DE2757980C2

DE2757980C2 -

Info

Publication number: DE2757980C2
Application number: DE2757980A
Authority: DE
Inventors: Hideaki Kyoto Jp Yamada; Satomi Takatsuki Jp Takahashi; Koji Amagasaki Hyogo Jp Yoneda
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1976-12-30
Filing date: 1977-12-24
Publication date: 1991-11-07
Also published as: DE2757980A1; JPS561909B2; US4237227A; JPS5391189A

Description

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für D-N- Carbamoyl-α-aminosäuren durch biochemische Hydrolyse von 5-substituierten Hydantoinen.

In "Febs Letters", Band 57, Nr. 2, 192 (1975) ist schon beschrieben worden, daß die D-Formen von N-Carbamoyl-α-aminosäuren hergestellt werden können, wenn man die DL-Formen von 5- substituierten Hydantoinen der Einwirkung von Hydropyrimidinhydrase von Kalbsleber unterwirft. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Verwendung dieses teuren Enzyms.

Ein Verfahren zur Umwandlung von 5-substituierten Hydantoinen in die D-Formen von N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch Verwendung von Mikroorganismen ist noch nicht bekannt. Ein einziger Fall der Bildung einer D-N-Carbamoyl-α-aminosäure durch mikrobielle Einwirkung wird in "Amino Acid and Nucleic Acid", Nr. 19, 48 bis 56 (1969) beschrieben. Nach dieser Arbeit wurde L-Methionin durch Züchten von Bacillus coagulans in einem Kulturmedium hergestellt, welches DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin enthielt. Dabei wurde D-N-Carbamoylmethionin als Nebenprodukt gebildet. Dieses Verfahren ist jedoch nicht dazu imstande, nur die D-N- Carbamoyl-α-aminosäure zu liefern.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren aus DL-, D- oder L- Formen von 5-substituierten Hydantoinen unter Verwendung von mikrobiellen Enzymen zur Verfügung zu stellen. Hierdurch sollen die D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren wirtschaftlich und mit guten Ausbeuten herstellbar sein. Durch die Erfindung sollen auch Substanzen herstellbar sein, die als Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln geeignet sind.

Es wurde gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kann durch ein Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren der allgemeinen Formel:

worin R eine C_1-4-Alkylgruppe, Hydroxy-C_1-4-alkylgruppe, Methylthio- C_1-4-alkylgruppe, Amino-C_1-4-alkylgruppe, Carboxy-C_1-4-alkylgruppe oder Benzylgruppe ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 5-substituierte Hydantoine mit der allgemeinen Formel:

worin R die oben angegebene Bedeutung hat, der Einwirkung einer Kulturbrühe, von Zellen oder behandelten Zellen eines der folgenden Mikroorganismen unterwirft:
Aerobacter cloacae IAM 1221, Agrobacterium rhizogenes IFO 13 259, Bacillus sphaericus IFO 3525, Brevibacterium incertum IFO 12 145, Candida macedoniensis IFO 0706, Micrococcus roseus IFO 3764, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Nocardia corallina IFO 3338, Proteus morganii IFO 3848, Pseudomonas striata IFO 12 996, Serratia plymuthicum IFO 3055, Steptomyces almquisti ATCC 618, Steptomyces flaveolus IFO 3408 oder Xanthomonas campestris IAM 1671.

Die intrazellularen Enzyme der Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden, wirken selektiv auf die D-Formen der 5-substituierten Hydantoine ein, so daß sie unter Spaltung des Hydantoinrings hydrolysiert werden. Da die nicht-hydrolysierten L-Formen in dem Reaktionsmedium razemisieren, werden die D-Formen dem Reaktionssystem immer in Substanz zugeführt. Gemäß der Erfindung können daher alle DL-, D- und L-Formen der 5-substituierten Hydantoine verwendet werden. Nur die D-Formen von N- Carbamoyl-α-aminosäuren können erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat einen großen technischen Nutzungswert, da bei diesem Mikroorganismen verwendet werden, die leicht und billig erhältlich sind.

Es ist bekannt, daß optisch aktive N-Carbamoyl-α-aminosäuren in optisch aktive α-Aminosäuren umgewandelt werden können, ohne daß die Konfiguration verändert wird, indem mit salpetriger Säure umgesetzt wird. Wenn man daher mit dieser Umsetzung das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert, dann wird die technisch vorteilhafte Herstellbarkeit der D-Formen von α- Aminosäuren möglich. Da die Bedeutung von D-α-Aminosäuren als Zwischenprodukte für die Herstellung von beispielsweise Antibiotika und Peptidhormonen in den letzten Jahren ansteigt, ist die vorliegende Erfindung von großem Wert.

Es können alle beliebigen DL-, D- und L-Formen der 5-substituierten Hydantoine als Ausgangsmaterialien bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Im Falle der 5-substituierten Hydantoine, die durch chemische Synthesen leicht hergestellt werden können, werden geeigneterweise die DL-Formen verwendet. Die DL-Formen werden aus den entsprechenden Aldehyden nach dem Bucherer-Berg-Verfahren hergestellt, das als synthetisches Verfahren zur Herstellung von α-Aminosäuren bekannt ist. Wenn L-α-Aminosäuren im Handel erhältlich sind und billig verfügbar sind, dann werden geeigneterweise die L-Formen der 5- substituierten Hydantoine eingesetzt, die sich von L-α-Aminosäuren ableiten. Die L-Formen der 5-substituierten Hydantoine können aus L-α-Aminosäuren erhalten werden, wenn die L-α-Aminosäuren mit Kaliumcyanat umgesetzt werden und sodann die gebildeten L-N-Carbamoyl- α-aminosäuren unter sauren Bedingungen zum Ringschluß erhitzt werden.

Beispiele für 5-substituierte Hydantoine, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind zusammen mit den Namen der entsprechenden α-Aminosäuren in Tabelle I aufgeführt:

Tabelle I

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die katalytische Wirkung eines intrazellulären Enzyms in Form der Zellen oder behandelten Zellen von Mikroorganismen ausgenutzt. Das Enzym kann in der Weise hergestellt werden, daß ein Mikroorganismus in herkömmlicher Weise gezüchtet wird. Obgleich die Kultivierung gewöhnlich in einem flüssigen Medium erfolgt, kann auch eine Kultur mit fester Oberfläche angewendet werden. Im allgemeinen enthält das Kultivierungsmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die die Mikroorganismen assimilieren können, sowie anorganische Salze und andere Nährstoffe, die für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich sind. Vorzugsweise wird eine Hydantoinverbindung, wie Hydantoin, DL-5-Methylhydantoin oder DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin, zu dem Kulturmedium in einer Menge von 0,05 bis 0,3 Gew.-% gegeben, um die gewünschte Enzymaktivität zu verstärken. Die Kulturbedingungen werden im Temperaturbereich von 20 bis 85°C und im pH-Bereich von 4 bis 11 entsprechend den optimalen Wachstumsbedingungen des verwendeten Stamms ausgewählt. Gewöhnlich werden die Mikroorganismen bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 und über einen Zeitraum von 10 bis 75 h gezüchtet. Während der Kultivierung kann das Wachstum der Mikroorganismen durch Belüftung und Durchbewegung beschleunigt werden.

Die auf diese Weise gezüchteten Mikroorganismen werden in Form einer Kulturbrühe, von Zellen oder behandelten Zellen bei der asymmetrischen Hydrolyse von 5-substituierten Hydantoinen verwendet. In vielen Fällen kann die Reaktion in der Weise bewirkt werden, daß man die Kulturbrühe verwendet, welche die Zellen der Mikroorganismen so, wie sie sind, enthält. In Fällen, wo die Komponenten der Kulturbrühe die Reaktion behindern können oder wo es angestrebt wird, die Menge der Zellen zu erhöhen, werden Zellen verwendet, die von der Kulturbrühe abgetrennt worden sind. Obgleich die Ziele der Erfindung zufriedenstellend erreicht werden können, wenn man die intakten Zellen verwendet, können die Zellen aber auch in Form von getrockneten Zellen, beispielsweise von lyophilisierten Zellen und eines Acetonpulvers, wegen der einfacheren Lagerung oder Handhabung verwendet werden. Die Zellen können auch in Form von behandelten Zellen, z. B. von zerkleinerten Zellen und eines Zellextrakts, eingesetzt werden. Schließlich können diese Zellen und die behandelten Zellen auch in herkömmlicher Weise immobilisiert werden.

Das Reaktionssubstrat, d. h. das 5-substituierte Hydantoin, wird gewöhnlich mit der Kulturbrühe, den Zellen oder behandelten Zellen in einem wäßrigen Medium vermischt, damit die Enzyme katalytisch auf das Substrat einwirken.

Die Konzentration der 5-substituierten Hydantoine beträgt 0,1 bis 30 Gew.-%. Die Löslichkeit der 5-substituierten Hydantoine in Wasser ist im allgemeinen nur niedrig. In vielen Fällen liegen die 5-substituierten Hydantoine in suspendierter Form vor, was jedoch kein Hindernis für die Reaktion ist, da sich das Substrat fortschreitend in dem wäßrigen Reaktionsmedium im Verlauf der Reaktion auflöst.

Das tatsächliche Substrat für die mikrobiellen Enzyme, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind die D-Formen der 5-substituierten Hydantoine. Nur die D-Formen werden selektiv unter Umwandlung in D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren hydrolysiert. Da jedoch in dem Reaktionssystem das Razemisierungsgleichgewicht hinsichtlich der 5-substituierten Hydantoine vorliegt, werden die nicht-hydrolysierten L-Formen beim Verbrauch der D-Formen in die D-Formen umgewandelt, mit dem Ergebnis, daß die D-Formen dem Reaktionssystem immer in Substanz zugeführt werden. Die L- Formen stellen kein eigentliches Substrat dar, können aber als indirektes Substrat angesehen werden, da die Razemisierungsreaktion der 5-substituierten Hydantoine parallel zu der enzymatischen Reaktion abläuft. Als Ausgangsmaterial können daher alle DL-, D- und L-Formen der 5-substituierten Hydantoine verwendet werden.

Wenn die Hydrolysereaktion der 5-substituierten Hydantoine in einem wäßrigen Reaktionsmedium durchgeführt wird, dann wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 10 gehalten. In diesem pH-Bereich können die gewünschten Produkte in hohen Ausbeuten erhalten werden, solange Mikroorganismen mit einer hohen Aktivität verwendet werden. Wenn der pH- Wert unterhalb 7 liegt, ist die Reaktionsgeschwindigkeit sehr niedrig. Wenn andererseits der pH-Wert oberhalb 10 liegt, dann können Nebenreaktionen auftreten. Bei pH-Werten von 7 bis 10 ist die Umwandlungsgeschwindigkeit der DL- oder L-Formen der 5-substituierten Hydantoine in D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren stark vermindert, da der optimale pH-Wert für die erfindungsgemäß verwendeten mikrobiellen Enzyme in der Nähe von 8 bis 9 liegt. Die Löslichkeit des Substrats steigt mit ansteigenden pH-Werten an und die Razemisierung des Hydantoinrings wird bei alkalischen Bedingungen wirksam beschleunigt. Im Verlauf der Reaktion nimmt der pH-Wert des Reaktionsgemisches ab. Es ist daher zu bevorzugen, zu einem geeigneten Zeitpunkt ein Neutralisationsmittel, wie Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Natriumcarbonat, in das Reaktionsgemisch zu geben, um dieses beim optimalen pH-Wert zu halten. Weiterhin kann, wie es die Gelegenheit erfordert, ein organisches Lösungsmittel und ein oberflächenaktives Mittel zu dem Reaktionsmedium gegeben werden.

Die Hydrolysereaktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, die für das verwendete mikrobielle Enzym geeignet ist. Gewöhnlich wird sie bei einer Temperatur von 20 bis 85°C durchgeführt. Die Reaktionszeit variiert entsprechend der Aktivität der verwendeten Mikroorganismen und der Reaktionstemperatur. Sie liegt gewöhnlich im Bereich von 5 bis 100 h.

Die D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren, die durch die Hydrolysereaktion gebildet worden sind, werden aus dem Reaktionsgemisch durch pH-Einstellung oder Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz isoliert. Wenn beispielsweise das Produkt relativ hydrophob, wie D-N-Carbamoylmethionin und D-N-Carbamoylphenylalanin, ist, dann wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 5 eingestellt und das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert oder filtriert, um unlösliche Materialien, wie unverändertes Substrat und Zellen, zu entfernen. Sodann wird der pH-Wert der resultierenden überstehenden Flüssigkeit oder des Filtrats auf 2 bis 4 eingestellt, um das gewünschte Produkt auszufällen. Wenn das Produkt relativ hydrophil, wie D-N-Carbamoylserin und D-N-Carbamoylalanin, ist, dann wird die Isolierung oftmals in dieser Weise, wie oben, jedoch unter Schwierigkeiten durchgeführt. In diesem Falle wird das Produkt zweckmäßigerweise durch Ionenaustauscherharzbehandlungen isoliert. Die Ionenaustauscherharzbehandlung ist jedoch nicht auf diesen Fall begrenzt. Vielmehr ist sie als allgemeine Isolierungsmethode verfügbar. Das Produkt wird in der Weise adsorbiert, daß das Reaktionsgemisch, aus dem zuvor unlösliche Materialien entfernt worden sind, durch eine Säule eines basischen Anionenaustauscherharzes geleitet wird und sodann aus dem Anionenaustauscherharz mit einem Lösungsmittel, wie verdünnter Salzsäure, eluiert wird. Das Eluat wird sodann neutralisiert und bei vermindertem Druck konzentriert, wodurch Kristalle des gewünschten Produkts erhalten werden.

D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, stellen einsetzbare Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln dar. Da bekanntlich D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch Umsetzung mit salpetriger Säure leicht in D-α-Aminosäuren umgewandelt werden können, können D-α-Aminosäuren in vorteilhafter Weise in technischem Maßstab hergestellt werden, wenn man das erfindungsgemäße Verfahren mit dem bekannten Verfahren kombiniert.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann sind alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen.

Die in den Beispielen verwendeten Mikroorganismen sind bereits bekannt. Stämme, die mit IAM, IFO oder ATCC bezeichnet sind, sind Stämme, die unter den angegebenen Katalognummern bei den folgenden Hinterlegungsstellen hinterlegt sind:

IAM=Institute of Applied Microbiology, the University of Tokyo (Japan),
IFO=Institute for Fermentation, Osaka (Japan),
ATCC=American Type Culture Collection (USA).

Beispiel 1

Es wurden die folgenden flüssigen Kulturmedien (A) und (B) hergestellt. Jeweils 100-ml-Portionen davon wurden in 500-ml- Schüttelkolben eingegeben und 15 min lang bei 120°C dampfsterilisiert.

Pseudomonas striata IFO 12 996 und Aerobacter cloacae IAM 1221, die zuvor 24 h auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur bei 30°C gezüchtet worden waren, wurden getrennt in das Kulturmedium (A) inokuliert.

Es wurde bei 30°C unter Schütteln 18 h lang bei Verwendung von Pseudomonas striata IFO 12 996 und 40 h lang bei Verwendung von Aerobacter cloacae IAM 1221 gezüchtet. Die Zellen wurden von den resultierenden Kulturbrühen abzentrifugiert und mit 100 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugieren gesammelt und sodann in 50 ml 0,9%iger Kochsalzlösung suspendiert. Jede der so erhaltenen Zellsuspensionen wurde als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet.

Die in Tabelle II angegebenen 5-substituierten Hydantoine wurden als Reaktionssubstrat verwendet.

Komponenten des Gemisches:

(1) 1,0 ml einer wäßrigen Substratsuspension mit einer Konzentration von 100 mM, hergestellt durch Suspendierung von 5-substituiertem Hydantoin in einer 0,1M- NaHCO₃-Na₂CO₃-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9,5.
(2) 1,0 ml Zellsuspension.

Ein Reagensglas mit geschliffenem Stöpsel wurde mit den obigen Komponenten (1) und (2) beschickt. Sodann wurde die Reaktion 20 h bei 33°C unter mildem Schütteln durchgeführt. Unmittelbar nach Beendigung der Reaktion wurden zu dem Reaktionsgemisch 0,5 ml einer 10%igen Lösung von Trichloressigsäure, 0,5 ml einer 10%igen Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd in 6N-Salzsäure und 3,0 ml reines Wasser gegeben. Das verfärbte Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung von unlöslichen Materialien zentrifugiert und hierauf wurde die N-Carbamoyl-α-aminosäure bei 420 nm kolorimetrisch bestimmt. Diese Reaktions- und Bestimmungsmaßnahmen wurden für jeden Mikroorganismus und jedes Reaktionssubstrat wiederholt.

In Tabelle II sind die Mengen der in den Reaktionsgemischen erzeugten N-Carbamoyl-α-aminosäuren und die Umwandlungen der 5- substituierten Hydantoine zusammengestellt.

Tabelle II

Beispiel 2

Unter Verwendung der gleichen Mikroorganismen wie im Beispiel 1 wurde die Hydrolysereaktion der in Tabelle III angegebenen 5-substituierten Hydantoine in einem größeren Maßstab als im Beispiel 1 in der folgenden Weise durchgeführt:

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgte in der gleichen Weise wie im Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß 500 ml-Portionen des Kulturmediums (A) oder (B) gesondert in 2-l-Schüttelkolben gebracht wurden. Aus jeder resultierenden Kulturbrühe wurden Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 500 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugieren gesammelt und sodann in 100 ml 0,9%iger Kochsalzlösung suspendiert. Die auf diese Weise erhaltenen Zellsuspensionen wurden jeweils als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet.

Komponenten des Gemisches:

(1) 1,0 g 5-substituiertes Hydantoin.
(2) 80 ml einer 0,1M-NaHCO₃-Na₂CO₃-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9,5.
(3) 20 ml Zellsuspension.

Das Gemisch aus den obigen Komponenten (1), (2) und (3) wurde in einen 300-ml-Erlenmeyer-Kolben mit geschliffenem Stöpsel gebracht. Die Reaktion wurde bei 33°C 20 h lang unter mildem Schütteln durchgeführt. Während der Reaktion wurde das Gemisch durch Zugabe von 2N-NaOH zu geeigneter Zeit bei einem pH-Wert von 8,5 bis 9,0 gehalten.

Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und sodann zentrifugiert, um unlösliche Materialien, wie unverändertes Substrat und Zellen, zu entfernen. Die resultierende überstehende Lösung wurde lyophilisiert. Das erhaltene Pulver wurde mit Äthanol extrahiert. Nach der Zugabe von 5 g Silikagel zu dem Extrakt wurde das Äthanol abdestilliert. Der Rückstand wurde in eine Säule gepackt und zur Reinigung wurde eine Silikagel-Säulenchromatographie durchgeführt. Die Säule wurde zuerst mit Aceton und sodann mit Äthanol eluiert. Das Produkt wurde erhalten, indem das Lösungsmittel aus der Fraktion abdestilliert wurde, die die N-Carbamoyl- α-aminosäure enthielt. Wenn die Reinigung immer noch nicht ausreichend war, dann wurde die Reinigung weitergeführt, wobei ein Anionenaustauscher vom Acetattyp Amberlite® IRA-400 verwendet wurde. Nach dem Eluieren mit 1,5 bis 2M-Essigsäure wurde das Eluat lyophilisiert, wodurch ein Produkt mit höherer Reinheit erhalten wurde.

Die obigen Verfahrensmaßnahmen wurden mit allen Mikroorganismen und Substraten durchgeführt.

In Tabelle III sind die erhaltenen Mengen, Schmelzpunkte und die spezifische Drehung der erhaltenen N-Carbamoyl-α-aminosäuren zusammengestellt.

Die Ergebnisse der Elementaranalyse und des Infrarotspektrums der Produkte stehen mit den theoretischen Werten im Einklang. Aus den Ergebnissen der Dünnschicht-Silikagelchromatogramme (Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/Wasser=4 : 1 : 1) wurde bestätigt, daß die Reinheit hoch war. Aus den Werten der spezifischen Drehung ergab sich, daß alle Produkte die D-Form hatten.

Tabelle III

Beispiel 3

Die in Tabelle IV angegebenen Mikroorganismen wurden auf Bouillon- Agar-Schrägkulturen inokuliert und 24 h lang bei 33°C gezüchtet.

Es wurde ein flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0, das die folgenden Komponenten enthielt, hergestellt. 10-ml-Portionen davon wurden in Reagensgläschen gebracht und 10 min lang bei 120°C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums
Fleischextrakt
0,5%
Hefeextrakt	0,5%
Pepton	1,0%
Hydantoin	0,1%
NaCl	0,15%

Die einzelnen Mikroorganismen, die auf den Bouillon-Agar- Schrägkulturen gezüchtet worden waren, wurden mit einer Platinschleife in das flüssige Medium jedes Reagensglases hineinokuliert. Nach 24stündigem Züchten bei 33°C unter Schütteln wurden die Zellen von der resultierenden Kulturbrühe abzentrifugiert und mit 10 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugieren gesammelt und sodann in 3,3 ml 0,9%iger Kochsalzlösung suspendiert. Jede der so erhaltenen Suspensionen wurde als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet.

Komponenten des Gemisches:

(1) 3,3 ml einer wäßrigen Substratsuspension mit einem pH- Wert von 7,6, die 3,0% DL-5-(Methylhioäthyl)-hydantoin enthielt.
(2) 3,3 ml 0,2M-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,6.
(3) 3,3 ml Zellsuspension.

Ein Reagensglas wurde mit den obigen Komponenten (1), (2) und (3) beschickt und die Reaktion wurde unter mildem Schütteln 40 h lang bei 33°C durchgeführt. Nach beendigter Reaktion wurden 2,0 ml des Reaktionsgemisches abgenommen und das N-Carbamoylmethionin wurde wie im Beispiel 1 kolorimetrisch bestimmt. Die gleiche Verfahrensweise wurde für jeden Mikroorganismus wiederholt.

In Tabelle IV sind die Mengen des in den Reaktionsgemischen erzeugten N-Carbamoylmethionins und die Umwandlungen von DL-5- (2-Methylthioäthyl)-hydantoin zusammengestellt.

Tabelle IV

Beispiel 4

Die Hydrolyse von DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin wurde unter Verwendung der in Tabelle V angegebenen Mikroorganismen durchgeführt.

Es wurde das folgende flüssige Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,0 hergestellt. 300-ml-Portionen davon wurden gesondert in 2-l-Schüttelkolben gebracht und 10 min bei 120°C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums
Fleischextrakt
1,0%
Hefeextrakt	0,5%
Pepton	1,0%
DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin	0,3%
NaCl	0,3%

Jeder Mikroorganismus, der zuvor auf einer Bouillon-Agar- Schrägkultur 24 h bei 33°C gezüchtet worden war, wurde in das flüssige Kulturmedium in Schüttelkolben hineinokuliert. Es wurde 22 h bei 33°C unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden von der resultierenden Kulturbrühe abzentrifugiert und mit 150 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugierung gesammelt und sodann in 50 ml einer 0,9%igen Kochsalzlösung suspendiert. Die so erhaltenen Zellsuspensionen wurden als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet.

Komponenten des Gemisches:

(1) 33 ml einer wäßrigen Substratsuspension mit einem pH- Wert von 7,6, enthaltend 3,0% DL-5-(2-Methylthioäthyl)- hydantoin.
(2) 33 ml einer 0,2M-Phosphatpufferlösung mit einem pH- Wert von 7,6.
(3) 33 ml Zellsuspension.

Das Gemisch aus den obigen Komponenten (1), (2) und (3) wurde in einen 300-ml-Erlenmeyer-Kolben mit geschliffenem Stöpsel eingebracht und die Reaktion wurde 64 h lang bei 33°C unter mildem Schütteln durchgeführt.

Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und sodann zentrifugiert, um unlösliche Materialien, wie unverändertes Substrat und Zellen, zu entfernen. Die resultierende überstehende Lösung wurde lyophilisiert und das erhaltene Pulver wurde mit Äthanol extrahiert. Nach der Zugabe von 5 g Silikagel zu dem Extrakt wurde das Äthanol abdestilliert. Der Rückstand wurde in eine Säule gepackt und zur Reinigung wurde sodann eine Silikagel-Säulenchromatographie durchgeführt. Die Säule wurde zuerst mit Aceton und sodann mit Methanol eluiert. Die N-Carbamoylmethionin enthaltende Fraktion wurde abgenommen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert, wodurch ein Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde sodann aus einem Äthanol/Wasser-Lösungsmittel umkristallisiert, wodurch N-Carbamoylmethionin mit hoher Reinheit erhalten wurde.

Die obigen Reaktions- und Reinigungsmaßnahmen wurden für jeden Mikroorganismus wiederholt.

In Tabelle V sind die Ergebnisse hinsichtlich der Menge, der Schmelzpunkte und der spezifischen Drehung des erhaltenen N- Carbamoylmethionins zusammengestellt.

Aufgrund der Ergebnisse der Bestimmung der spezifischen Drehung wurde bestätigt, daß das gesamte N-Carbamoylmethionin in D-Form vorlag.

Auch die Ergebnisse der Elementaranalyse und des Infrarotspektrums des Produkts standen mit den theoretischen Werten im Einklang. Aus den Ergebnissen der Silikagel-Dünnschichtchromatographien (Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/Wasser=4 : 1 : 1) wurde auch bestätigt, daß die Reinheit hoch war.

Tabelle V

Beispiel 5

Ein flüssiges Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,0, das die folgenden Komponenten enthielt, wurde hergestellt. 10-ml-Teile davon wurden in Reagensgläser gebracht und 10 min lang bei 120°C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums
Glukose
2,0%
Sojabohnenmehl	1,0%
Hefeextrakt	0,25%
(NH₄)₂SO₄	0,1%
CaCO₃	0,5%
K₂HPO₄	0,4%
DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin	0,3%

Die in Tabelle VI angegebenen Mikroorganismen wurden auf Bouillon- Agar-Schrägkulturen von Kulturkollektionen inokuliert und zunächst 70 h bei 30°C gezüchtet. Die erhaltenen Zellen wurden in die flüssigen Kulturmedien in den Reagensgläsern mit einer Platinschleife hineinokuliert. Nach 72stündigem Züchten bei 30°C unter Schütteln wurden die erhaltenen Kulturbrühen in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 behandelt, wodurch Zellsuspensionen erhalten wurden. Unter Verwendung der so erhaltenen Zellsuspensionen wurde die Hydrolyse von DL-5-(2-Methylthioäthyl)- hydantoin bei 33°C 40 h lang in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 durchgeführt. Die Mengen des in dem Reaktionsgemisch erzeugten N-Carbamoylmethionins und die Umwandlungen von DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin wurden in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Die Umsetzung wurde sodann im größeren Maßstab unter Verwendung von Streptomyces alumquisti ATCC 618 in der folgenden Weise durchgeführt:

Jede Brühe des Mikroorganismus, die zuvor in 10 ml des obengenannten flüssigen Kulturmediums gezüchtet worden war, wurde mit jeweils 90 ml des gleichen Kulturmediums vermischt, worauf die Züchtung durchgeführt wurde. Nach der Abtrennung der Zellen von den resultierenden Kulturbrühen und dem Waschen mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung wurden die Zellen in 33 ml 0,9%iger Kochsalzlösung suspendiert, wodurch Zellsuspensionen erhalten wurden, die als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet wurden.

Komponenten des Gemisches:

(1) 33 ml einer wäßrigen Substratsuspension mit einem pH- Wert von 7,6, enthaltend 3,0% DL-5-(2-Methylthioäthyl)- hydantoin.
(2) 33 ml 0,2M-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,6.
(3) 33 ml Zellsuspension.

Ein 300-ml-Erlenmeyer-Kolben mit geschliffenem Stöpsel wurde mit den obigen Komponenten (1), (2) und (3) beschickt, worauf die Umsetzung 40 h bei 33°C unter mildem Schütteln durchgeführt wurde. Nach beendigter Umsetzung wurden Kristalle mit hoher Reinheit durch Behandlung des Reaktionsgefäßes gemäß Beispiel 4 erhalten.

Die Ergebnisse der Bestimmung der Menge und der spezifischen Drehung des erhaltenen N-Carbamoylmethionins sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Aus den Ergebnissen der spezifischen Drehung wurde bestätigt, daß das Produkt in der D-Form vorlag. Weiterhin standen die Ergebnisse der Elementaranalyse und des Infrarotspektrums mit den theoretischen Werten im Einklang. Es wurde auch aus den Ergebnissen der Silikagel-Dünnschichtchromatographie (Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/Wasser=4 : 1 : 1) bestätigt, daß die Reinheit hoch war.

Tabelle VII

Beispiel 6

Ein flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,6, enthaltend die folgenden Komponenten, wurde hergestellt. 10-ml-Portionen davon wurden in Reagensgläschen gegeben und 10 min lang bei 120°C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums
Saccharose
10,0%
Hefeextrakt	0,2%
(NH₄)₂HPO₄	0,2%
KH₂PO₄	0,1%
MgSO₄ · 7 H₂O	0,1%
CaCO₃	0,2%
DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin	0,2%

Die einzelnen Mikroorganismen, die in Tabelle VIII angegeben sind, welche zuvor 24 h auf einer Malz-Agar-Schrägkultur bei 30°C gezüchtet worden waren, wurden in jedes Kulturmedium mit einer Platinschleife hineinokuliert. Es wurde unter Schütteln 40 h lang bei 30°C gezüchtet. Die Zellen wurden von der resultierenden Kulturbrühe abzentrifugiert und sodann wie im Beispiel 3 behandelt, wodurch Zellsuspensionen erhalten wurden.

Unter Verwendung der so hergestellten Zellsuspensionen wurde die Hydrolyse von DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin 40 h lang bei 33°C durchgeführt. Sodann wurde wie im Beispiel 3 die Analyse durchgeführt.

Die Mengen des in dem Reaktionsgemisch erzeugten N-Carbamoylmethionins und die Umwandlungen des DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoins sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

Tabelle VIII

Beispiel 7

Ein flüssiges Medium, das die folgenden Komponenten enthielt, wurde hergestellt. 10-ml-Portionen davon wurden in große Reagensgläser gegeben.

Komponenten des Mediums
Fleischextrakt
0,5%
Hefeextrakt	0,5%
KH₂PO₄	0,2%
MgSO₄ · H₂O	0,1%
CaCl₂ · 2 H₂O	40 ppm

Hydantoin, DL-5-Methylhydantoin und DL-5-(2-Methylthioäthyl)- hydantoin wurden gesondert in jedes Reagensglas in einer Menge von 20 mg (Konzentration: 0,2%) gegeben. Nach Einstellung des pH-Werts auf 7,0 wurden die einzelnen Kulturmedien 15 min bei 120°C dampfsterilisiert. Pseudomonas striata IFO 12 996 wurde mit einer Platinschleife hineinokuliert. Die Züchtung erfolgte sodann unter Schütteln 16 h lang bei 30°C. Die Zellen wurden von den resultierenden Kulturbrühen abzentrifugiert und mit 10 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugieren gesammelt und sodann in 10 ml 0,9%iger Kochsalzlösung suspendiert, wodurch eine Zellsuspension erhalten wurde. Die gleiche Arbeitsweise wurde für jede Hydantoinverbindung wiederholt.

Gemische aus (1) 2,0 ml einer wäßrigen Substratlösung, hergestellt durch Auflösen von DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin in 0,1M-NH₄Cl-NH₄OH-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9,5 (Substratkonzentration: 2,0%), und (2) 2,0 ml der obigen Zellsuspension wurden hergestellt und in Reagensgläser gebracht. Sodann wurde die Hydrolysereaktion bei 30°C 1 h lang unter Schütteln durchgeführt. Unmittelbar nach Beendigung der Umsetzung wurden 1,0 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von Trichloressigsäure, 1,0 ml einer 10%igen Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd in 6N-Salzsäure und 6,0 ml destilliertes Wasser zu jedem Reaktionsgemisch gegeben. Die verfärbten Reaktionsgemische wurden zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu entfernen. Die Mengen des erzeugten N-Carbamoylmethionins in den Reaktionsgemischen wurden kolorimetrisch durch Messung der Absorption bei 420 nm bestimmt. Als Kontrollversuch wurden die obigen Maßnahmen wiederholt, mit der Ausnahme, daß keine Hydantoinverbindung verwendet wurde.

Die Tabelle IX zeigt die Mengen des in den Reaktionsgemischen erzeugten N-Carbamoylmethionins und die Mengen des pro Trockengewicht (mg) Zellen erzeugten N-Carbamoylmethionins.

Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, daß zu dem Kulturmedium zugesetzte Hydantoinverbindungen die Fähigkeit der Mikroorganismen zur asymmetrischen Hydrolyse erhöhten.

Tabelle IX

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren der allgemeinen Formel: worin R eine C_1-4-Alkylgruppe, Hydroxy-C_1-4-alkylgruppe, Methylthio- C_1-4-alkylgruppe, Amino-C_1-4-alkylgruppe, Carboxy-C_1-4-alkylgruppe oder Benzylgruppe ist, dadurch gekennzeichnet, daß man 5-substituierte Hydantoine mit der allgemeinen Formel: worin R die oben angegebene Bedeutung hat, der Einwirkung einer Kulturbrühe, von Zellen oder behandelten Zellen eines der folgenden Mikroorganismen unterwirft:
Aerobacter cloacae IAM 1221, Agrobacterium rhizogenes IFO 13 259, Bacillus sphaericus IFO 3525, Brevibacterium incertum IFO 12 145, Candida macedoniensis IFO 0706, Micrococcus roseus IFO 3764, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Nocardia corallina IFO 3338, Proteus morganii IFO 3848, Pseudomonas striata IFO 12 996, Serratia plymuthicum IFO 3055, Steptomyces alumquisti ATCC 618, Steptomyces flaveolus IFO 3408 oder Xanthomonas campestris IAM 1671.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen solchen verwendet, der in einem Kulturmedium gezüchtet worden ist, welches eine Hydantoinverbindung zur Erhöhung der Fähigkeit zur asymmetrischen Hydrolyse des Hydantoinrings enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die 5-substituierten Hydantoine in der DL-Form eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die 5-substituierten Hydantoine in der L-Form eingesetzt werden.