto in precedenza.
Claims (21)
- RIVENDICAZIONI 1. Un ceppo di lievito privo di capacità di produzione di etanolo o avente una capacità di produzione di etanolo sostanzialmente ridotta, trasformato con almeno una copia di un gene che codifica per l'enzima lattico deidrogenasi funzionalmente legato a sequenze promotrici che permettono l'espressione di detto gene nel lievito.
- 2. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 1 privo di piruvato decarbossilasi o avente sostanzialmente ridotta attività piruvato decarbossilica.
- 3. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 1 o 2 scelto fra le speci Saccharomvces o Kluweromvces.
- 4. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 3 appartenente alla specie Kluyveromyces·
- 5. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 4, che è un ceppo di Kluweromvces lactis.
- 6. Un ceppo di lievito secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 5, trasformato con uno o più geni che codifica/codificano per l'enzima lattato deidrogenasi.
- 7. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 6,trasformato con un gene che codifica per la lattato deidrogenasi bovina.
- 8. Un ceppo di lievito secondo una o più delle rivendicazioni 1-7 in cui il gene che codifica per la lattato deidrogenasi è integrato nel genoma di lievito.
- 9. Un ceppo di lievito secondo una o più delle rivendicazioni 1-8 che è stato trasformato da un vettore di espressione che conprende una sequenza promotore e una sequenza di DNA che codifica per la lattato deidrogenasi sotto regolazione di detta sequenza promotore.
- 10. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 9, in cui la sequenza promotore è un promotore del gene della piruvato decarbossilasi.
- 11. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 10, in cui la sequenza promotore è un promotore di piruvato decarbossilasi di Kluweromvces.
- 12. Un ceppo di lievito secondo una o più delle rivendicazioni 1-11 in cui il gene o i geni codificati per piruvato decarbossilasi è o sono stati distrutti per delezione o inserzione di un marcatore selezionabile.
- 13. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 12, in cui il marcatore selezionabile è un marcatore URA3.
- 14. Un ceppo di lievito secondo la rivendicazione 13, in cui il marcatore selezionabile è il marcatore URA3 di Saccharomvces cerevisiae.
- 15. Un vettore di espressione che comprende una sequenza di DNA codificante per una lattico deidrogenasi funzionalmente legata ad una sequenza di promotore di lievito.
- 16. Un vettore secondo la rivendicazione 15, in cui la sequenza promotore è un promotore del gene piruvato decarbossilasi di K1uweromvces.
- 17. Un vettore secondo la rivendicazione 16, in cui la sequenza promotore è un promotore del gene della piruvato decarbossilasi di Kluweromyces lactis.
- 18. Un processo per la preparazione di acido lattico che conprende la fermentazione di un ceppo delle rivendicazioni 1-14 in un terreno di fermentazione contenente una fonte di carbonio e il recupero di acido lattico dal terreno di fermentazione.
- 19. Un processo secondo la rivendicazione 18, in cui il terreno di fermentazione contenente acido lattico ha un pH di 7 o meno.
- 20. Un processo secondo la rivendicazione 19, in cui il pH è 4,5 o meno.
- 21.Un processo secondo la rivendicazione 20 in cui il pH è 3 o meno.
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