JPH0740945B2 - 発酵法によるピルビン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるピルビン酸の製造法Info
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- JPH0740945B2 JPH0740945B2 JP9093987A JP9093987A JPH0740945B2 JP H0740945 B2 JPH0740945 B2 JP H0740945B2 JP 9093987 A JP9093987 A JP 9093987A JP 9093987 A JP9093987 A JP 9093987A JP H0740945 B2 JPH0740945 B2 JP H0740945B2
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は発酵法によるピルビン酸の製造法に関するもの
である。
である。
ピルビン酸は生体代謝の重要な中間体であり、各種医・
農薬などの有効な合成原料であるのみならず酵素法によ
るＬ−トリプトファン、Ｌ−システィン、Ｌ−チロシン
などのアミノ酸合成の主要原料である。よって安価に製
造し得れば、種々の合成原料として有用である。
農薬などの有効な合成原料であるのみならず酵素法によ
るＬ−トリプトファン、Ｌ−システィン、Ｌ−チロシン
などのアミノ酸合成の主要原料である。よって安価に製
造し得れば、種々の合成原料として有用である。
＜従来の技術＞ トルロプシス属微生物を用いて、発酵法によりピルビン
酸が製造できることは、既に知られている（日本農芸化
学会誌第32巻第573ページ，特開昭62−14789号公報）。
酸が製造できることは、既に知られている（日本農芸化
学会誌第32巻第573ページ，特開昭62−14789号公報）。
＜発明が解決しようとする問題点＞ しかしながら、かかる従来法においてはピルビン酸の蓄
積量、収率が低く、工業的に実用化することはできな
い。すなわち、日本農芸化学会誌第32巻第573ページに
よると、トルロプシス・キヤンデイダを用いたピルビン
酸の蓄積量は高々0.5g/と低い。また、特開昭62−147
89号公報によると、トルロプシス・エツチエルシーを用
いたピルビン酸の蓄積量は高々5.1g/と低い。＜＜問
題点を解決するための手段＞ したがって本発明者らは、上記問題点を解決することが
でき、さらに生産性の高いピルビン酸の製造方法につい
て鋭意研究した結果、トルロプシス属に属し、ピルビン
酸生産能を有する微生物のピルベードデカルボキシラー
ゼ活性（以下、PDC活性と略す）を低下させることによ
り、ピルビン酸の蓄積濃度、生成収率が著しく向上する
ことを見出し、本発明に到達した。
積量、収率が低く、工業的に実用化することはできな
い。すなわち、日本農芸化学会誌第32巻第573ページに
よると、トルロプシス・キヤンデイダを用いたピルビン
酸の蓄積量は高々0.5g/と低い。また、特開昭62−147
89号公報によると、トルロプシス・エツチエルシーを用
いたピルビン酸の蓄積量は高々5.1g/と低い。＜＜問
題点を解決するための手段＞ したがって本発明者らは、上記問題点を解決することが
でき、さらに生産性の高いピルビン酸の製造方法につい
て鋭意研究した結果、トルロプシス属に属し、ピルビン
酸生産能を有する微生物のピルベードデカルボキシラー
ゼ活性（以下、PDC活性と略す）を低下させることによ
り、ピルビン酸の蓄積濃度、生成収率が著しく向上する
ことを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明の上記目的は、トルロプシス属に属
し、ピルビン酸生産能を有する微生物のうち、PDC活性
低下株を培養することにより培地中にピルビン酸を生成
蓄積させ、これを採取することにより達成されるのであ
る。
し、ピルビン酸生産能を有する微生物のうち、PDC活性
低下株を培養することにより培地中にピルビン酸を生成
蓄積させ、これを採取することにより達成されるのであ
る。
すなわち、本発明はトルロプシス（Torulopsis）属に属
し、ピルビン酸生産能を有し、かつピルベートデカルボ
キシラーゼ活性がその親株よりも低い変異株を培養し
て、培養液中にピルビン酸を生成蓄積せしめ、培養液中
よりピルビン酸を採取することを特徴とする発酵法によ
るピルビン酸の製造法である。
し、ピルビン酸生産能を有し、かつピルベートデカルボ
キシラーゼ活性がその親株よりも低い変異株を培養し
て、培養液中にピルビン酸を生成蓄積せしめ、培養液中
よりピルビン酸を採取することを特徴とする発酵法によ
るピルビン酸の製造法である。
次に、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる変異株はトルロプシス属に属し、PD
C活性の低下した変異株であり、かつピルビン酸生産能
を有する変異株であればいかなるものであってもよい。
C活性の低下した変異株であり、かつピルビン酸生産能
を有する変異株であればいかなるものであってもよい。
本発明に用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えばトルロプシス・グラブラータAC II33（FERM BP−1
424）（ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、ビオチ
ン要求、PDC活性低下）が挙げられる。
えばトルロプシス・グラブラータAC II33（FERM BP−1
424）（ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、ビオチ
ン要求、PDC活性低下）が挙げられる。
この変異株は、トルロプシス・グラブラータIFO 0005
（ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、ビオチン要
求）より誘導されたものである。
（ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、ビオチン要
求）より誘導されたものである。
このような変異株は、野生株または親株にUV照射、ある
いはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン処理、あるいはエチルメタンスルホネート（以下、EM
Sと略す）処理などの常法により変異処理された菌体か
ら、酢酸を含む培地で、親株に比べ有意に生育の良好な
菌株を選定することによって得ることができる。
いはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン処理、あるいはエチルメタンスルホネート（以下、EM
Sと略す）処理などの常法により変異処理された菌体か
ら、酢酸を含む培地で、親株に比べ有意に生育の良好な
菌株を選定することによって得ることができる。
本発明におけるPDC活性は、超音波処理、フレンチプレ
スを用いる高圧法、その他の方法により、細胞を破壊
し、遠心分離した上澄粗酵素液を用い、ピルビン酸を基
質に、チアミンピロリン酸を補酵素として反応し、生成
したアセトアルデヒドを2,4−ジニトロフェニルヒドラ
ジンと反応させ、高速液体クロマトグラフィーにより反
応したアセトアルデヒドの2,4−ジニトロフェニルヒド
ラゾンを定量分析する方法により測定される。
スを用いる高圧法、その他の方法により、細胞を破壊
し、遠心分離した上澄粗酵素液を用い、ピルビン酸を基
質に、チアミンピロリン酸を補酵素として反応し、生成
したアセトアルデヒドを2,4−ジニトロフェニルヒドラ
ジンと反応させ、高速液体クロマトグラフィーにより反
応したアセトアルデヒドの2,4−ジニトロフェニルヒド
ラゾンを定量分析する方法により測定される。
ここで、本発明で用いられる微生物のPDC活性は親株のP
DC活性を100％として表わした場合の相対活性で示すも
のとする。
DC活性を100％として表わした場合の相対活性で示すも
のとする。
本発明において使用するPDCの活性が親株よりも低い菌
株としては、親株を基準としてその70％以下、好ましく
は50％以下にPDC活性が低下したものが望ましく用いら
れる。
株としては、親株を基準としてその70％以下、好ましく
は50％以下にPDC活性が低下したものが望ましく用いら
れる。
たとえ、親株を基準としてその70％以下にPDCの活性が
低下していなくとも、その菌株の誘導されたもととなる
野生株を基準としてその70％以下にPDC活性が低下して
いれば、本発明と同様な効果が達成されるものであるの
で、そのような菌株を用いることは本発明の範囲内に包
含される。
低下していなくとも、その菌株の誘導されたもととなる
野生株を基準としてその70％以下にPDC活性が低下して
いれば、本発明と同様な効果が達成されるものであるの
で、そのような菌株を用いることは本発明の範囲内に包
含される。
本発明で用いられる培地は発酵に通常使用される炭素
源、窒素源、無機塩類、ビタミン類などをほどよく含有
するものであればよいが、炭素源としては、グルコース
などの糖質、有機酸、エタノール、メタノールなどの使
用酵母菌が利用し得るものが使用される。窒素源として
は硫安、硝安、塩安、尿素、ペプトン、肉エキス、味
液、その他の有機および無機窒素化合物が使用される
が、望ましくはアミノ酸をバランスよく含む有機窒素化
合物がよい。無機塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、鉄、マンガン、その他の無機塩類が用いら
れ、さらに必要に応じてチアミン、ナイアシン、ピリド
キシン、ビオチンなどの要求ビタミン、またはこれらを
含有する酵母エキス、コーンスチーブリカー、その他の
天然物の添加した培地を使用すればよい。
源、窒素源、無機塩類、ビタミン類などをほどよく含有
するものであればよいが、炭素源としては、グルコース
などの糖質、有機酸、エタノール、メタノールなどの使
用酵母菌が利用し得るものが使用される。窒素源として
は硫安、硝安、塩安、尿素、ペプトン、肉エキス、味
液、その他の有機および無機窒素化合物が使用される
が、望ましくはアミノ酸をバランスよく含む有機窒素化
合物がよい。無機塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、鉄、マンガン、その他の無機塩類が用いら
れ、さらに必要に応じてチアミン、ナイアシン、ピリド
キシン、ビオチンなどの要求ビタミン、またはこれらを
含有する酵母エキス、コーンスチーブリカー、その他の
天然物の添加した培地を使用すればよい。
培養中はピルビン酸の生成蓄積にともない、pHの低下が
起こるので炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性カリ、ア
ンモニアなどのアルカリでpH3〜７に調節することがピ
ルビン酸生産には有効である。培養中の温度は22℃〜32
℃が適当である。培養終了後、系内に蓄積したピルビン
酸は常法により、単離採取することができる。
起こるので炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性カリ、ア
ンモニアなどのアルカリでpH3〜７に調節することがピ
ルビン酸生産には有効である。培養中の温度は22℃〜32
℃が適当である。培養終了後、系内に蓄積したピルビン
酸は常法により、単離採取することができる。
例えば、酸性エーテル抽出、フェニルヒドラゾン化して
沈澱単離する方法なども採用することができる。
沈澱単離する方法なども採用することができる。
＜作 用＞ 本発明においてPDC活性レベルを低下させることは、ピ
ルビン酸がアセトアルデヒドへと代謝されるのを少なく
し、グルコースからピルビン酸への変換率を高めるの
に、役立ち、そのためピルビン酸の蓄積量が増加すると
推定される。
ルビン酸がアセトアルデヒドへと代謝されるのを少なく
し、グルコースからピルビン酸への変換率を高めるの
に、役立ち、そのためピルビン酸の蓄積量が増加すると
推定される。
＜実施例＞ 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
実施例１ A.（PDC活性低下株の取得） トルロプシス・グラブラータIFO 0005（ニコチン酸、
チアミン、ピリドキシン、ビオチン要求）の菌体を常法
によりEMS処理（1W/V％、30℃で３時間）したのち、栄
養寒天培地（GP寒天培地、大五栄養化学株式会社製）に
接種し、30℃で２日間培養し、第１表に示す成分からな
る基本寒天培地（Ａ）と、酢酸ナトリウム３水和物を5g
/を含む基本寒天培地（Ｂ）に各々レプリカした。次
に30℃で３日間培養した本寒天培地（Ｂ）での生育が基
本寒天培地（Ａ）での生育より有意によいコロニーを釣
菌し、第１表に示す成分からなる発酵培地でピルビン酸
発酵を行いピルビン酸の蓄積量、対糖収率を調べ収率の
向上した株AC II33（FERM BP−1424）を得た。次にそ
の株AC II33とその親株について、以下のようにして、P
DC活性を測定した。
チアミン、ピリドキシン、ビオチン要求）の菌体を常法
によりEMS処理（1W/V％、30℃で３時間）したのち、栄
養寒天培地（GP寒天培地、大五栄養化学株式会社製）に
接種し、30℃で２日間培養し、第１表に示す成分からな
る基本寒天培地（Ａ）と、酢酸ナトリウム３水和物を5g
/を含む基本寒天培地（Ｂ）に各々レプリカした。次
に30℃で３日間培養した本寒天培地（Ｂ）での生育が基
本寒天培地（Ａ）での生育より有意によいコロニーを釣
菌し、第１表に示す成分からなる発酵培地でピルビン酸
発酵を行いピルビン酸の蓄積量、対糖収率を調べ収率の
向上した株AC II33（FERM BP−1424）を得た。次にそ
の株AC II33とその親株について、以下のようにして、P
DC活性を測定した。
B.（PDC活性の測定） 第１表に示す基本培地を500mlの坂口フラスコに100mlづ
つ分注し、115℃15分間滅菌し、培地に試験菌株IFO 00
05およびAC II33を各々接種し、30℃で30時間振とう培
養した。培養液から菌体を分離し、pH7.2の0.2Mカリウ
ム−リン酸緩衝液で２回洗浄し、上記緩衝液10mlに懸濁
し、超音波処理（20分間）し、遠心分離して不溶分を除
き、得られた上清を酵素液とした。
つ分注し、115℃15分間滅菌し、培地に試験菌株IFO 00
05およびAC II33を各々接種し、30℃で30時間振とう培
養した。培養液から菌体を分離し、pH7.2の0.2Mカリウ
ム−リン酸緩衝液で２回洗浄し、上記緩衝液10mlに懸濁
し、超音波処理（20分間）し、遠心分離して不溶分を除
き、得られた上清を酵素液とした。
次に、第２表に示す酵素反応液を調整し、30℃で20分間
酵素反応を行い、2N塩酸に溶かした0.5mMの2,4−ジニト
ロフェニルヒドラジンを1ml加え、反応を停止し、生成
アルデヒドをヒドラゾン化するため15分間静置し、メタ
ノールを2ml加えヒドラゾン化合物を溶解し、高速液体
クロマトグラフィーにてアセトアルデヒドの2,4−ジニ
トロフェニルヒドラゾンを定量分析した。
酵素反応を行い、2N塩酸に溶かした0.5mMの2,4−ジニト
ロフェニルヒドラジンを1ml加え、反応を停止し、生成
アルデヒドをヒドラゾン化するため15分間静置し、メタ
ノールを2ml加えヒドラゾン化合物を溶解し、高速液体
クロマトグラフィーにてアセトアルデヒドの2,4−ジニ
トロフェニルヒドラゾンを定量分析した。
なお、対照液としてはピルビン酸を除いた反応液を用い
た。
た。
結果は第３表に示すごとく、AC II33株のPDC活性は親株
の約1/2に低下している。
の約1/2に低下している。
実施例２ （ピルビン酸の生産） 第１表に示す成分からなる発酵培地に酢酸ナトリウム・
３水和物5g/添加した培地を１のマイヤーフラスコ
に40mlづつ分注し、115℃で15分間滅菌した。次に、菌
株IFO 0005およびAC II33を各々一白金耳づつ接種し、
30℃で60時間回転振とう培養した。培養液中に、生成し
たピルビン酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量し
た。結果を第４票に示す。
３水和物5g/添加した培地を１のマイヤーフラスコ
に40mlづつ分注し、115℃で15分間滅菌した。次に、菌
株IFO 0005およびAC II33を各々一白金耳づつ接種し、
30℃で60時間回転振とう培養した。培養液中に、生成し
たピルビン酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量し
た。結果を第４票に示す。
なお、対糖収率は消費グルコースに対するピルビン酸の
重量で表わした。
重量で表わした。
第３表の結果より明らかなように、本発明例のトルロプ
シス・グラブラータAC II33を用いた方法は、ピルビン
酸の蓄積濃度、生成収率ともに親株より顕著に向上して
いる。向上の原因はPDC活性の低下により生成ピルビン
酸のアセトアルデヒドへの代謝が抑制され、グルコース
からピルビン酸への変換率が高まったものと推定され
る。
シス・グラブラータAC II33を用いた方法は、ピルビン
酸の蓄積濃度、生成収率ともに親株より顕著に向上して
いる。向上の原因はPDC活性の低下により生成ピルビン
酸のアセトアルデヒドへの代謝が抑制され、グルコース
からピルビン酸への変換率が高まったものと推定され
る。
次に、AC II33の培養液200mlを除菌後、上澄液に塩酸を
加え、pH2.0とし、エチルエーテル抽出し、次いで苛性
ソーダでpHを5.5に中和した後40℃で減圧濃縮し5ml程度
とした。この濃縮液にエタノールを滴下させピルビン酸
ソーダ6.62g（純度98％）を得た。
加え、pH2.0とし、エチルエーテル抽出し、次いで苛性
ソーダでpHを5.5に中和した後40℃で減圧濃縮し5ml程度
とした。この濃縮液にエタノールを滴下させピルビン酸
ソーダ6.62g（純度98％）を得た。
＜発明の効果＞ 本発明方法によればピルビン酸の蓄積量、収率が向上
し、より安価なピルビン酸の生産が可能になった。
し、より安価なピルビン酸の生産が可能になった。
Claims (1)
- 【請求項１】トルロプシス（Torulopsis）属に属し、ピ
ルビン酸生産能を有し、かつピルベートデカルボキシラ
ーゼ活性がその親株よりも低い変異株を培養して、培養
液中にピルビン酸を生成蓄積せしめ、培養液中よりピル
ビン酸を採取することを特徴とする発酵法によるピルビ
ン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093987A JPH0740945B2 (ja) | 1987-04-15 | 1987-04-15 | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093987A JPH0740945B2 (ja) | 1987-04-15 | 1987-04-15 | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63258586A JPS63258586A (ja) | 1988-10-26 |
| JPH0740945B2 true JPH0740945B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=14012421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9093987A Expired - Fee Related JPH0740945B2 (ja) | 1987-04-15 | 1987-04-15 | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0740945B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0389620B1 (en) * | 1987-08-21 | 1992-12-16 | Toray Industries, Inc. | Process for preparing pyruvic acid by fermentation |
| IT1294728B1 (it) * | 1997-09-12 | 1999-04-12 | Biopolo S C A R L | Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico |
| DE10129711B4 (de) * | 2001-06-22 | 2007-08-23 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat |
| JP2017007965A (ja) * | 2015-06-18 | 2017-01-12 | ノーベルファーマ株式会社 | ピルビン酸ナトリウムの製造方法 |
-
1987
- 1987-04-15 JP JP9093987A patent/JPH0740945B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63258586A (ja) | 1988-10-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |