DE2318650C2 - Fermentative Herstellung von Deacetylcephalosporin C - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur feriiicruaiiven Herstellung von Deacetylcephalosporin C (nachstehend auch als DCPC bezeichnet).

Die von DCPC abgeleiteten Cephalosporinverbindungen, z. B. Cephalothin und Cephaloridin, sind klinisch hochgeschätzt als Antibiotika, die gegen Infektionen mit grampositiven oder graninegativcn Bakterien, insbesondere gegen Krankheiten wirksam sind, die von Bakterien, die Resistenz gegen verschiedene Antibiotika erworben haben, verursacht werden. Deacetylcephalosporin C ist sehr wichtig als Ausgangsmaterial für die Synthese solcher Cephalosporinverbindungen. Neue Cephalosporinderivate, z. B. 3-Formylcephalosporinderivate wie 3-Formyl-7-phenylacetylamido-ceph-2-em-4-carbonsäure und 3-Formyl-7-phenyla\.-etylamido-ceph-3-em-4-carbonsäure leiten sich ebenfalls von DCPC ab. Ferner ist das DCPC wertvoll als Ausgangsmaterial in der Synthese von 3-Chloracetoxymetbyl-cephalosporinderivaten oder 3-Methoxymethylcephalosporin C. Mit der Ausnutzung von DCPC als Ausgangsmaterial für die Synthese der verschiedensten 3-substituierten Cephalosporinverbindungen ist somit mehr denn je zu rechnen.

Bisher wurde DCPC durch enzymatische Deacetylierung von Cephalosporin C (nachstehend auch als CPC bezeichnet) hergestellt, das durch Fermentation beispielsweise unter Verwendung von Cephalosporium acremonium CM1-49 137 oder seines Mutanten ATCC-14 533 hergestellt wird. Die enzymatische Deacetylierung wird durch Behandlung von CPC mit einem Enzym durchgeführt, das durch einen Mikroorganismus, der beispielsweise zur Gattung Streptomyces oder Bacillus gehört, gebildet wird (beschrieben in der US-Patentschrift 33 04 236). Diese Verfahren haben jedoch bei der großtechnischen Durchführung den Nachteil, daß zwei Fermentationsslufen, nämlich die Herstellung von CPC und die Deacetylierung des hierbei gebildeten CPC, notwendig sind.

Es wjrde zwar berichtet, daß eine Spurenmenge von DCPC in dem bei der CPC-Fermentation erhaltenen Kulturmedium gefunden wird, jedoch ist klar zu stellen, daß das DCPC durch nicht-enzymaiische Hydrolyse von CPC gebildet wird (F. M. Huber und Mitarbeiter, Applied Microbiology 16 (1968), ΙΟΙ I-1014). Um DCPC direkt in großer Menge herzustellen, ist es somit notwendig, das Problem von einer von dem bekannten Verfahren völlig verschiedenen Konzeption aus anzugehen.

Der Gegenstand der Erfindung ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme bilden im wesentlichen kein CPC oder nur eine geringe Menge

IFO 9S37¹

CPC, die aus dem Endprodukt, d. h. DCPC, ohne ein spezielles Trennverfahren entfernbar ist.

Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme wurden beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, unter der Zugangsnummer IFO-9537 bzw. bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, unter den Nummern ATCC-20 370 und ATCC-20 371 hinterlegt.

Cephalosporium spjhat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften: -r~

I. Eigenschaften auf Agar-Medier.
1. Malzextrakt-Agar

schlechtes Wachstum, Oberfläche unregelmäßig faltig, farblos bis hellbraun. Rückseite der Kolonie ist farblos bis hellbraun. Luftmycel spärlich. Lösliches Pigment wird ι iicht gebildet.

2. Kartoffel-Glucose-Agar

schlechtes Wachstum, begrenzt und erhaben, farblos bis hellbraun. Rückseite ist farblos bis hellbraun. Spärliches Luftmycel. Kein lösliches Pigment.

3. Hafermehl-Agar

Wachstum mäßig, diffus, farblos. Rückseite ist farblos. Luftmycel spärlich. Keine Bildung von löslichem Pigment.

4. Glucose-Bouillon-Agar

mäßiges Wachstum, diffus, farblos bis hellbraun. Rückseite ist farblos bis hellbraun. Luftmycel spärlich. Kein lösliches Pigment.

II. Mikroskopische Merkmale

Lufthyphen 1,5 bis 3,0 μ breit, verzweigt und glasklar. Konidiophoren richten sich von Lufthyphen oder vegetativen Hyphen im rechten Winkel auf, 30 bis 70 μ lang und 1,5 bis 2,0 μ breit. Eine Masse von Konidien von 8 bis !4 μ Durchmesser bildet sich an der Spitze. Die Konidien sind elliptisch, an jedem Ende etwas spitz, einzellig, glasklar, 2 bis 3 μ mal 8 bis 13 μ.

Auf Malzextrakt-Agar, Kartoffel-Glucose-Agar und Hafermehl-Agar ist nur reduzierte Konidienbildung festzustellen. Auf Glucose-Bouillon-Agar ist die Entwicklung von Konidien reichlich.

Cephalosporium acremonium ATCC 20 371 hat die gleichen mikrobiologischen Merkmale wie Cephalosporium acremonium ATCC 14 553.
Der Mikroorganismus kann auf einem festen oder

so einem flüssigen Medium gezüchtet werden. Für die Großherstellung ist die Verwendung eines flüssigen Mediums zu empfehlen. Bei Verwendung des flüssigen Mediums kann die Kultivierung unter aeroben Bedingungen unter Schütteln oder Rühren durchgeführt werden.

Das Nährmedium enthält Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff, anorganische Salze und Stimulationsfaktoren. Dabei eignen sich beliebige Kohlenstoffquellen, z. B. Glucose, Saccharose, Stärke, lösliche Stärke, Endmelasse, n-Paraffine, Essigsäure, Äthanol, Glycerin und Sorbit.

AK Stickstoffqucllcn eignen sich beispielsweise Naturprodukte oder ihre verarbeiteten Materialien (z. B. Pepton, Fleischextrakt, Kasein, Maisquellwasser, entfettetes Sojabohnenmehl, Trockenhefe, Hefeextraki, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Reiskleie und Weizenkleie), Ammoniumsalze von organischen Säuren (z. B. Ammoniunisuccinat, Ammoniumtartrat und Am-

moniumaeetat), anorganische Stickstoffverbindungen (ζ. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat) und organische Stickstoffverbindungen (z. B. Harnstoff

Als anorganische Salze können beispielsweise Metallsalze wie Sulphate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate von Kalium, Magnesium und Calcium verwendet werden.

Als Stimulationsfaktoren eignen sich beispielsweise Methionin, Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyloleat und SpecköL Von diesen Faktoren fördert Methionin hervorragend das Bildungsvermögen für DCPC

Die Methioninmenge im Nährmedium beträgt vorzugsweise 0,05 bis 3,0%, insbesondere 0,1 bis 2,0% (Gew/Vol.). Das Methionin ist sowohl in der D-Form als auch in der L-Form für die Produktion von DCPC wirksam.

Die Kultivierungsbedingungen, z. B. die Temperatur, der pH-Wert des Mediums und die Kultivic.-ur.gsdauer, werden in geeigneter Weise so gewählt, daß der verwendete Mikroorganismus DCPC maximal anhäufen kann. Die Kultivierung wird bei einer Temperatur von 15° C bis 45° C, zweckmäßig 18° C bis 38° C, und bei einem pH-Wert von 2 bis 10, zweckmäßig von 4 bis 9, für eine Zeit von 10 bis 360 Stunden, zweckmäßig 96 bis 240 Stunden, durchgeführt.

Die Abtrennung von DCPC vom Kulturmedium erfolgt nach üblichen Methoden, z. B. durch Filtration des Kulturmediums, Waschen der Zellen mit Wasser und Isolierung von DCPC vom Gemisch des Filtrats mit der Waschflüssigkeit. Zur Reinigung des angehäuften DCPC von der das DCPC enthaltenden Flüssigkeit können beliebige bekannte Methoden angewandt werden. Geeignet sind beispielsweise cite Chromatographie an Harzen oder Aktivkohle und die Gelfiltration.

Beispielswp'^e wird Penicillinase zum ^-. iltrat gegeben, um das Cep .osporin N zu zersetzen. Das Filtrat wird auf eine Säule eines schwach-basischen lonenaustauscherharzes aufgegeben, an dem DCPC adsorbiert wird. Das adsorbierte DCPC wird mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. einer Ammoniumacetatpufferlösung, eluiert, und die das DCPC enthaltende Fraktion wird aufgefangen. Die DCPC-Fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt und zur Adsorption des DCPC auf eine Aktivkohlensäule aufgegeben. Nach einer Wäsche mit Wasser wird DCPC mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. einem Gemisch von Aceton und Wasser im Volumen verhältnis von 1:1, eluiert. Die DCPC-enthaltende Fraktion wird aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton im Überschuß zugesetzt wird. Auf diese Weise wird ein rohes Pulver von DCPC erhalten.

Gegebenenfalls können einige Stufen dieses Verfahrens wiederholt werden. Abschließend wird NaOH-Lösung der Fraktion zur Neutralisation zugesetzt. Dann wird Äthanol zugegeben, wodurch das Natriumsalz von DCPC in Kristallform abgetrennt werden kann.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Hierin verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu ml. Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen (g/100 ml), falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

In einem Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen werden 500 Raumteile eines Impfkiilturmediums gegossen, das 3,0% Saccharose, 1,5% Fleischextrakt, 0,f.% Maisquellwasser und 0,15% CaCO] enthält. Nach der Sterilisation wird das Medium mit Cephalosporium sp. IFO 9537 beimpft. Das beimpfte Medium wird 72 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet.

In einem Fermentationsiank mit einem Fassungsvermögen von 50 000 Raumteilen werden 30 000 eines Fermentationsmediums gegossen, das 3,0% Saccharose, 3,2% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% DL-Methionin und ίο 0,15% CaCOi enthält. Das Medium wird dann sterilisiert und gekühlt. Es wird aseptisch mit der obengenannten Impfkultur geimpft und bei 28°C unter Rühren und Belüften (100% V/V Luft pro Minute; 200 UpM) bebrütet. Nach 132 Stunden wird das Kulturmedium filtriert. Hierbei werden 26 000 Raumteile Filtrat erhc'.ten. Der Gehalt an CPC und DCPC im Filtrat wird nach dem folgenden Prinzip und nach der folgenden Methode bestimmt:

Wenn CPC und DCPC der Elektrophase unter den

Μ oben beschriebenen Bedingungen unterworfen werden, wandern sie etwa 15 cm bzw. 17 cm zur Anode. Nach der Elektrophorese werden die CPC- und DCPC-Zonen des Filterpapiers ausgeschnitten und getrennt mit Wasser extrahiert Die Extrakte werden dann auf Extinktionen bei 260 πιμ untersucht Aus den hierbei ermittelten Extinktionen wird festgestellt, daß das Filtrat 1900μgDCPC/ml und keine Spur von CPC enthält

Zu 26 000 Raumteilen des vorstehend genannten Filtrats wird Penicillinase gegeben, um Cephalosporin N vollständig zu zersetzen. Unmittelbar anschließend wird das Filtrat auf eine Säule des lonenaustauscherharzes »Amberiite IRA-900« (Acetatform) aufgegeben, an der das DCPC adsorbiert wird.
Das adsorbierte DCPC wird mit Ammoniumacetatpuffer (pH 5,0; 02 molar) eluiert. Die das DCPC enthaltende Fraktion wird aufgefangen. Sie wird unter vermindertem Druck auf 13 000 Raumteile eingeengt. Das Konzentrat wird mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 1,0/Stunde durch eine Säule geleitet, die mit 1800 Raumteilen chromatographischer Kohle gefüllt ist (hergestellt durch Verkohlung von Sägemehl und anschließende Aktivierung mit Wasserdampf; Korngröße etwa 0,42 mm, Oberfläche 146OmVg). Die ■♦5 Säule wird mit Wasser gewaschen, worauf das adsorbierte DCPC mit 900 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert wird. Die DCPC-Fraktionen werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton im Überschuß zugesetzt wird. Hierbei wird rohes pulverförmiges ')CPC erhalten. Das rohe Pulver wird in Wasser gelöst, am lonenaustauscherharz Dowex 1 · 2 (Acetatform) adsorbiert und mit 1000 Raumteilen des obengenannten Ammoniumacetatpuffers eluiert. Das Eluat wird in der gleichen Weise wie bei der vorstehend beschriebenen Behandlung durch eine Säule geleitet.

Die DCPC-Fraktionen werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Neutralisation des Konzentrats mit NaOH-Lösung wird Äthanol in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Konzentration 70 VoL-% beträgt, wobei das Natriumsalz von DCPC in Kristallform ausgefällt wird.

Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet, wobei 13,0 g Kristalle von DCPC erhalten werden. Das kristalline Produkt wird weiter umkristallisiert und das umkristallisierte Produkt mit einer DCPC-Probe verglichen, die durch enzymatische Umwandlung von CPC erhalten worden ist.

IO

Die erfindungsgemäO hergestellten Kristalle stimmen im aniiüakteriellen Spektrum, Papierchromaiogramm, DünnschichtL-hromaiogramm, UV-Spekirum, Infrarotspektrum, kernmagnetischen Resonanzspeklrum usw. mit der authentischen Probe völlig überein. Die Elementaranalyse des Produkts (C 36,9, H 5,6, N 9,3, S 7 0\ ist ebenfalls in gui?r Übereinstimmung mit ücn Werten, die in Biuchem. J. 81,591,1961 beschrieben sind.

Beispiel 2

In einen Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumteilen werden 30 Raumteile eines Impfkulturmediums gegossen, das 3,0% Saccharose, 1.5% Fleischextrakt, 0,5% Maisquellwasser und 0,15% CaCOj enthält und nach der Sterilisation mit Cephalosporium acremonium ATCC 20 371 beimptt wird. Der geimpfte Fermenter wird 72 Stunden bei 28°C unter Rühren bebrütet.

In einem Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumteilen werden 20 Raumteile eines Fermentationsmediums gegossen, das 3,0% Saccharose, 3.2% rohes Sojabonnenmehi, 0,5% DL-Methionin und 0,15% CaCOj enthäii. Das Medium wirri dann in üblicher Weise sterilisiert und gekühlt. Die obengenannte Impfkultur wird aseptisch in den Fermtrner überführt, -,vorauf die Kultivierung 144 Stunden bei 28T voi genommen wird. Das Kulturmedium wird füHert und das Filtrat nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode untersucht. Hierbei wird festgestellt, daß das Filtrat 1300 μg DCPC/ml und keine Spur von CPC enthält.

Die Kultivierung wird mit.Cephalosphorium sp. IFO 9537 und Cephaiosporium acremcniuin ATCC 20 371 in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch die Methioninmenge verändert wird. Die erhaltenen Kulturmedien werden filtriert und die Filtrate der in Beispiel I beschriebenen Bestimmung unterworfen. Die Beziehung zwischen der verwendeten Methioninmenge und der gebildeten Menge an Deacetylcephalosporin C ergibt sich aus den Werten in der folgenden Tabelle. Wie diese Werte zeigen, steigert DL-Methionin die Produktion von DCPC erheblich.

Dl^Methionin im Kultur	Cephaiosporium	Cephaiosporium acremonium
medium, g/100 ml	sp. IFO 9537	ATCC 20371
0	unter 100//g/ml	unter 100//g/ml
0,05	450//g/ml	250//g/ml
0,1	1100//g/ml	600 //g/ml
0,2	1550//g/ml	1000//g/ml
0,5	1800//g/ml	1250 //g/ml
1,0	1450/zg/mI	850//g/ml
2,0	1000//g/ml	700//g/ml
3,0	700//g/ml	450 ug/ml

Claims (2)

Palentansprüche:

1. Verfahren zur fermentaliven Herstellung von Deacety lcephalosporing C, dadurch gekennzeichnet, daß man Cephalosporium sp. IFO 9537 oder Cephalosporium acremonium ATCC-20 371 in einem Nährmedium züchtet und das Deacetylcephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium einsetzt, das 0,05 bis 3,0 g Methionin pro 100 ml enthält