DE3247703C2

DE3247703C2 - Verfahren zur Gewinnung von L-Threonin

Info

Publication number: DE3247703C2
Application number: DE3247703A
Authority: DE
Inventors: Haruo Machida Tokio / Tokyo Gomi; Masahisa Tokio / Tokyo Ikemi; Yoshiaki Zama Kanagawa Ishimatsu; Masaaki Kato; Iwao Machida Tokio / Tokyo Kibayashi; Noriaki Ibaraki Koizumi; Teruzo Miyoshi; Hideaki Kyoto Yamada
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1981-12-28
Filing date: 1982-12-23
Publication date: 1984-11-22
Also published as: FR2518988A1; FR2518988B1; GB2113691A; DE3247703A1; US4492757A; GB2113691B

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von L-Threonin durch Einwirkung von D-Threonin-Aldolase oder von D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase auf eine DL-Threonin und gegebenenfalls DL-Allothreonin enthaltende Lösung.

Description

Alcaligenes faecalis IFO 12669.
Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) oder
Arthrobacter DK-19 (FERM-P 6201)

_|5 gebildete

A) D-Threonin-Aldolase als solche oder B) D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase, letztere durch Kultivieren von

Bacillus DK-315(FERM-P 6202),
Arthrobacter DK-19 (FERM-P 6201),
Pseudomonas DK-2(FERM-P 6200)oder

Alcaligenes faecalis IFO 12669 gebildet.

einwirken läßt

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von L-Thrconin, das dadurch gekennzeichnet ist daß man auf eine wäßrige,

A) DL-Threonin oder B) DL-Threonin und DL-Allothreonin

enthaltende Lösung bei einem pH-Wert um 7 bis 10 und einer Temperatur von 30 bis 45°C eine durch jeweils in üblicher Weise vorgenommenes Kultivieren von

Alcaligenes faecalis IFO 12669,
Pseudomonas DK-2(FERM-P 6200)oder
_n Arthrobacter DK-19(FERM-P 6201)

gebildete

A) D-Threonin-Aldolasc als solche oder B) D-Threonin-Aldolase und L- Allolhrconin-Aldolasc, letztere durch Kultivieren von Bacillus DK-315(FERM-P 6202),

Arthrobacter DK-19(FERM-P 6201),
Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) oder
Alcaligenes faecalis IFO 12669 gebildet,

so einwirken läßt.

L-Threonin ist eine der für Mensch und Tier essentiellen Aminosäuren. Wegen ihres verhältnismäßig geringen Gehaltes in verschiedenen tierischen und pflanzlichen Proteinen besteht ein potentieller Bedarf an L-Threonin als Zusatz für Futter- und Nahrungsmittel. Bisher hat man L-Thrconin durch Extraktion aus natürlichen Materialien gewonnen oder durch Fermentation natürlicher Materialien hergestellt. Wegen der verhältnismäßig hohen Kosten des auf diese Weise hergestellten L-Threonins hat man jedoch nach einem preisgünstigeren Verfahren zu seiner Herstellung gesucht.

Obgleich sich L-Threonin leicht unter Verwendung von Glycin, etc. synthetisieren läßt, entsteht D-Threonin in der gleichen Menge als Nebenprodukt ferner werden gleichzeitig D-Allothreonin und L-Allothreonin als DL-Isomeres gebildet Dementsprechend sind die Stufen der Isolierung und Reinigung von L-Threonin aus den Reaktionsprodukten außerordentlich kompliziert. Die Ausbeute an L-Threonin ist gering und der Preis des synthetisch hergestellten L-Threonins sehr hoch. In BulLSocChim., Band 20, Seite 903 (1953) und ebenda, Band 23, Seite 447 (1956) sind Verfahren zur optischen Auftrennung von DL-Threonin beschrieben. Diese Verfahren sind jedoch außerordentlich mühsam und führen nur zu einer geringen Ausbeute an L-Thrconin. Hinzu kommt, daß für die Entfernung der Allothreonine eine sehr komplizierte und unwirksame Methode unumgänglich ist, z.B. die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 36-19562(1961) beschriebene, bei der Bis-(acetaldehyd)-threoninkupfer verwendet wird, oder das in der US-Patentschrift 24 61 847 angegebene Verfahren, nach dem Allothreonin und Threonin unter Verwendung von Natriumethylat in Ethanol in ihre Natriumsalze umgewandelt und dann aufgrund ihrer verschiedenen Löslichkeit voneinander getrennt werden.

Weitere Nachteile des synthetischen Verfahrens liegen darin, daS auf dem Markt kaum Bedarf für D-Threonin und Allothreonin besteht, und daß sich die Racemisierung von D-Threonin zu L-Threonin nicht so leicht bewerkstelligen läßt

Es wurde nun ein neues Enzym gefunden, das die Umwandlung von D-Threonin und auch von D-Allothreonin in Glycin und Acetaldehyd katalysiert Es wurde als D-Threonin-Aldolase bezeichnet Ferner wurde gefunden, daß bei Einwirkung von D-Threonin-Aldolase auf das Syntheseprpdukt d. h. DL-Threonin oder bei kombinierter Einwirkung von D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase auf die komplexeren Syntheseprodukte, d. h. Gemische aus DL-Threonin und DL-AIIothreonin, L-Threonin zusammen mit brauchbaren Abbauprodukten, d. h. Glycin und Acetaldehyd erhalten wird. Es läßt sich somit L-Threonin bei gleichzeitiger Verwertung der Nebenprodukte leicht herstellen, so daß alle vorstehend erläuterten Probleme gelöst werden. ,

Erfindungsgemäß läßt man zur Gewinnung von L-Threonin D-Threonin-Aldolase oder D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase auf eine Lösung einwirken, die mindestens DL-Threonin enthält insbesondere läßt man D-Threonin-Aldolase auf eine wäßrige Lösung von DL-Threonin oder D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase auf eine wäßrige Lösung eines Gemisches von DL-Threonin und DL-Allothreonin einwirken, worauf man aus DL-Threonin bzw. einem Gemisch aus DL-Threonin und DL-Allothreonin das L-Threonin erhält

D-Threonin-Aldolase ist ein neues Enzym, das D-Threonin zu Glycin und Acetaldehyd abbaut und auch den Abbau von D-Aliothreonin zu Glycin und Acetaldehyd katalysiert Diese Wirksamkeit zum Abbau von D-Threonin und D-Allothreonin hat ein Enzym, das von einem Alcaligenes faecalis Stamm IFO 12669 erzeugt wird, der beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan hinterlegt ist ferner ein Enzym, das von einem Pseudomonas Stamm DK-2 gebildet wird, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 6200 hinterlegt ist außerdem ein Enzym, das von einem Arthrobacter Stamm DK.-19 erzeugt wird, der ebenfalls bei dem zuletzt genannten Institut unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 6201 hinterlegt ist

Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nr. 6200) und des Stammes Arthrobacter DK-19(FERM-P Nr. 6201) sind nachfolgend aufgeführt.

(a) Morphologische Eigenschaften

	Pseudomonas DK-2	Pseudomonas DK-2	Arthrobacter DK-19	30
Zellform	stabförmig	kreisförmige Kolonien	stabförmig
Zellgröße, μ,	1,5 χ 0,8	mit konvexkreisförmigen	2.5 χ 0,8
Auftreten	nein	Protuberanzen, glänzend	Mischung aus normalen gebogenen
verschiedener Formen			linienförmigen	35
		mäßiges Wachstum	Stäbchen, V-förmigen und
		halbtransparent	Zwei-ähnlichen
Beweglichkeit	positiv	und glänzend	positiv
	eine Geißel		sehr aktiv
		mäßiges Wachstum	Flimmerhärchen	40
Sporen	keine		keine
Gram-Färbung	negativ	mäßig vorteilhaftes	Gram-positive
		Wachstum auf der	Körnchen innerhalb
		Oberfläche des	Gram-negativer
		Kulturmediums	Zellen	45
Säurefestigkeit	keine	Veränderung zu alkalischer	keine
(b) Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien	Farbe
	ArlhrobacierDK-19	50
Plattenkultur:	halbtransparent
Agar mit Bouillon	cremefarbene kreisförmige
	Kolonien mit konvex-kreisförmigen
	Protuberanzen, glänzend	55
Schrägkultur:	mäßiges Wachstum,
Ahar mit Bouillon	halbtransparent,
	fadenförmige Kolonien
	von cremeartiger Farbe, glänzend
flüssiges Kulturmedium	vorteilhaftes Wachstum	60
mit Bouillon	flockig
Stabkultur aus Gelatine	mäßig vorteilhaftes Wachstum
und Bouillon	auf der Oberfläche des
	Kulturmediums in Fadenform
		65
Lackmusmilch	Verfärbung ohne Verflüssigung

(c) Physiologische Eigenschaften

Pseudomonas DK-2 ArlhrobacterDK-19

5 Nitratreduktion + —

Freisetzung von Stickstoff + +

MR-Test - -

VP-Test - -

Indol-Erzeugung — —

io H₂S-ErZeUgUiIg + (schwach) + (schwach)

Stäriffhydrolyse — — Verwertung von Zitronensäure in Koser's Medium — + Christensen'i Medium — +

Verwertung anorganischer Stickstoffquellen

Nitrat - -

Aromoniumsalz — — Erzeugung von Farbstoff Urease-Wirksamkeit Oxidase-Wirksamkeit Katalase- Wirksamkeit Wachstum bei pH Temperatur," C

aerobes
Wachstum
O-FTest
(Methode nach Hush Leifson)

Erzeugung von Säure und Gas aus Zucker L-Arabinose — —

D-Xylose

D-Glukosc - -

D-Mannose — — ⁴⁰ D-Fruktose

D-Galaktose - —

Maltose — —

Saccharose — —

Laktose — —

Trehalose — —

D-Sorbit - -

D-Mannit — —

Inosit — —

Glycerin + (schwach) — ⁵⁰ Stärke

Raffinose — —

Inulin — —

D-Ribose - -

Dulcit - ⁵⁵ Sorbose

Carboxymethylcellulose — — Empfindlichkeit gegenüber Halogen

5 Gew.-%ige wäßrige Natriumchloridlösung 10 Gew.-%ige wäßrige

Natriumchloridlösung Zersetzung von Gelatine

DNA-ase Wirksamkeit essentielle Vitamine

6 bis 9,5	4,5 bis 9,5,
	vorzugsweise
	8 bis 8,5
5 bis 50	15 bis 38,
	vorzugsweise
	28 bis 30
ja	ja
oxidierend	oxidierend
Säure Gas	Säure Gas

Isolierungsquelle

wächst	wächst
wächst nicht	wächst schwach
Thiamin und Folsäure Boden	Pantothensäure und Nikotinsäure Boden

Bei der Klassifizierung dieser beiden Stämme aufgrund der bakteriologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf »Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974)« von Burgey wurde der Stamm DK-2 als zur Gattung Pseudomonas gehörend identifiziert, da er Gram-negative Stäbchen mit einer Geißel aufweist und hinsichtlich der Oxidase-Wirksamkeit und der Denitrifizierung eine positive Reaktion verursacht.

Auf der anderen Seite wurde der Stamm DK-19 als zur Gattung Arthrobacter gehörend identifiziert, da er schwach Gram-positive Stäbchen aufweist, in verschiedenen Formen auftritt, Flimmerhärchen aufweist und Saccharide nicht verwertet.

Das erfindungsgemäße Enzym mit sowohl D-Threonin-Aldolase als auch D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit kann durch Kultivieren eines der genannten Stämme in einem Nährmedium erzeugt werden, wie es für die Kultivierung von Bakterienstämmen üblich ist, und das Saccharide, wie Glucose, Glycerin, Melasse und dergleichen oder organische Carbonsäuren, wie Essigsäure, Apfelsäure und dergleichen als Kohlenstoffquelle enthält, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff und dergleichen als .Stickstoffquelle, Hefeextiakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser usw. als organische Nährstoffe und Magnesium, Eisen, Mangan, Kalium, Phosphat usw. als anorganische Ionen. Die Kultivierung kann unter den herkömmlichen Bedingungen durchgeführt werden, d. h. bei pH 4 bis 10 des Kulturmediums bei einer Temperatur von 20 bis 6O⁰C, wobei nach der Beimpfung 1 bis 3 Tage aerob kultiviert wird.

Durch Kultivierung der oben genannten Stämme unter den angegebenen Bedingungen wird das Enzym mit sowohl D-Threonin-Aldolase als auch D-Allothreonin-Aldolasc Wirksamkeit in den Bakterienzellen erzeugt und dort angereichert. Zur Isolierung des Enzyms in reinerer Form aus dem Kulturmedium werden die vermehrten Mikroorganismenstämme, nachfolgend als »Bakterienzellen« bezeichnet, in herkömmlicher Weise zerstört, z. B. mechanisch oder durch Behandlung mit einem Enzym und Autolyse, um einen Rohextrakt des Enzyms zu erhalten. Dieser Rohextrakt wird durch eine geeignete Kombination einer Fällung mit Ammoniumsulfat oder einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Methanol und Chromatographieren unter Verwendung eines Ionenaustauschers, wie Diethylaminoethyl (nachfolgend als »DEAE« bezeichnet)-Sepharose^e, DEAE-Sephadex® und Calciumphosphatgel usw. oder eines Adsorptionsmittels usw. gereinigt. Zur Feststellung der Enzymwirkung ist die Gegenwart eines Cocnzyms, Pyridoxal-5'-phosphat, gewöhnlich in einer Menge von ΙΟ-⁵ bis 10-³M notwendig.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des neuen Enzyms gemäß der Erfindung sind nachfolgend aufgeführt:

(1) Wirksamkeit und Substratspezifität:

Das neue erfindungsgemäße Enzym baut sowohl D-Threonin als auch D-Allothreonin zu Glycin und Acetaldehyd ab. Andererseits wirkt es überhaupt nicht auf L-Threonin und L-Allothreonin.

(2) Optimaler pH-Wert:

Aus der Feststellung des durch das neue Enzym aus D-Threonin als Substrat innerhalb von 10 Minuten bei 30⁰C bei einer Reihe von pH-Werten gebildeten Aldehyds ermittelte man, daß der optimale pH-Wert des neuen Enzyms im Bereich von 7 bis 9 liegt. Die verwendeten entsprechenden Pufferlösungen sind 0,1 M Phosphatpuffer für einen pH-Bereich von 4 bis 7,5, 0,1 M tris-HCI-Puffer für einen pH-Bereich von 7 bis 9 und 0,1 M Natriumcarbonatpuffer für einen pH-Bereich von9 bis 11.

(3) pH-Bereich, in dem das neue Enzym beständig ist:

Aus der Feststellung der verbliebenen Wirksamkeit des neuen Enzyms nach 1-stündigem Erwärmen einer Lösung des Enzymsauf 30° C bei einer Reihe von pH-Werten ermittelte maa daß das neue Enzym in einem pH-Bereich von 6 bis 9 in beständigem Zustand existieren kann. Die für die Kultivierung verwendeten entsprechenden Pufferlösungen sind 0,1 M Phosphatpuffer für den pH-Bereich 4 bis 7,5,0,1 M tris-HCl-Puffer für den pH-Bereich 7 bis 9 und 0,1 M Natriumcarbonatpuffer für den ph-Bereich 9 bis 11.

(4) Methode zur Bestimmung der Enzymwirksamkeit:

Die Menge des Acetaldehyds, die gebildet wird, wenn man 0,1 ml einer das neue Enzym enthaltenden Flüssigkeit zu 0,4 ml einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung gibt, die 100 Mikromol D-Threonin bei pH 8,0 enthält, und die Mischung 10 Minuten auf 30⁰C erwärmt, wird nach der Methode von Paz bestimmt (Arch. Biochem. Biophys„ Band 109, Seite 548 (1965)). Die Enzymwirksamkeit für den Abbau von 1 Mikromol D-Threonin bei 30°C wird als Standard, d. h. eine Einheit (E) genommen.

(5) Optimale Temperatur für die Wirksamkeit:

Aus der Feststellung der Menge Acetaldehyd, die von dem neuen Enzym bei einem optimalen pH-Wert (8,0) bei verschiedenen Temperaturen während 10 Minuten unter Verwendung von 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung gebildet wurde, stellte man fest, daß der optimale Temperaturbereich für das Enzym 40 bis 50° C beträgt

(6) Hitzebeständigkeit des neuen Enzyms:

Aus der Bestimmung der verbliebenen Wirksamkeit nach dem Erwärmen einer Lösung des neuen Enzyms _t

in einer 0,1 M tris-HCI-Pufferlösung vom pH 8,0 während einer Stunde auf eine Reihe von Temperaturen Ϊ'

ermittelte man, daß die Temperatur, bei der das Enzym beständig ist. unter 40⁰C liegt. >'

(7) Bedingungen für die Inaktivierung des neuen Enzyms: _v

Das neue Enzym gemäß der Erfindung wird vollständig bei pH unter 5 und bei pH über 11 inaktiviert, ferner ', ίο durch einstündiges Erhitzen auf eine Temperatur über 70"C. ''

(8) Mittel, die die Wirksamkeit hemmen, aktivieren oder stabilisieren: t

Das neue Enzym wird durch Mercaptoethanol, Natriumsulfit, Natriumhydrogensulfit, Dithiothreit, Mn²⁺, ^ Co²⁺, Fe²⁺ und Mg²* aktiviert und stabilisiert und durch einwertiges Ag⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Zn²⁺, Pd²⁺, >| Hydroxylamin und p-Chlormercuriben/.oat gehemmt. jjj§

(9) Coenzym: jlif

Das Coenzym für das Enzym ist Pyridoxal-5'-phosphat. |g

(10) Molekulargewicht: "'{;

Das Molekulargewicht des Enzyms liegt im Bereich von 100 000 bis 150 000, wie durch Gelfiltration unter f| Verwendung von Sephadex· G-200 festgestellt wurde. W

(11) Elementaranalyse: ψ

50,7 bis 52.7% C ff

6,8 bis 8,8% H |

14,7 bis 16.7% N 1

Da die bekannte Threonin-Aldolase und Allothreonin-Aldolase nur L-Threonin und L-Allothreonin abbau- §

en und keine die D-Isomeren abbauenden Enzyme bekannt sind, stellen die in den Mikroorganismenstäm- g

men festgestellten Enzyme neue Enzyme mit neuer Wirksamkeit dar. |

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete L-Allothreonin-Aldolase ist ein Enzym, das die Umwand- M lung von L-Allothreonin in Glycin und Acetaldehyd katalysiert. Es ist bekannt, daß dieses Enzym in Schafsleber g und in keimender Mais-(Kom)-saat enthalten ist. Ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Herstellung ist ||

jedoch nicht bekannt. ji|

Es wurde jedoch jetzt gefunden, daß die im Patentanspruch zum Verfahren B) genannten Bakterien, die zu den jjg Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter und Alcaligenes gehören, dieses Enzym bilden, und ein Verfahren zur technischen Erzeugung des Enzyms in großem Maßstab entwickelt. Mikroorganismen, die L-AIIothreonin-Aldolase zu erzeugen vermögen, sind der Stamm Bacillus DK-315. der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 6202 hinterlegt und aus einer Bodenprobe isoliert wurde, der Stamm Arthrobacter DK-19 (FERM-P Nr. 6201), der Stamm Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nr. 6200) und der Stamm Alcaligenes faecalis, der beim Institut for Fermentation, Osaka, Japan unter der Hinterlegungsnummer IFOl 2669) hinterlegt wurde.

Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes Bacillus DK-315(FERM-P Nr. 6202) sind:

(a) Morphologische Eigenschaften:

(1) Form und Größe der Zellen: Stäbchen von 0,8 χ 2,0 Mikrometer
(2) Tritt nicht in mehreren Form auf

(3) Beweglichkeit: positiv, Flimmerhärchen

(4) Sporen: ellipsoid, nicht zentrisch

(5) Gram-Färbung: positiv

(6) nicht säurefest

(b) Wachstum in verschiedenen Kulturmedien

(1) Plattenkultur aus Agar und Bouillon: vorteilhaft mit kreisförmigen Kolonien

(2) Schrägkultur aus Agar und Bouillon: vorteilhaft, halbdurchsichtig, glänzend (3) flüssiges Kulturmedium mit Bouillon: vorteilhaft

(4) Stabkultur aus Gelatin und Bouillon: vorteilhaft in Fadenform auf der Oberfläche des K ulturmediums

(5) Lackmusmilch: Entfärbung und Verflüssigung

(c) Physiologische Eigenschaften

Nitratreduktion:

Denilrifizierung:

MR-Test:

VP-Test:

Indol-Erzeugung:

H2S-Erzeugung:

Stärkehydrolyse:

Verwertung von Zitronensäure in Koser's Medium:

in Christensen's Medium:

Verwertung von anorganischem Stickstoff Nitrat:

Ammoniumsalz:

Erzeugung von Farbstoff:

Urease-Wirksamkeii:

Oxidase-Wirksamkeit:

Katalase-Wirksamkeit:

Wachstum bei pH: Temperatur:

aerobes Wachstum:

OF-Test(Hush Leifson's Methode):

Erzeugung von Säure und Gas aus Zuckern

ten +	5
+
+ (schwach)	10
+	15
-
+ 11+1

+ (schwach)

5 bis 12
5 bis 40° C
ja
F

Säure

Gas

L-Arabinose

D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fructose

D-Galactose

Maltose Sacchrose Lactose Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke

Empfindlichkeit gegenüber Halogen:

in wäßriger 5%iger Natirumchloridlösung

Zersetzung von Gelatine: DNA-ase-Wirksamkeit:

essentielle Vitamine:

wächst nicht

keine

Aufgrund der oben genannten bakteriologischen Eigenschaften wurde unter Bezugnahme auf »Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974)« von Burgey der Stamm DK-315 als zur Gattung Bacillus gehörend identifiziert, da er sich mit Flimmerhärchen bewegt und Gram-positive Stäbchen mit der Fähigkeit zur Sporen- 55 bildung aufweist

L-Allothreonin-Aldolase kann durch Kultivieren der oben genannten Mikroorganismenstämme in einem Nährmedium erzeugt werden, wie es üblicherweise für die Kultivierung von Bakterienstämmen verwendet wird, und das Saccharide, wie Glukose, Glycerin und Melasse oder eine organische Säure, wie Essigsäure, Äpfelsäure und dergleichen als Kohlenstoffquelle, Ammoniumsulfat Ammoniumchlorid, Harnstoff und dergleichen als 60 Stickstoffquelle, organische Nährstoffe, wie Hefeextrakt Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser und dergleichen, ferner Metallsalze, wie Magnesium-, Eisen-, Mangan- und Kaliumsalze sowie Phosphate als anorganische Ionen enthält Die Kultivierung erfolgt unter den für Bakterien üblichen Bedingungen bei einem pH-Wert von 4 bis 10 während 1 bis 3 Tagen bei 20 bis 60° C Sie wird aerob bei einem pH-Wert des Kulturmediums von 4,0 bis 10,0 durchgeführt 65

Die auf diese Weise gebildete L-Allothreonin-Aldolase reichert sich in den Bakterienzellen an. Zur Isolierung des Enzyms aus dem Kulturmedium werden die Bakterienzellen in bekannter Weise aufgebrochen, z. B. mechanisch, enzymatisch oder durch Autolyse, worauf man einen Rohextrakt des Enzyms gewinnt Der Rohextrakt

wird durch eine geeignete Kombination von Fällverfahren mit Ammoniumsulfat oder einem Lösungsmittel, wie Aceton oder Ethanol und chromatographische Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern, wie DEAE-Sepharose, DEAE-Sephadex, Calciumphcsphatgelen oder Adsorptionsmitteln gereinigt, um ein Enzym hoher Qualität zu erhalten. Nachfolgend sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften einer auf diese Weise erhaltenen gereinigten L-Allothreonin-Aldolasc aufgeführt:

(1) optimaler pH-Wert: 8 bis 9

(2) optimale Temperatur: 60 bis 70° C

(3) Inaktivierungsbedingungen: wird in einer Stunde bei 30°C und einem pH-Wert von unter 5 oder über 11 ίο oder in einer Stunde bei einer Temperatur von über 50° C und einem pH-Wert von 8 inaktiviert

(4) Hemmstoffe:Cu^J+, Hg²⁺und Ag^{1 +}

(5) Stabilisierungsmittel: Mercaptoethanol, Dithiothreit und Natriumsulfit

(6) Coenzym:Pyridoxal-5'-phosphat

Da L-Allothreonin-Aldolase zur Ausübung seiner Wirksamkeit Pyridoxal-5'-phosphat als Coenzym erfordert, werden gewöhnlich 10//bis 10~⁵ M Pyridoxal-5'-phosphat für die Enzymreaktion verwendet.

(7) Molekulargewicht: 100 000 bis 150 000, ermittelt durch Gelfiltration mittels Sephadex®G-200.

(8) Elemcntaranalyse:
C: 51,4 bis 53,4%
H: 6,5 bis 8,5%

N: 14,2 bis 16,2%.

Für die Verwendung von L-Allothreonin-Aldolase im erfindungsgemäßen Verfahren reicht es aus, wenn sie L-Allothreonin zu Glycin und Acetaldehyd abbaut.

Die Verwendung der erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme, d. h. der D-Threonin-Aldolasi: und L-Allothreonin-Aldolase ist nicht auf eine Verwendung in isoliertem reinen Zustand beschränkt, sondern es können halbgereinigte Produkte, Rohextrakte, selbst das Kulturmedium, lebende Zellen, gefriergetrocknete Zellen, mittels Aceton getrocknete Zellen, vermahlenc Zellen, vermahlene Schafsleber usw. für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Es ist auch möglich, die Enzyme in immobilisierter Form oder in Form von immobilisierten Zellen einzusetzen. Für die Immobilisierung ist eine Kombination mit einem Träger, ein Vcrnetzungsverfahren, ein Einschließungsverfahren, ein Agglutinationsverfahren und dergleichen anwendbar.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann auf jegliche bekannte Weise erhaltenes Dl-Threonin oder ein Gemisch aus DL-Threonin und DL-Allothreonin verwendet werden. Zum Beispiel kann man ein Produkt einsetzen, das dadurch erhalten wurde, daß man als Ausgangsstoff verwendetes Acetoacetat in einen Ester der alpha-Amino-beta-hydroxybuttersäure umsetzte, das Amino-hydroxybutyrat mit Thionylchlorid in eine Oxazolinester umwandelte und dann den Ester durch Erhitzen hydrolisiert, vgl. J.Am.Chm.Soc Band 71 (1949) Seite 1101, ferner ein solches, bei dem Vinylacetat als Ausgangsstoff in einem Oxo-Verfahren einer Hydroforrnylierung zu alpha-Acetoxy-propionaldehyd unterworfen und der Aldehyd dann mit Cyanwasserstoff und Ammoniak zu alpha-Amino-beta-hydroxybutyronitril umgesetzt wurde, das seinerseits mit Phosgen in eine Oxazolidonderivat umgewandelt und dieses Derivat dann hydrolisiert wurde, vgl. japanische PatentvenSffentlichung Nr. 40-11608(1965). Da im erfindungsgemäßen Verfahren die angestrebte Verbindung jedoch L-Threonin ist und die Nebenprodukte aus Glycin und Acetaldehyd bestehen, wird ein synthetisches Verfahren bevorzugt, das in kleinerer Menge zu den allo-Formen führt und Glycin und Acetaldehyd als Ausgangsstoffe erfordert. Deshalb ist ein Verfahren, bei dem ein Metallsalz mit Glycin zu einem Metallkomplex von Glycin und dieser Komplex darauf mit Acetaldehyd kondensiert wird, ein geeignetes Verfahren für die Herstellung einer Mischung aus DL-Threonin und DL-Allothreonin, — vgl. die japanischen Patcntveröffentlichungen Nr. 3ti-19562(1961) und 47-39093(1972). Die die Mischung enthaltende Lösung kann aus einer wäßrigen Lösung bestehen, die man durch Lösen des in Form von Kristallen erhaltenen Produktes in Wasser erhalten hat. Es kann jedoch auch die durch Synthese erhaltene Flüssigkeit sein oder eine als Zwischenprodukt gebildete Flüssigkeit bei ds:r Gewinnung der Kristalle aus der Mischung. Kurz gesagt, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, DL-Threonin und DL-Allothreonin enthaltende Flüssigkeit kann aus einer DL-Threonin und DL-Allothreonin enthaltenden Lösung bestehen, wobei das Verhältnis des D-Isomeren zum L-Isomeren in der Lösung sowie das Verhältnis der Threonine zu den Allothreoninen in der Lösung keine Rolle spielen. Weiterhin kann die Lösung andere Verunreinigungen enthalten, jedoch sollten Verunreinigungen, die die Enzymreaktion hemmen, entfernt werden. Zum Beispiel sollte, wenn bei der Synthese ein Metallion verwendet wurde, das für die Enzymreaktion schädlich ist, dieses vor der Enzymreaktion mit einem Kationenaustauscherharz etc. entfernt werden.

Die Behandlung einer DL-Threonin enthaltenden Lösung mit D-Threonin-Aldolase oder einer sowohl DL-Threonin als auch DL-A!!othreonin enthaltenden Lösung mit einer Mischung von D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Alsolase macht keine Schwierigkeit Das Enzym muß lediglich in der wäßrigen Lösung der angegebenen Substanz vorhanden sein. Die Konzentration des DL-Threonins und/oder des DL-AIlothreonins in der Lösung ist variierbar und beträgt vorzugsweise 0,1 bis 2 Mol/Liter. Das Lösungsmittel für das enzymatische Reaktionssystem ist hauptsächlich Wasser, jedoch kann auch ein organisches Lösungsmittel enthalten sein, sofern dieses die Enzymreaktion nicht hemmt Obgleich der pH-Wert des Reaktionssystems vom Enzym abhängt, liegt er vorzugsweise um pH 7 bis 10 in den Fällen, in denen das Enzym nach den angegebenen Beispielen erhalten wurde. Ebenso hängt die Reaktionstemperatur vom Enzym ab, beträgt jedoch vorzugsweise 30 bis 45°C in den Fällen, in denen das Enzym wie in den Beispielen hergestellt wurde. Außerdem kann bei Verwendung der gemäß den Beispielen hergestellten Enzyme die Enzymreaktion durch Einbringung von 10~³ bis 10~⁵ Mol Pyridoxal-5'-phosphat als Coenzym beschleunigt werden. Schließlich kann für verschiedene Zwecke ein

oberflächenaktives Mittel in das Reaktionssystem gegeben werden. Die enzymatisch^ Reaktion kann Chargen- |

weise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Dabei kann man die D-Threonin-Aldolase und die L-Allothreonin-Aldolase zusammen oder gelrennt zufügen.

Die Reaktionszeit ka;.n je nach dem für das L-Threo.iin beabsichtigten Verwendungszweck ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel zusammen mit dem L-Threonin nicht abgebautes Isomeres vorhanden sein kann, kann man die Reaktion vor Beendigung des enzymaiischcn Abbaus des Isomeren unterbrechen. Auf jeden Fall ist für jedes Enzym eine Reaktionszeit von 5 bis 100 Stunden ausreichend.

Nach Beendigung der Enzymreaktion werden im Reaktionsgemisch suspendierte Substanzen, sofern notwendig, durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, worauf man das Reaktionsgemisch durch Behandlung mit „ einem Ionenaustauscherharz und Kristallisation reinigt, oder nach der Entfärbung der Reaktionslösung mit 10 g Α-Kohle etc. die entfärbte Lösung zur Erzielung von Kristallen aus L-Threonin in reinem Zustand einengt. Das | Reaktionsproduki enthält außer dem L-Threonin Glycin und Acetaldehyd bei Verwendung von D-Threonin-Al- | dolase und auch bei Verwendung von D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase. Das Glycin kann | durch Chromatographieren, z. B. unter Verwendung eines lonenaustauscherharzes abgetrennt und isoliert wer- | den. Wegen der nicht-enzymatischen Kondensation des Acetaldehyds mit Glycin während der Enzymreaktion 15 cf oder der Wiedervereinigung mit Glycin aufgrund der Enzymeinwirkung, ist es besser, den Acetaldehyd während ij] der Enzymreaktion durch Destillation etc. zu entfernen. ψ

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich das D-Threonin oder das DL-Allothreonin bequem in einer >■; Stufe aus einem Threonin-Gemisch entfernen, was bisher nicht möglich war. Die Erfindung löst somit das große ^,

Problem, das bisher die Abtrennung des Isomeren behinderte, und stellt ein kostengünstiges Verfahren zur Gewinnung von L-Threonin aus synthetisch hergestelltem Threonin zur Verfügung. Es ist besonders günstig, wenn die synthetische Herstellung des Threonins aus Clycin und Acetaldehyd erfolgte, da in diesem Fall die Nebenprodukte der enzymatischen Reaktion als Ausgangsstoffe wiederverwenaet werden können.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

In ihnen beziehen sich alle Prozentangaben auf das Gewicht. Die Aktivität der D-Allothreonin-Aldolase und der L-Allothreonin-Aldolase wurde wie die der D-Threonin-Aldolase gemessen, mit der Abweichung, daß das Substrat dem Enzym entsprechend ausgetauscht wurde. Die Aktivität wurde in der Weise festgelegt, daß die Aktivität für den Abbau eines Mikromols Allothreonin, des Substrats, in einer Minute eine Einheit ist (1 E).

A. Herstellung eines Enzyms mit D-Threonin-Aldolase und D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit

Man stellte ein auf pH 7,5 eingestelltes Kulturmedium her, das 0,5% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 0,1% Kaliumdihydrogensulfat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,1% L-Glutaminsäure und 0,5% D-Threonin enthielt In einen 5-Ltter-Behälter wurden 3 Liter dieses Kulturmediums eingeführt. Dann wurde dieses Medium 10 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Das so sterilisierte Kulturmedium wurde mit Arthrobacter DK-19 (FERM-P Nr. 6201) beimpft und 20 Stunden bei 3O⁰C unter Belüften und Rühren bebrütet.

Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeit gesammelt, und nach dem Waschen der Zellen mit wäßriger 0,9%igcr Natriumchloridlösung wurden die nassen Zellen in 100 ml 0,1 M Phosphatpufferlösung suspendiert, die 10 mM Mercaptoethanol und 0,1 mM Pyridoxal-5'-phosphat enthielt. Nach der Behandlung der so erhaltenen Zelkuspension mit Ultraschall von 20 kHz 5mal für jeweils 5 Minuten wurde die Suspension zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu sammeln. Nach der Zugabe von ;

Protaminsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit zur Entfernung von Nukleinsäure wurde die Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat fraktioniert, um eine enzymhaltige Fraktion mit D-Threonin-Aldolase Wirksamkeit zu erhalten.

Nachdem man diese Fraktion einer Dialyse gegen 0,01 M Phosphatpuffer unterworfen hatte, der 10 mM Mercaptoethanol und 0,1 mM Pyridoxal-5'-phosphat enthielt und einen pH-Wert von 7,5 aufwies, wurde das erhaltene Dialysat durch eine Säule geführt, die 100 ml DEAE-Sephadex® A-50 enthielt. Die von der Säule adsorbierte Fraktion wurde unter Anwendung eines Kaliu-.nchlorid-K.onzentrationsgradienten fraktioniert eluiert, um eine enzymhaltige Fraktion mit D-Thrconin-Aldolase Aktivität zu gewinnen. Durch Einengen dieser Fraktion durch Ultrafiltration erhielt man 10 ml einer Lösung von gereinigter D-Threonin-Aldolase. Die D-Threonin-Aldolase und die D-Allothreonin-Aldolase Aktivität der so erhaltenen Lösung betrug 5 E/ml bzw. 12,3 E/ml.

B. Herstellung von Enzymen mit D-Threonin-Aldolase und D-Ailothreonin-Aldolase Wirksamkeit

Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nr. 6200) und Alcaligenes faecalis IFO 12669 wurden jeweils im gleichen Kulturmedium nach dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben kultiviert. Aus den erhaltenen Kulturmedien wurden nach den gleichen Verfahren jeweils 10 ml einer Lösung von gereinigter D-Threonin-Aldolase erhalten. Die D-Threonin-Aldolase und die D-Allothrconin-Aldolase Wirksamkeit des Enzyms, das durch Kultivierung von Pseudomonas DK-2 erhalten worden war, betrug 4,5 E/ml bzw. 10,8 E/ml und die des Enzyms, das durch Kultivierung von Alcaligenes faecalis erhalten worden war, 4,2 E/ml bzw. 9,5 E/ml.

C. Herstellung von L-Allolhreonin-Aldolase

Bacillus DK-315 (FERM-P Nr. 6202) wurde im gleichen Kulturmedium in gleicher Weise wie oben kultiviert, worauf man nach den gleichen Verfahren 10 ml wäßrige Lösung gereinigter L-Allothreonin-Aldoiase erhielt Die L-Allothreonin-Alddase Wirksamkeit der erhaltenen Lösung betrug 4,5 E/ml. Diese Lösung zeigte keinerlei Wirkung auf D-Allothreonin und D-Threonin.

D. Herstellung von DL-Threonin

In 5 Liter heißem Wasser löste man 75 g Glycin und gab dann langsam 100 g basisches Kupfercarbonat zu der Lösung. Die Mischung wurde durch Erhitzen zur Umsetzung gebracht Nach beendeter Umsetzung wurde der Überschuß an basischem Kupfercarbonat aus der heißen Lösung abfiltriert und nach dem Einengen des Filtrats unter verringertem Druck wurde das konzentrierte Filtrat gekühlt Man erhielt 110 g kristallinen Kupfer-Glycin Komplex.

In 1 Liter Wasser wurden 58 g des Kupfersalzes von Glycin, 40 g Anionenaustauscherharz SA 21A (HCCVTyp) und 45 ml Acetaldehyd gegeben. Die Mischung wurde unter Rühren 2 Stunden auf 4O⁰C erwärmt Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch 24 Stunden bei 5⁰C stehengelassen. Es fielen Kristalle des Bisacetaldehyd-Threonin-Kupfer Komplexes aus. Nach dem Abfiltrieren der Kristalle zusammen mit dem Katalysator wurde der Feststoff in 0,6 Liter wäßriger 3%iger Ammoniaklösung suspendiert und die Suspension filtriert Das Filtrat wurde durch eine Säule geführt, die mit 1,2 Liter Chelatharz, Dowex· A-I (NH«-Typ) gefüllt war, um das Kupfer aus dem Filtrat zu entfernen. Die Fraktion mit positiver Ninhydrin Reaktion wurde gesammelt und unter verringertem Druck eingeengt. Durch Zugabe von Methanol zu dem Konzentrat erhielt man Kristalle, die aus wäßriger methanolischer Lösung umkristallisiert wurden. Ausbeute 41 g DL-Threonin, das keinerlei Allothreonin enthielt.

E. Synthese eines Gemisches aus DL-Threonin und DL-Allothreonin

In 5 Liter heißem Wasser wurden 75 g Glycin gelöst, worauf man langsam 100 g basisches Kupfercarbonat zu der Lösung gab und die Mischung durch Erhitzen zur Umsetzung brachte. Nach beendeter Reaktion wurde das überschüssige basische Kupfercarbonat aus der heißen Lösung abfiltriert und nach dem Einengen des Filtrates unter verringertem Druck wurde das Filtrat gekühlt, worauf man HOg kristallinen Kupfer-Glycin Komplex erhielt

In 0,8 Liter Methanol, die 6 g Kaliumhydroxid enthielten, wurden 58 g Kupfer-Glycin Komplex und 50 g Acetaldehyd gegeben. Diese Mischung ließ man 1 1/2 Stunden unter Rühren bei 50 bis 60°C reagieren. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch filtriert, um eine kleine Menge nicht gelösten Materials zu entfernen. Nach Zugabe von 6,4 g Essigsäure zum Filtrat wurde zur Entfernung des Lösungsmittels unter verringertem Druck destilliert Nachdem die rohe Kupfer-Thrconin Verbindung, die als Destillationsrückstand verblieben war, ausreichend mit Wasser gewaschen worden war, wurde die kristalline Verbindung in 0,5 Liter 6N wäßriger Ammoniaklösung gelöst. Die erhaltende Lösung wurde durch eine Säule geführt die mit 2 Liter Dowex* A-I (NH₄-TyP), einem chelatbiloenden Harz gefüllt war, um das Kupfer aus der Lösung zu entfernen und die das Threonin enthaltende Fraktion zu sammeln. Sie wurde unter verringertem Druck auf 100 ml eingeengt, worauf man 400 ml Methanol zusetzte und die Mischung kühlte. Die ausgeschiedenen Kristalle wurden aus wäßriger methanolischer Lösung umkristallisiert. Ausbeute 38 g kristallines DL-Threonin, das 10% DL-Allothronin enthielt

Beispiel 1

In 20 ml einer wäßrigen Lösung, die 10-⁶ Mol Pyridoxal-5'-phosphat, IO~⁴ Mol Mercaptoethanol, 10-³ Mol Manganchlorid und 238 g kristallines DL-Threonin enthielten, das wie oben unter E hergestellt worden war und !0% DL-Allothreonin enthielt, wurden 10ml der gereinigtes Enzym enthaltenden Lösung gemäß A mit D-Threonin-Aldolase und D-Allothreonin-Aldolasc Wirksamkeit sowie 10 ml der gereinigten L-Allothreonin-Aldolase Lösung gemäß C gegeben. Diese Mischung wurde 24 Stunden bei 3O⁰C zur Umsetzung gebracht, wobei man den während der enzymatischen Reaktion gebildeten Acetaldehyd zur Entfernung und Gewinnung unter verringertem Dnck abdestillierte. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde während der Reaktion durch Zugabe von 0,1 N Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,5 gehalten.

Nach beendigter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit verdünnter Chlorwassersäure neutralisiert und dann durch eine Säule geführt, die mit 100 ml Dowex® 50 WX-8 (H ⁺-Typ gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und das Threonin, Glycin usw., die auf der Säule absorbiert worden waren, wurden mit wäßriger 0,2 N Ammoniaklösung eluiert. Nach dem Einengen des Eluats zur Trockene unter verringertem Druck wurde der zurückgebliebene Feststoff in 20 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 3 eingestellt und die Lösung erneut durch eine Säule geführt, die mit 100 ml Dowex® 50 WX-8 (H ' -Typ) gefüllt war. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser, führte man wäßrige 0,1 N Ammoniaklösung durch die Säule, um eine Fraktion zu cluieren, die Threonin enthielt. Das Eiuat wurde unter verringertem Druck zu einem Feststoff eingeengt. Der Feststoff wurde in 4 ml Wasser gelöst, worauf man langsam 10 ml Ethanol zu der Lösung gab. Die ausgefallenen Kristalle wurden isoliert. Das Trockengewicht der Kristalle betrug 0,9 g. Die Papierchromalographie bestätigte, daß die Kristalle aus reinem Threonin bestanden.

Die spezifische Drehung der Krislalle betrug
[«]? -28.7° (in Wasser),

die mit der einer authentischen Probe von reinem L-Threonin übereinstimmte.

Die wäßrige 0.1 N Ammoniaklösung wurde durch die übrige Säule geführt, um eine Glycin enthaltende Fraktion zu eluieren. Das Eluai wurde unter verringertem Druck zu einem Feststoff eingeengt und der Feststoff in I ml Wasser gelöst. Durch langsame Zugabe von 4 ml Ethanol zu der Lösung fielen Kristalle aus, die isoliert und getrocknet wurden. Ausbeute 0,65 g Glycin, wie durch Papierchromatographie bestätigt wurde. Die Menge des während der Reaktion unter verringertem Druck entfernten Acetaldehyds betrug 034 g.

Beispiel 2

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß 10 ml der gereinigten D-Threonin-Aldolase Lösung verwendet wurden, die mit Pseudomonas DK-2 FERM-P 6200 gemäß B erhalten worden waren, wurde das 10% DL-Allothreonin enthaltende DL-Threonin umgesetzt. Man erhielt 0,91 g kristallines Threonin, das keinerlei Allothreonin enthielt, 0,66 g kristallines Glycin und 034 g Acetaldehyd. Dk spezifische Drehung des kristallines Threonins betrug

[λ]'/ -28,7° (in Wasser),

was bestätigt, daß die Krislalle ausschließlich aus L-Threonin bestanden.

Beispiel 3

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß 10 ml der gereinigten D-Threonin-Aldolase Lösung verwendet wurden, die mit Alcaligenes faecalis IFO 12669 gemäß B erhalten worden waren, wurde das 10% DL-Allothreonin enthaltende DL-Threonin umgesetzt. Man erhielt 0,91 g kristallines Threonin, das keinerlei Allothreonin enthielt, 0,66 g kristallines Glycin und 034 g Acetaldehyd. Die spezifische Drehung des kristallines Threonins betrug

[«]{,' -28,7° (in Wasser),
was bestätigt, das die Kristalle ausschließlich aus L-Threonin bestanden.

Beispiel 4

Zu 30 ml einer wäßrigen Lösung, die 238 g DL-Threonin gemäß D, 10-" Mol Pyridoxal-5'-phosphat, 10~⁴ Mol Mercaptoethanol und 10-³ Mol Manganchlorid enthielten, wurden 10 ml der gereinigten D-Threonin-Aldolase Lösung gemäß A gegeben. Die Mischung wvrde 24 Stunden bei 30⁰C zur Umsetzung gebracht, wobei man den *o während der enzymatischen Reaktion gebildeten Acetaldehyd entfernte und gewann. Der pH-Wert des Reaktionssystems wurde durch Zugabe wäßriger 0,1 N Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 83 gehalten.

Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und dann durch eine Säule geführt, die mit 100 ml Dowex· 50 WX-8 (H * -Typ) gefüllt war. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurden das auf der Säule adsorbierte Threonin und das Glycin mit wäßriger 0,2 N Ammoniaklösung eluiert. Nach dem Einengen des Eluats unter verringertem Druck zu einem Feststoff wurde der Feststoff in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung durch Zugabe verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 eingestellt. Dann wurde sie erneut durch eine mit 100 ml Dowex® 50 WX-8 (H ^-Typ) gefüllte Säule geführt. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde wäßrige 0,1 N Ammoniaklösung durch die Säule geführt, um die Threonin enthaltende Fraktion zu eluieren. Das Eluat wurde unter verringertem Druck zu einem Feststoff eingeengt und dann der Feststoff in 4 ml Wasser gelöst. Durch langsame Zugabe von 10 ml Ethanol zu der Lösung wurden Kristalle ausgefällt, die abgetrennt und getrocknet wurden. Sie wogen 0,95 g und bestanden aus reinem Threonin mit einer spezifischen Drehung von

[λ]% -28,7° (in Wasser),

die mit der einer authentischen Probe von L-Threonin übereinstimmte.

Die 0,1 N Ammoniaklösung wurde weiter durch die oben genannte Säule geführt, um die Glycin enthaltende Fraktion zu eluieren. Das El'jat wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Nach dem Lösen des Feststoffes in 1 ml Wasser wurden langsam 4 ml Ethanol zugefügt, worauf sich Kristalle aus der Lösung ω abschieden. Sie wogen nach dem Trocknen 0,6 g und bestanden ausschließlich aus Glycin, wie durch Papierchromatographie bestätigt wurde. Die Menge des während der Umsetzung unter verringertem Druck entfernten und gewonnenen Acetaldehyds betrug 0,3 g.

Beispiel 5

Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nr. 6200) wurde unter den gleichen Bedingungen wie unter A angegeben kultiviert Die erhaltene 10 ml Fraktion mit D-Threonin-Aldolase Wirksamkeit sowie eine 10 ml Fraktion gemäß 5 C mit L-AUothreonin-Aldolase Wirksamkeit wurden durch Ultrafiltration eingeengt worauf man zwei Lösungen erhielt, die D-Threonin-Aldolr.re bzw. L-Allothreonin-Aldolase enthielten.

Durch Zugabe der beiden Lösungen zu einem Gemisch aus 2 g DL-Threonin und 1 g DL-Allothreonin unter

den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß eine Temperatur von 35°C anstelle von 30°C eingehalten wurde, erhielt man 035 g kristallines L-Threonin, das weder D-Thrconin noch DL-Allothreo-

to nin enthielt, ferner 1,01 g Glycin und 031 g Acetaldehyd. Die spezifische Drehung des erhaltenen L-Threonins bernig

[«*]? -28.6° (in Wasser).

is B e i s ρ i c I 6

(nachgereichl)

Arthrobacter DK-19 (FERM-P 6201). Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) und Alcaligenes faecalis IFO 12669 wurden jeweils in dem gleichen Kulturmedium und in der gleichen Weise wie unter A angegeben kultiviert. Nach

20 den gleichen Isolierungs- und Reinigungsverfahren wie unter A angegeben wurden aus diesen Kulturmedien jeweils 10 mi wäßrige Lösung einer gereinigten L-Allothreonin-Aldolase erhalten. Die L-Allothreonin-Aldolase-Aktivitäten der so erhaltenen Lösungen betrugen 3,8 E/ml Tür Arthrobacter DK-19 (FERM-P 6201), 4,2 E/ml für Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) und 3,9 E/ml für Alcaligenes faecalis IFO 12669. Die Lösungen zeigten keinerlei Wirkungen auf D-Allothreonin und D-Threonin.

25 Jedes der so erhaltenen Enzyme wurde mit der gleichen Kaliumchloridkonzentration cluiert wie das gemäß C hergestellte Enzym und zeigte die gleichen physikalischchemischen Eigenschaften wie Substratspezifität, Temperatur-Optimum, Thermosiabilitäl, pH-Optimum, pH-Stabilität und Molekulargewicht wie das gemäß C hergestellte Enzym.

Claims

Patentanspruch:
Verfahren zur Gewinnung von L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man auf eine wäßrige,

A) DL-Threonin oder

B) DL-Threonin und DL-Allothreonin

enthaltende Lösung bei einem pH-Wert um 7 bis 10 und einer Temperatur von 30 bis 45° C eine durch jeweils in üblicher Weise vorgenommenes Kultivieren von