DE2044513C

DE2044513C - Verfahren zur Herstellung von alkalischer Amylase

Info

Publication number: DE2044513C
Application number: DE19702044513
Authority: DE
Inventors: Koki Truma Ikeda Yonosuke Shishido Yoshiko Yamamoto Masaki Tokio Horikoshi, (Japan)
Original assignee: Rikagaku Kenkyusho, Kitaadachi, Saitama (Japan)
Priority date: 1969-09-10
Filing date: 1970-09-08
Publication date: 1973-04-19

Description

Bacillus Bacillus

g
g

20

5
10 g

0,2 g
20 g

lösliche Stärke,
K₂HPO₄,
Hefeextrakt,
Pepton,

MgSO₄-7 H₂O,
Agar-Agar und '

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von alkalischer Ajnylase.

Zur Herstellung von Amylase, ainem stärkeabbauenden Enzym mit einem optimalen pH-Wert im sauren oder neutralen Bereich, sind verschiedene Verfahren bekannt. Es ist in de>- Literatur aber noch kein Verfahren zur Herstellung \on alkalischer Amylase mit Hilfe eines Mikroorganismus beschrieben worden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein derartiges Verfahren zur Verfügung zu stellen. Die Lösung der gestellten Aufgabe besieht nun bei einem Verfahren zur Herstellung von alkalischer Amylase darin. daß man erfindungsgemäß Bacillus VTCC 21591, Bacillus ATCC 21592,
ATCC 21593, Bacillus ATCC 21594,
ATCC 21 595 ode- Bacillus ATCC 21 596 in einem für die Züchtung von Bacillus-Stämmen üblichen carbonathaltigen und alkalischen N³hrmedium bei hierfür üblichen Temperaturen aerob züchtet.

Das erfindungsgemäße Verfahren schafft eine neuartige alkalische Amylase, die ein Enzym mit einem unter Anwendung des Gelfiltrationsverfahrens geschätzten Molekulargewicht von etwa 30000 bis 40000 ist und einen optimalen pH-Wert von 10 bis 11 hat und auch in Anwesenheit von Detergentien enzymatisch aktiv ist.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen zeigen unter den nachstehend beschriebenen Züchtungsbedingungen ein gutes Wachstum unter Herstellung von alkalischer Amylase. Sie wurden von den Erfindern der vorliegenden Erfindung entdeckt.

Jeder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stamm wurde aus dem Erdboden isoliert, der in dem Bezirk Yamato der Stadt Kitaadachi (Präfektur Saitama, Japan) gewonnen wurde.

Die Isolierung der genannten Stämme wurde in der nachstehend angegebenen Weise durchgeführt.

Der Erdboden wurde in sterilisiertem Wasser suspendiert und die Suspension auf dem Nährmedium, aas in der iuigcnucii vv'cisc eiimiicii wurde, gezücnici.

Das Medium A, bestehend aus

900 ml Wasser
und das Medium B, bestehend aus

i 10 g Na₂CO₃ und
J , 100 ml Wasser,

•wurden nach der Sterilisation bei 115° C während eines Zeitraums von 15 Minuten gemischt.

' Die Platte wurde 24 bis 48 Stunden bei 115° C bebrütet.

Von den auf der Plattenkultur befindlichen Kolonien wurde eine Kolonie eines Mikroorganismus isoliert, der die genannte alkalische Amylase erzeugte.

Dieser Mikroorganismus wurde als Bacillus A-40 bezeichnet. In derselben Weise wurden der Bacillus A-59. der Bacillus 27-1. der Bacillus 124-1. der Bacillus !35 und der Bacillus 169 isoliert.

Die Bazillen A-40, A-59, 27-1, 124-1, 135 und 169 sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter den Nummern 21592, 21591. 21596. 21593. 21595 bzw. 21594 deponiert und dort ohne Einschränkung öffentlich zugänglich. Diese Stämme sind seit dem 19. August 1970 für die Abgabe an die Öffentlichkeit freigegeben.

Die genannten Bazillen haben folgende Eigenschaften. Die mikrobiologischen Eigenschaften wurden nach den Verfahren geprüft, die in »Aerobic Spore-forming Bacteria« von Nathan R. Smith, R. E. Gordon und F. E. Clark (Unites States Department of Agriculture, November 1952) und in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (1957) beschrieben worden sind.

An Hand der Zeichnungen werden die Eigenschaften und Kennwerte dieser Mikroorganismen beschrieben.

F i g. 1 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des erfindungsgemäß verwendeten Bacillus ATCC 21 592;

F i g. 2 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des erfindungsgemäß verwendeten Bacillus ATCC 21591;

F i g. 3 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnähme des erfindungsgemäß verwendeten Bacillus ATCC 21596;

F i g. 4 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme aes erfindungsgemäß verwendeten Bacillus ATCC 21 593;

F i g. 5 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des erfindungsgemäß verwendeten Bacillus ATCC 21 595:

F i g. 6 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des erfindungsgemäß verwendeten Bacillus ATCC 21 594.

Bacillus ATCC 21592
(a) Wachstum

_KIau ,;	oH-Wert im Nährmedium	*10.:)**
	7	gering
1. Bouillon	sehr gering	gering
2. Bouillon und Agar-Agar	sehr gering	stark
3. Glucose und Bouillon ..	sehr gering
4. Glucose und Bouillon,		stark
⁶⁰ Agar-Agar	sehr gering	gut,
5. Gelatine-Nährboden	—	unter Ver
		flüssigung
		merklich
65 6. Pepton und Wasser	—	gut
7. Kartoffel-Nährboden ...	sehr gering

*) Nach Zusatz von I % Na₂CO₃.

Die Abmessungen des Mikroorganismus betragen 0,5 bis 0,6 χ 2,0 bis 2,5 μΐη. Das Sporangium ist leicht gequollen und die Spore oval, 0,9 bis 1,0 x 1,1 bis 1,5 μηχ

Der Mikroorganismus hat pertrichöse Geißeln, die in F i g. 1 erkennbar sind. Der genannte Bacillus wächst auf dem nachstehend beschriebenen Nährmedium (Stärke, Hefeextrakt, Pepton, K₂HPO₄, MgSO₄-7H₂O und Na₂CO₃, auf einen pH-Wert von 10,2 eingestellt) sehr gut ir Form einer gelben Kolonie. Dieser Bacillus zeichnet sich dadurch aus, daß er nicht auf einem neutralen, so. ■'-rn auf einem alkalischen Nährmedium gut wächsi

(b) Physiologische Eisre.: ::baften
1. Optimale Wachstumsbec-ufouigen:

pH-Wert 8 bis 10, T-,: i. cratur 37 bis 40°C, Vorhandensein von Luftsauerstoff.

2. Bedingungen, unter denen das Bakterium wachsen kann:

pH-Wert 7,5 bis 11, Temperatur bis zu 45° C, Vorhandensein von Luftsauerstoff.

Mit Hilfe des 1% Na₂CO₃ enthaltenden Nährmediums wurden folgende Bestimmungen durchgeführt:

3. Gramfärbbarkeit positiv

4. Voges-Proskauer-Reaktion positiv

5. Nitrat wird reduziert.

6. Katalase positiv

7. Hydrolyse von Gelatine und Casein positiv

8. Hydrolyse von Stärke · positiv

9. Verwertung von Citrat .... geringe Auswertung

10. Verwertung von Ammoniumsalzen werden ausgewertet

11. Erkennbares Wachstum in 5%iger Natriumchloridlösung.

12. Sehr geringes Wachstum im Glucose-Nitrat-Nährmedium.

13. Kein Wachstum unteF anaeroben Bedingungen.

14. Keine Erzeugung von Gas im Niirat-Nährmedium unter anaeroben Bedingungen.

15. Erkennbares Wachstum in Glucose-Asparagin-Nährmedium.

(c) Verwertung von Kohlenstoffverbindungen

In einem 1 % Carbonat enthaltenden Nährmedium werden Glucose, Mannose, Cellobiose, Lactose, Saccharose und Mannit verwertet. Salicin, Arabinose und Xylose werden schlecht verwertet. Es wird Säure er-

Bacillus ATCC 21591
(a) Wachstum

Nährmedium

1. Bouillon

2. Bouillon und Agar-Agar

3. Glucose und Bouillon....

4. Glucose, Bouillon und
Agar-Agar

5. Gelatine-Nährtuden

6. Pepton und Wasser

7. Kartoffel-Nährboden ....
*) Nach Zusatz von I % Na₂CO₃.

pH-Wert des Nährmediums 7 10,2*)

gering

merklich

gering

merklich

sfark

stark
gut

merklich gut

Die Abmessungen des Mikroorganismus betragen 0,4 bis 0,5 x 2,5 bis 4 μΐη. Das Sporangium ist gequollen und die Spore ovai, 0,8 bis 1,0 x 1,3 bis 1,4 μπι. Aus der F i g. 2 geht hervor, daß der Mikroorganismus pertrichöse Geißeln hat. Der genannte Bacillus wächst auf dem nachstehend beschriebenen Nährmedium (Stärke, Hefeextrakt, Pepton, K₂HPO₄, MgSO₄-7H₂O und Na₂CO₃, auf einen pH-Wert von 10,2 eingestellt) gut in Form einer weißen Kolonie. Dieser Bacillus zeichnet sich dadurch aus, daß er nicht auf einen neutralen, sondern auf einem alkalischen Nährmedium gut wächst.

(b) Physiologische Eigenschaften
1. Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert 8 bis 10, Temperatur 37 bis 40° C, Vorhandensein von Luftsauerstoff.

2. Bedingungen, unter denen Jas Bakterium wachsen kann :

pH-Wert 7 bis 11, Temperatur bis zu 55⁰C, Vorhandensein von Luftsauerstoff.

3. Gramfärbbarkeit positiv

(veränderlich)

4. Voges-Proskauer-Reaktion nicht klar

5. Nitrat wird reduziert. .

6. Katalase positiv

7. Hydrolyse von Gelatine und Casein positiv

8. Hydrolyse von Stärke positiv

9. Verv/ertung von Citrat .... wird nicht verwertet

10. Verwertung von Ammoniumsalzen werden verwertet

11. Geringes Wachstum in 7%iger Natriumchloridlösung.

12. Erkennbares Wachstum in einem Glucose-Nitrat-Nährmedium.

13. Erkennbares Wachstum unter anaerouen

45

gungen.

14. Keine Erzeugung von Gas in Nitrat-Nährmedium unter anaeroben Bedingungen.

15. Erkennbares Wachstum in Glucose-Asparagin-Nährmedium.

(c)rVerwertung von Kohlenstoffverbindungen

In einem 1 % Carbonat enthaltenden Medium werden Glucose, Mannose. Salicin, Cellobiose, Lactose, Saccharose, Arabinose, Mannit und Xylose verwertet.

Bacillus ATCC 21596
(a) Wachstum

Nährmedium

1· Bouillon

2. Bouillon mit Agar-Agar

3. Glucose und Bouillon...

4. Glucose, Bouillon und
Agar-Agar

5. Geiatine-Nährboden....

6. Pepton und Wasser

7. Kartoffel-Nährboden ...
*) Nach Zusatz von I % Na₂CO₃.

pH-Wert im Nährmedium
7 10,2*)

sehr gering
sehr gering
sehr gering

sehr gering
sehr gering

merklich

stark

merklich

gut

Die Abmessungen des Mikroorganismus betragen 0,5 bis 0,8 x 2,0 bis 3,0 μΐη. Das Sporangium ist leicht gequollen und die Spore oval, 0,9 bis 1,0 x 1,2 bis 1,5 μΐη.

Der Mikroorganismus hat pertrichöse Geißeln, die in der F i g. 3 erkennbar sind. Dieser Bacillus wächst auf dem nachstehend beschriebenen Nährmedium (lösliche Stärke, Hefeextrakt. Pepton. K₂HPO₄, MgSO₄-7H₂O und Na₂CO₃₁ eingestellt auf einen pH-Wert von 10,2) sehr gut- Der Bacillus zeichnet sich dadurch aus, daß er nicht auf einem neutralen, sondern auf einem alkalischen Nährmedium gut wächst.

(b) Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert 8 bis 10. Temperatur 37 bis 40 C. Vorhandensein von Luftsauerstoff.

2. Bedingungen, unter denen das Bakterium wachsen kann:

pH-Wert 7,5 bis 11, Temperatur bis zu 45 C. Vorhandensein von Luftsauerstoff.

3. Gramfärbbarkeit positiv

4; Voges-Proskauer-Reaktion +

5. Nitrat wird nicht reduziert.

6. Katalase positiv

7. Hydrolyse von Gelatine und Casein.... positiv

8. Hydrolyse von Stärke positiv

9. Verwertung von Citrat wird verwertet

10. Verwertung von Ammoniumsalzen werden verwertet

11. Kein erkennbares Wachstum in einer 7%igen Natriumchloridlösung.

12. Sehr geringes Wachstum in GIucosc-Nitrat-Nährmedium.

13. Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.

14. Keine Erzeugung von Gas in Nilrat-Nährmedium unter anaeroben Bedingungen.

15. Erkennbares Wachstum in GIucose-Asparagin-Nährmedium.

16. Erzeugung von Indol negativ

(c) Verwertung von Kohlenstoffverbindungen

In einem 1 % Carbonat enthaltenden Nährmedium werden Glucose, Mannose, Cellobiose, Lactose, Saccharose, Arabinose, Mannit und Xylose verwertet Und wird Slaicin nicht verwertet Es wird Säure erzeugt.

Bacillus ATCC 21593

(a) Wachstum

Nährmedium

1. Bouillon

2. Bouillon und Agar-Agar

3. Glucose und Bouillon..

4. Glucose, Bouillon und
Agar-Agar

5. Gelatine-Nährboden ...

6. Pepton und Wasser

7. Kartoffel-Nährboden ..

*l Nach Zusatz von 1% Na₂CO₃.

pH-Wert im Nährmedium

sehr gering	gering
sehr gering	gering
sehr gering	stark
sehr gering	stark
—	stark
—	merklich
sehr gering	gut

Die Abmessungen des Mikroorganismus betragen 0,5 bis 0,6 x 2.0 bis 3,0 μπι. Das Sporangium ist gequollen und die Spore oval. 0.9 bis 1.0 x 1.2 bis 1,5 μηι.

Der Mikroorganismus hat pcrtrichöse Geißeln, die in der F i g. 4 erkennbar sind. Der Bacillus wächst auf dem nachstehend beschriebenen Nährmedium (lösliche Stärke. Hefsextrakt, Pepton, K₂HPO₄,

MgSO₄.' 7 H₂O und Na₂CO.,, eingestellt auf einer* pH-Wert von 10,2) sehr gut; Er zeichnet sich dadurch

ίο aus, daß er nicht auf einem neutralen, sondern auf einem alkalischen Nährmedium gut wächst

(b) Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Wachstumsbedingungen:

'⁵ pH-Wert 8 bis 10. Temperatur 37 bis 40 C Vorhandensein von Luftsduerstoff

2. Bedingungen, unter denen das Bakterium wachsen kann:

pH-Wert 7.5 bis 11. Temperatur bis zu 45'¹C. Vorhandensein von Lufisauersioff

Mit Hilfe des ΓΌ Na₂CO, enthaltenden Niihrmediums wurden folgende Bestimmungen durchgeführt

3. Gramfärbbarkeil positiv

4. Voges-t roskauer-Rcaklion t

5. Nitrat wird nicht reduziert

6. Kalalase positiv

7. Hydrolyse von Gelatine und Casein.. positiv

8. Hydrolyse von Stärke positiv

9 Verwertung von Cilral wird verwertet

10. Verwertung von Ammoniumsalzen werden verwertet

Il Kein erkennbares Wachstum in einer 7%igen Nalriumchlondlösung.

12. Sehr geringes Wachstum in Glucose-Nilrat-Nahr-

mcdium

13. Erkennbares Wachstum unter anaeroben Bedingungen.

14. Keine Erzeugung von Gas in einem Nitrat-Nährmedium unter anaeroben Bedingungen.

15. Erkennbares Wachstum in GIucose-Asparagin-Nährmedium.

(cj Verwertung von Kohlenstoffverbindungen
In einem 1% Carbonat enthaltenden Nährmedium werden Glucose. Mannose. Cellobiose. Lactose. Saccharose. Mannit und Xylose verwertet. Dagegen werden Salicin und Arabinose nicht verwertet. Es wird Säure erzeugt.

Bacillus ATCC 21595
(a) Wachstum

Nährmedium

1. Bouillon

2. Bouillon und Agar-Agar
3. Glucose und Bouillon

4. Glucose, Bouillon und
Agar-Agar

5. Gelatine-Nährboden

6. Pepton und Wasser

7. Kartoffel-Nährboden ...
*} Nach Zusatz von 1% Na₂CO₃.

pH-Wert im Nährmedium
7 10.2·)

sehr gering
sehr gering
sehr gering

sehr gering

merklich

sehr gering

merklich

■gut

gut

gut. mit
Verflüssigung

merklich
gut

Die Abmessungen des Mikroorganismus betragen 0,6 bis 0,8 x 2.5 bis 4 μπι. Das Sporangium ist laicht gequollen und die Spore oval, 1,0 bis 1.2 x 1.5 bis IQ
.8 μΠΊ.

Der Mikroorganismus hat pertrichösc Geißeln, die in der F ί g. 5 erkennbar sind. Dieser Bacillus wächst auf dem nachstehend beschriebenen Nährmedium (lösliche Stärke, Hefeextrakt, Pcplon. K₂HPO₄, MgSO₄ · /H₂O und Na₂CO₃. auf einen pH-Wert von 10,2 eingestellt) sehr gut. Er zeichnet sich dadurch aus, daß er nicht auf einem neutralen, sondern auf einem alkalischen Nährmedium gut wächst.

(b) Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Wadisiumsbcdingungen: '⁵

pH-Wert 8 bis 10. femperaturen von 37 bis 40 C. Vorhandensein von Luflsaucrstoff.

2. Bedingungen, unter denen das Baklcrium wachsen kann:

pH-Wert 7 bis II, Temperatur bis zu 42 C, Vorhandensein von Luftsauerstoff.

3. Gramfärbbarkeit positiv

(veränderlich)

4. V^ges-Proskauer-Reaktion positiv

5. Nitrat wird reduziert.

6. Katalase positiv

7. Hydrolyse von Gelatine und

Casein positiv

8. Hydrolyse von Stärke positiv

9. Verwertung von Citrat ... wird nicht verwertet

10. Verwertung von Ammoniumsalzen werden verwertet

11. Kein erkennbares Wachstum in einer 7%igen Natriumchloridlösung.

12. Sehr geringes Wachstum in einem Glucose-Nitrat-Nährmedium.

13. Erkennbares Wachstum unter anaeroben Bedin-

Nührmcdium

4, Glucose, Bouillon und
Agar-Agar

5. Gelatine-Nährboden..

pli-Wcrl im Nührmedium	gut
7	gut, unter
—	Verflüs
—	sigung
	nicht gut
	gut
—
gering

6. Pepton Und Wasser,,..

7. Kartoffel-Nährboden ..

·» Nach lunatr von 1% Na₁' O,.

Die Abmessungen der Mikroorganismen betragen 0.5 bis 0.6 χ 2,0 bis 3.0 μπι. Das Sporangium ist leicht gequollen und die Spore oval, 1,0 bis 1.2 χ 1,3 bis 1.7 μπι.

Der Mikroorganismus hat pertrichösc Geißeln, die in der F i g. 6 erkennbar sind. Dieser Bacillus wächst auf dem nachstehend beschriebenen Nährmedium (lösliche Stärke. Hefeextrakt, Pepton, K₂HPO₄, MgSO₄ 7H₂O und Na₂CO₃. auf einen pH-Wert von 10.2 eingestellt) sehr gut. Er zeichnet sich dadurch aus. daß er nicht auf einem neutralen, sondern auf einen alkalischen Nährmedium gut wächst.

(b» Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert 8 bis 10. Temperatur 37 bis 40" C. Vorhandensein von Luftsauerstoff.

2. Bedingungen, unier denen das Bakierium wachsen kann:

pH-Wert 7.5 bis 11. Temperatur bis zu 45" C. Vorhandensein von Luftsauerstoff.

Mit Hilfe des 1% Na₂CO₃ enthaltenden NäJirmediums wurden folgende Bestimmungen durchgeführt:

gungen.

14. Keine Erzeugung von Gas in Nitrat-Nährmedium unter anaeroben Bedingungen

15. Erkennbares Wachstum in Glucose-Asparagirr Nährmedium.

(c) Verwertung von Kohlenstoffverbindungen

In einem 1 % Carbonat enthaltenden Nährmedium werden Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose, Lactose, Saccharose, Arabinose, Mannit und Xylose verwertet. Es wird Säure erzeugt.

Bacillus ATCC 21 594
(a) Wachstum

Nährmedium

1. Bouillon sehr gering

2. Bouillon und Agar-Agar sehr gering

3. Glucose und Bouillon sehr gering

*) Nach Zusatz von 1% Na₂CO₃.

pH-Wert im Nährmedium 7 10.2*)

gating
gering

gut, bei
einheitlicher
Trübung

3. Gramfärbbarkeit positiv

(veränderlich} 4. Voges-Proskauer-Reaktion positiv

5. Nitrat wird nicht reduziert.

6. Katalase positiv

7. Hydrolyse von Gelatine und

Casein positiv

i. Hydrolyse von Stärke positiv

9. Verwertung von Citrat.... wird nicht verwertet

10. Kein erkennbares Wachstum in 7%iger Natriumchloridlösung.

11. Sehr geringes Wachstum in GIucose-Nitrat-Nährmedium.

IZ Erkennbares Wachstum unter anaeroben Bedingungen.
13. Keine Erzeugung von Gas in Nitrat-Nähnnedium

unter anaeroben Bedingungen.
14. Erzeugung von Idol negativ

(c) Verwertung von KoMenstoffträgern

In einem 1% Carbonai enthaltenden Nährmedium werden Glucose. Mannose, Salicin, Cellobiose. Lactose, Saccharose und Mannit verwertet und werden Arabinose und Xylose nicht verwertet. F.«; wird Säure erzeugt

309616 82

ίο

Die genannten Mikroorganismen unterscheiden gehen aus der nachstehenden Tabelle hervor:

sich voneinander. Ihre charakteristischen Unterschiede

Eigenschaften	ATCC 21591	ATCC 21592	Bacillus	ATCC 21594	ATCC 21595	ATCC 21596
			ATCC 21593
Wachstum im neutrafen	gering	sehr gering		sehr gering	sehr gering	sehr gering
Nährmedium ..........			sehr gering
Wachstum in 7%iger	gering	langsam		sehr gering	sehr gering	sehr gering
NaCl-Lösung			sehr gering
Wachstum in Glucose-	merklich	merklich		merklich	merklich	merklich
Asparagm- Nährmedium	±	+	merklich	+		±
Voges- Proskauer-Reak tion	positiv	positiv	±	negativ	posifv	negatb
Reduktion von Nitrat ...			negativ
Wachstum unter an	merklich	negativ		merklich	merklich	negativ
aeroben Bedingungen ...		merklich

Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß die genannten Mikroorganismen unterschiedliche Eigenschaften haben.

Eine vergleichende Untersuchung der genannten Stämme nach dem Klassifikationsverfahren, das in den genannten Veröffentlichungen »Aerobic Sporeforming Bacteria« und »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology« (1957) (S. 613 ff.) beschrieben ist. ergab, daß die genannten Mikroorganismen in manchen Eigenschaften den bekannten Mikroorganismen der Gattung Bacillus ähnefn. sich in anderen Eigenschaften aber vollständig von diesen bekannten Mikroorganismen unterscheiden, und daß die bekannte Gattung keine Art besitzt, die in den vorstehend angegebenen Eigenschaften mit den erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen übereinstimmt. Dies führte zu dem Schluß, daß es sich um neue Stämme der Gattung Bacillus handelt. Da alle diese Mikroorganismen aerobe, sporenbildene Bakterien sind, gehören sie zu der Gattung Bacillus.

Eine typische Eigensch-ft der genannten Mikro-Organismen besteht darin, daß sie in einem alkalischen Nährmedium besonders gut wachsen. Der optimale pH-Wert für das Wachstum ist 8 bis 10.

Bei eiern erfindungsgemäßen Verfahren kann man die Fermentation wie folgt durchführen:

Ein Carbonat wird einem Nährmedium zugesetzt, das als Kohlenstoffmaterial Stärke, lösliche Stärke od. dgl. enthält. Als Stickstoffmaterialien verwendet man Hefeextrakt, Pepton, Maisquellwasser od.dgL Als anorganische Salze verwendet man verschiedene Ca«bonate. z. B. Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat die beim Ansetzen des Nährmediums der Lösung zugesetzt werden. Das Nährmedium wird auf einen pH-Wert von etwa 10,5 eingestellt.

Das auf diese Weise erzsagte Nährmedium wird mit einem der genannten Baciilus^Stämme unter Schütteln bei einer Temperatur von etwa 24 bis 45°C fermentiert Im allgemeinen erreicht die Aktivität des erzeugten Sizyms nach einer Züchtangsdauer von etwa 24 bis 75 Standen ein Maximum.

Da die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Aktivität des Enzyms in Abhängigkeit von den Belüftungs- und Rührbedingungen auch bei gleichen Temperaturen and gleich zusammengesetzten Nährmedien verschieden lang sein kann, ist es ratsam, die Zcci ...ngsdaoer in jedem Fall in Abhängigkeit von ijg^n der Aktivität des Enzyms zu bestimnien.

Die zweite wichtige Bedingung ist der pH-Wert des Nährmediums. Der pH-Wert muß mit Carbonaten oder Bicarbonaten auf einen Werf im Bereich Von 7 bis 11 eingestellt werden. Bei einem zuckerhaltigen Nährmedium liegt der optimale pH-Werl im Bereich von 8 bis 11.

Zur Isolierung des Enzyms aus der Nährbrühe kann man die gebräuchlichen physikochemischen Verfahren anwenden. Beispielsweise kann man nach dem Abkühlen der Kulturbrühe diese durch einen Zusatz von Essigsäure neutralisieren, wenn dies erwünscht ist. Danach wird zum quantitativen Ausfällen der alkalischen Amylase Äthanol zugesetzt. Das Fäilungsprodukt wird abgetrennt, gründlich mit Äthanol gewaschen und getrocknet. Es wurde bestätigt, daß das auf diese Weise aus der Kultur eines der genannten Mikroorganismen erhaltene Enzym eine alkalische Amylase mit einem optimalen pH-Wert von 10,5 ist und seine Aktivität beibehält.

Die Züchtung wird in einem alkalischen Nährmedium mit einer hohen Carbonatkonzentration durchgeführt werden. Dem Nährmedium, das beispielsweise die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen enthält, werden verschiedene Carbonate zugesetzt Beispielsweise wird man einem Nährmedium, das Glucose, K₂HPO₄, Hefeextrakt Pepton und MgSO₄. · 7H₂O enthält, Natriumcarbonat Kaliumcarbonat oder Natriumbicarbonat zusetzen, wobei die Konzentration des zugesetzten Carbonate zweckmäßig 0.5 bis 5% beträgt.

1. Salzzusatz

Bei der Erzeugung der alkalischen Amylase ist der Zusatz eines Carbonats zu dem vorstehend angegebenen Nährmedium äußerst wichtig. Die nachstehenden Angaben wurden durch Versuche bestätigt

Die Züchtung der verwendeten Bazillen und die Erzeugung von Amylase mit Hilfe des vorstehend angegebenen Nähnnediums wurden unter Zusatz von 1% Natriumcarbonat oder von je 1% der verschiedenen Carbonate bzw. unter Verwendung desselben Nährmediums durchgeführt, das kein Carbonat sondern anstatt dessen 1% Natriumchlorid oder Kaliumchlorid enthielt und mit Natriamhydroxyd auf einen pH-Wert von 10,0 eingestellt worden war. Das Wachstum des Mikroorganismus wurde dadurch bestimmt daß die Kulturbrühe nach 18 Stunden in eine Küvette mit einem Strahlengang von 1 cm

Läfif_;e gegeben würde und ihr Absorptionsgrad bei 660 nm und die Aktivität der Amylase unter den nachstehend angegebenen Bedingungen gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben, aus

der hervorgeht, daß das Vorhandensein eines Carbonats in dem Nährmedium eine wichtige Voraussetzung für die Erzeugung der erfindungsgemäß erhältlichen alkalischen Amylase ist.

Tabelle 1
Salzzusatz

	Kein¹)	IVoNaCI	1% KCI	Na₂HPO₄- NaOH (0.05 M)	I % NaHCO₃	0,5% Na₂CO₃	2000	1,0% Na₂CO₃	',0% K₂CO₃
Ursprünglicher							1600
pH-Wert	7,2	10,5²)	10.5²)	10,5	10,0	10.2	1800	10,5	10,5
Wachstum							2200
ATCC 21591 ...	0.2	0,8	0,75	1.5	2,5	3,0	2600		1,2
ATCC 21592 ...	0,1	0,8	0,8	0,9	1,2		2600		0/7
ATCC 21593 ...	0,1	0,6	0,7	0,8	1,5			1,3
ATCC 21594 ...	0,1	0,5	0,6	0,8	1,5			1,2
ATCC 21595 ..:	0.1	I 0,9	0,9	1,0	1.5			1,2
ATCC 21596 ...	0,1	0,5	0,8	0,9	1,2			0,67
Amylaseaktivität,					,3	,2
(ig/ml					,3	,2
ATCC 21591 ...	nicht erzeugt		620	2500	,5	,1	400
ATCC 21592 ...	nicht erzeugt		300	800	,4	,3	300
ATCC 21593 ...	nicht erzeugt		380	1600	,3	,2	400
ATCC 21594 ...	nicht erzeugt		350	2700		1,2	350
• ATCC 21595 ...	nicht erzeugt		620	2500			400
ATCC 21596 ...	nicht erzeugt		300	1500		300
1100
800
1200
1300
1500
1800

') Dieses Nährmedium enthielt nur lösliche Stärke,
²) Mit NaOH eingestellt.

K₂HPO,, H-feextiakl, Pepton und MgSO₄ · 7H₂O.

2. pH-Wert

Die nächste wichtige Bedingung für die Züchtung ist der pH-Wert. Aus den Ergebnissen der nachstehend beschriebenen Versuche geht hervor, daß zur Erzeugung der alkalischen Amylase der pH-Wert auf den gewählten Wert im Bereich von 7 bis 11 eingestellt werden muß. Die Untersuchung der Wirkung des pH-Werts auf die Erzeugung der alkalischen Amylase durch Veränderung des pH-Werts des vorstehend angegebenen, 1% Natriumcarbonat enthaltenden Nährmeüiums mit HCi oder NaOH ergab gemäß Tabelle 2, daß das beste Ergebnis bei einem pH-Wert von 7 bis 11, insbesondere von 8 bis 11, in Anwesenheit von Glucose erhalten wurde. In diesem Fall wurde als Mikroorganismus der Bacillus ATCC 21 592 verwendet.

Tabelle 2
Amylaseaktivität, μg/ml

	7	8	pH-Wert 9	10	11
Nährmedium mit 1% Na₂CO₃ ohne Na₂CO₃	<100 <100	350 <100	1600 <100	1800 <100	300 <100

Bei der Verwendung des Baciilus ATCC 21596 wurden die in der Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse erzielt.

Tabelle 3
Amylaseaktivität, {/.g/ml

	7	S	pH-Wert 9	IO	Il
Nähnnediuin mit 1% Na₇CO,	200 <100	1000 <100	2600 <100	2800 <I00	800 <100
ohne Na₂CO₃ -,,-.

Aus der Tabelle 3 geht hervor, daß dus beste Ergebnis bei einem pH-Wert von 7 bis 11, insbesondere yon 8 bis 11, in Anwesenheit von Carbonat erzielt wird.

Bei der Verwendung des Bacillus ATCC 21 591, -ATCC 21 593. -- ATCC 21 595 und —ATCC 21 594 als Prüforganismen waren die Ergebnisse ähnlich wie in der Tabelle 3 angegeben.

Durch Veränderung des pH-Werts des Nährmediums mit NaHCO₃ oder Na₂CO₃ wurde dann die Wirkung des pH-Werts auf die Erzeugung der alkalischen Amylase untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 angegeben. Dabei wurde als Mikroorganismus der Bacillus ATCC 21 596 verwendet.

Tabelle 4
Salzzusatz

Ursprünglicher pH-Wert

End-pH-Wert

Wachstum

Amylaseaktivität, μg'ml..

Kein¹

7,0

0,1

nicht erzeugt

0,5% NaHCO₃

8,9
9,4
0,8
750

1,0% NaHCO₃ iO% NaHCO₃

9,0
9,5
0,9
1500

. 0.5% Na₂CO₃

9,2
9,6
1,0
1800

9.7
9,6
0,9
1400

1,0% Na₂CO₃

10,3
9,8
1,0
1500

') Dieses Nährroedium enthielt nur lösliche Stärke, K₂HPO₄. Hefeextrakt, Pepfon, MgSO₄ · 7H₂O.

Unter den vorstehend angegebenen Züchtungsbedingungen wird daher das Nährmedium mit jedem der Benannten Mikroorganismen (Bacillus ATCC 21 591. -ATCC 21 592, —ATCC 21 593, -ATCC 21 594.- ATCC 21 595 und -ATCC 21 596) geimpft, der in dem gleichen Nährmedium vorgebrütet worden war. Der Mikroorganismus wird dann unter Schütteln des Nährmediums und unter geeigneten Bedingungen, z. B. einer Temperatur von 37"C. beispielsweise 24 bis 75 Stunden lang, gezüchtet. Nach dem Ablauf der Züchtungsdauer werden die Zellen entfernt und kann die Brühe gegebenenfalls mit Essigsäure oder einer ähnlichen Säure neutralisiert werden. Dann wird zum Ausfällen der erzeugten alkalischen Amylase ein organisches Lösungsmittel, wie Äthanol oder Aceton, zugesetzt. Zur Gewinnung der gewünschten Substanz wird das Fällungsprodukt entwässert und getrocknet.

Die so erhaltene alkalische Amylase hat eine Aktivität von 1500 bis 3000 ;jig/ml und einen optimalen pH-Wert von etwa 10,5 im alkalischen Be! eich.

Die erfindungsgemäß erhaltene alkalische Amylase hat folgende physikochemische Eigenschaften:

1. Molekulargewicht (bei Bestimmung mit Sephadex): 30 000 bis 40 000 g.

2. Optimaler pH-Wert und Bereich der stabilen pH-Werte nach Erhitzung auf 55° C: Aus den F i g. 7 und 8 geht hervor, daß der optimale pH-Wert bei etwa 10.5 liegt.

Das erfindungsgemäße Enzym wurde mit jeweils 0,05molaren Pufferlösungen, die verschiedene pH-Werte hatten (Acetat-Pufferlösung, pH 4 bis 6; Tris-maleat-Pufferlösung, pH 6 bis 9; Glycin-NaCI-NaOH-PulTerlösung, pH 9 bis 10,7; NaCO₃-NaOH-Pufferlösung, pH 11 bis 12) und 3 mMol Ca⁺⁴ enthielten, versetzt und dann 15 Minuten lang auf 55'C erhitzt. Danach wurde die Restaktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in der F i g. 9 dargestellt.

3. Untersuchung der enzymatischen Aktivilät

Die alkalische Amylase wurde zweckmäßig verdünnt (0,01 ml), zu 0,4 ml einer 0,15%igen Stärkelösung (0,1 M Glycin-NaCI-NaOH-Pufferlösung.

pH-Wert 10,5) zugesetzt und 10 Minuten bei 40" C gebrütet. Die Reaktion wurde durch Zusatz von

0,5 ml 0,1 η HCl beendet. Zu dem Gemisch wurden 3 ml einer 0,005%igen Jodlösung zugesetzt. Der Absorptionsgrad einer Probe bei 700 nm wurde gemessen. Zur Korrektur der abgelesenen Werte wurde der Wert für eine Kontrollösung abgezogen, die aus einem Gemisch der Enzymlösung mit 0,1 n-HCl vor dem Zusatz der Stärkelösung bestand.

Definition der enzymatischen Aktivität

Als Einheit der enzymatischen Aktivität wurde die Menge des Enzyms bezeichnet, die den Absorptionsgrad bei 700 nm unter den vorstehend angegebenen Bedingungen um 10% herabsetzte.

40

4. Verwendungstemperaturbereich

Die enzymatische Aktivität wurde nach dem übliehen Verfahren unter Veränderung der Temperatur gemessen. Dabei wurden der Lösung 2 mMol CaCI₂ als Stabilisator zugesetzt. In der Fig. 10 wurde die Aktivität bei 30^rC mit 100% angenommen. Die Aktivität betrug dann bei 50⁰C 650% für Bacillus ATCC 21 591, -ATCC 21 592, ATCC 21 593 und - ATCC 21 596 und bei 60" C 670% für Bacillus ATCC 21 594 und -ATCC 21 595. Alle Versuche wurucn bei eineiH pK-Wcri ven !0,5 durchgeführt.

55

5. Bedingungen für eine thermische Inaktivierung

Das erfindungsgemäß erhältliche Enzym wurde in einer M/20-Glycin-NaCI-NaOH-Pufferlösung mit dem pH-Wert 10,? gelöst. Die Lösung wurde bei verschiedenen Temperaturen 15 Minuten lang erhitzt. Dann wurde die Restaktivität gemessen. Die Messung erfolgte in An- oder Abwesenheit von 5 mMol CaCI₂. Aus der Tabelle 5 geht hervor, daß bei einer Erhitzung auf etwa 30 bis 50' C in Anwesenheit von Ca^{+ +} die Restaküvität 100% und bei einer Erhitzung auf etwa 55' C die Restaktivitäl 50% betrug.

AO

Tabelle 5 Bedingungen Für cine thermische Inaktivierung

	Bad'lus ATCC 21591 %	Bacillus ATCC 21592 %	Bezeichnung des Bacillus ATCC 21593 %	Mikroorganismus Bacillus ATCC 21594 %	Bacillus ATCC 21595 %	Bacillus ATCC 21596 %
30°C	100	100	100	100	100	100
40⁰C ..	100	100	100	100	100	100
50⁰C - Ca ...-. + Ca ....	65 100	57 100	42 99	94 100	93 100	55 100
55° C - Ca.... + Ca ....	6,1 62,1	5,2 58,5	6,3 22,7	57,2 95,3	65,8 94,3	6,2 67,5
60°C	7,1	5,1	8,2	7,3	4,5	8,9

6. Inhibierung und Aktivierung

Die Inhibierung und Aktivierung des erfindungsgemäßen Enzyms wurden untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Reagens

Äthylendiamintetraessigsäure
p-Chljrquecksilberbenzonat
Harnstoff

Konzentration

10"²M

8M

	Bezeichnung des	Bacillus	Bacillus	Mikroorganismus	Bacillus	Bacillus
Bacillus	ATCC 21592	ATCC 21593	Bacillus	ATCC 21595	ATCC 21596
ATCC 21591	105	111	ATCC 21594	100	100
107	97	98	105	100	100
109	0	0	100	0	0
0	0

7. Reinigungsverfahren

Das durch die erfindungsgemäße Züchtung von Bacillus ATCC 21 592 bzw. —ATCC 21 591 erhaltene Kulturfiltrat (2000 mg/ml) wurde durch eine Kolonne geführt, die Diäthylaminoäthylcellulose enthielt, die mit 0,!»M=PhosphaUPuffer!5sung {pH-Wert 8,0) im Gleichgewicht gehalten wurde. Die alkalische Amylase wurde vollständig adsorbiert und gründlich mit einer 0,1-M-Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) gewaschen. Die adsorbierte alkalische Amylase wurde mit einer 0,1-M-Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) eluiert, die 0,4 M NaCl enthielt.

Durch dieses Verfahren wurde die Reinheit der genannten alkalischen Amylase etwa auf das 30fache erhöht.

WJrl·¹ car

in rtor rvrol/tso/^rt^rt AnuionfJunx

Die erfindungsgemäß erhältliche alkalische Amylase ist ein stärkeabbauendes Enzym, das einen optimalen pH-Wert von etwa 10,5 im alkalischen Bereich hat und auch in Anwesenheit von Detergentien eine enzymatische Aktivität besitzt.

Die enzymatische Aktivität der vorliegenden alkalischen Amylase in dem Detergens wird nachstehend im Zusammenhang mit der Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Enzyms an Hand von Versuchsergebnissen erläutert.

1. Verwendung

Wenn das erfindungsgemäße Enzym als Zusatz zu Detergentien verwendet wird, setzt man es in Pulverform dem Detergens, z. B. Natriumdudecylbenzolsulfonat (DBS), direkt zu. Dieser Mischvorgang unterliegt keinerlei Einschränkungen, weder hinsichtlich des pH-Werts des Detergens noch des Mischungsverhältnisses zwischen den Detergensbestandteilen

4c und den Zusätzen. Beispielsweise erzielt man eine gute Wirksamkeit, d. h. ein gutes Amylolysevermögen, Wenn das erfiridungsgeniäße Enzym in der mischung in einer Konzentration von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent vorhanden ist.

2. Wirksamkeit (enzymatische Aktivität
in Detergentien)

Das erfindungsgemäße Enzym wurde während einer bestimmten Zeitdauer bei 40⁰C in Anwesenheit eines Detergens gebrütet. Danach wurde die Restaktivität des Enzyms gemessen.

Versuchsmethode

Die Konzentration des mit dem erfindungsgemäßen Enzym in Berührung stehenden Detergens betrug 0,1%. Als Detergens wurde Natriumdodecylbenzolsulfonat (DBS) verwendet. Während der Reaktion wurde der pH-Wert mit Hilfe einer Glycin-NaCI-NaOH-Pufferlösung auf 10,5 eingestellt.

Reaktionslösung

Detergens, 0,5% 2 ml

' Glycin-NaCI-NaOH-Pufferlösung 3 ml

Erfindungsgemäßes Enzym

(2000 ug/m!) 1 ml

Wasser 4 ml

309616/82

Ergebnisse

Restaktivität des erfindungsgemäßen Enzyms (Reaktionstemperatur 40° C)

Bezeichnung des	21 591	RestaktivitäL % nach	30	Minuten	60 Minuten	Erfindung	beschrieben.
Mikroorganismus						B	ei s ρ i e 1 1
	21 592	0 Minuten		89	49	Lösliche	Stärke,
Bacillus						K₂HPO,
ATCC	21 593			68	50	Hefeextrakt,
Bacillus						Pepton und
ATCC	21 594			79	49
Bacillus
ATCC	21 595			102	97
Bacillus
ATCC	21 596			101	98
Bacillus
ATCC				85	51
Bacillus				Nachstehend werden praktische Ausführungsbei
ATCC		spiele der

	100	20 g
	ig
100	5g
	10g
100

100

100

100

bei 115'C sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten bei 115" C sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Nähnnedium mit einem pH-Wert von etwa 10,3 erhalten.

Von diesem Nährmedium wurden 50 ml in abgesetzte Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben. Das in den Kolben befindliche Nährmedium wurde dann mit

ίο dem Bacillus ATCC 21591 geimpft, der in dem gleichen Nährmedium über Nacht vorgebrütet worden war und in den Kolben 68 Stunden bei 37³C unter Schütteln gezüchtet wurde. Nach dem Entfernen der Zellen enthielt 1 ml dieses Kulturfiltrats 2500 Ein-,leiten alkalische Amylase.

Diese Kulturbrühe wurde gründlich abgekühlt. Dann wurden 3 Volumen Aceton zugesetzt, worauf das Enzym quantitativ ausfiel. Dieses Fällungsprodukt wurde mit Aceton gründlich gewaschen und luftge-

trocknet. Von einem Liter der Kulturbrühe wurden etwa 11 g eines bräunlichen Pulvers erhalten.

Die auf diese Weise erhaltene Probe hat einen optimalen pH-Wert von etwa 10,5 und stellt eine alkalische Amylase mit einer spezifischen Aktivität von

210000 μg pro Gramm alkalische Amylase dar.

0,25 g MgSO₄-7H₂O

wurden in 900 ml Wasser aufgelöst und 15 Minuten bei 115° C sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten bei 115° C sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen erhielt man ein Nährmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,3-

Von diesem Nährmedium wurden 5OmI in abgesetzte Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben. Das in den Kolben befindliche Nährmedium wurde dann mit dem Bacillus ATCC 21592 geimpft, der in dem gleichen Nährmedium über Nacht vorgebrütet worden war und in den Kolben 68 Stunden lang bei 37° C unter Schütteln gezüchtet wurde. Nach dem Entfernen der Zellen enthielt 1 ml des Kulturfiltrats 2100 Einheiten alkalische Amylase.

Diese Ku'turbrühe wurde gründlich abgekühlt. Dann wurden 3 Volumen Aceton zugesetzt, worauf das Enzym quantitativ ausfiel. Dieses Fällungsprodukt wurde mit Aceton gründlich gewaschen und luftcetrncWnet. Von einesi Liter der Ku!ii:rbrühc wurden etwa 11g eines bräunlichen Pulvers erhalten.

Die auf diese Weise erhaltene Probe hat einen optimalen pH-Wert von etwa 10,5 und stellt eine alkalische Amylase mit einer spezifischen Aktivität von 200000 μg pro Gramm alkalische Amylase dar.

Beispiel 2

20 g Lösliche Stärke,

1 g K₂HPO₄,

5 fe Hefeexirakt,
10 g Pepton und

0,25 g MgSO₄ -7H₂O

wurden in 900 ml Wasser aufgelöst und 15 Minuten

	Beispiel
20 g	Lösliche Stärke,
ig	K₂HPO₄,
5g	Hefeextrakt.
10g	Pepton und
0,25 g	MgSO₄-7H₂O

wurden in 900 ml Wasser aufgelöst und 15 Minuten bei 115° C sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten bei 115" C sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Nahrryiedium mit einem pH-Wert von etwa 10,3 erhalten.

Von diesem Nährmedium wurden 50 ml in abgesetzte Schütteikolben (Sakaguchi-Kolben) mit einer Kapazität von 500 ml gegeben. Das in den Kolben befindliche Nährmedium wurde dann mit dem Baciüus ATCC 21596 geimpft, der in dem gleichen Nährmedium über Nacht vorgebrütet worden war und in den Kolben 68 Stunden lang bei 37" C unter Schütteln gezüchtet wurde. Nach dem Entfernen der Zellen enthielt 1 ml dieses Kulturfiltrats 3100 Einheiten alkalische Amylase.

B e i s ρ i e 1 4

20 g Lösliche Stärke,
1 g K₂HPO₄,
5 g Hefeextrakt.
10 g Pepton und

g p

0,25 g MgSO₄

' H₂O

wurden in 900 ml Wasser aufgelöst und 15 Minuten bei 115X sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten bei 115⁰C sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Nährmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,3 hergestellt.

Von diesem Nährmedium wurden 50 ml in abgesetzte Schüttelkolben {Sakaguchi-Kolben) mit einer Kapazität von 500 ml gegeben. Das in den Kolben befindliche Nährmedium wurde dann mit dem Bacillus ATCC 21593 geimpft, der in dem gleichen Nährmedium über Nacht vorgebrütet worden war und in

den Kolben 68 Stunden lang bei 37° C unter Schütteln gezüchtet wurde. Nach dem Entfernen der Zellen enthielt 1 ml dieses Kulturfiltrats 1900 Einheiten alkalischer Amylase.

Diese Kulturbrühe wurde gründlich abgekühlt. Dann wurden 3 Volumen Aceton zugesetzt, worauf das Enzym quantitativ ausfiel. Dieses FäHungsprodukt wurde mit Aceton gründlich gewaschen und luftgetrocknet. Von einem I iter der Kulturbrühe wurden etwa 11 g eines bräunlichen Pulvers erhalten.

Die auf diese Weise erhaltene Probe hat e^:nen optimalen pH-Wert von etwa 10,5 und stellt eine a'kalische Amylase mit einer spezifischen Aktivität ""V 170000 \Lg pro Gramm alkalische Amylase dar.

Beispiel 5

20 g Lösliche Stärke,

1 g K₂HPO₄,

5 g Hefeextrakt,
10 g Pepton und

025 g MgSO₄-7H₂O

wurden in 900 ml Wasser gelöst und 15 Minuten bei 115° C sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten bei 115° C sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Nährmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,3 erhalten.

Von diesem Nährmedium wurden 50 ml in abgesetzte Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben. Das in den Kolben befindliche Nährmedium wurde dann mit dem Bacillus ATCC 21595 geimpft, der über Nacht in dem gleichen Nährmedium vorgebrütet worden war und in den Kolben 68 Stunden lang bei 37° C unter Schütteln gezüchtet wurde. Nach dem Entfernen der Zellen enthielt ImI dieses Kulturfiltrats 1900 Einheiten alkalische A .nylase.

Diese Kulturbrühe wurde gründlich abgekühlt. Dann wurden 3 Volumen Aceton zugesetzt, worauf das Enzym quantitativ ausfiel. Dieses Fällungsprodukt wurde mit Aceton gründlich gewaschen und luftgetrocknet. Von einem Liter der Kulturbrühe wurden etwa 11 g eines bräunlichen Pulvers erhalten.

Die auf diese Weise erhaltene Probe hat einen optimalen pH-Wert von etwa 10,5 und stellt eine alkalische Amylase mit einer spezifischen Aktivität von 200000 μ§ pro Gramm alkalische Amylase dar.

Beispiel 6

20 g Lösliche Stärke,

1 g K₂HPO₄,

5 g Hefeexirakt,
10 g Pepton und
H

0,25 g MgSO₄-7H₂O

wurden in 900 ml Wasser gelöst und 15 Minuten be: 115° C sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten bei 155° C sterilisiert. Dur-jh Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Nährmedi¹. >a mit einem pH-Wert von etwa 10,3 erhalten.

Von diesem Nährmedium wurden 50 ml in ab gesetzte Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben. Das in den Kolben befindliche Nährmedium wurde dann mit dem Bacillus ATCC 21594 geimpft, der in dem gleichen Nährmedium über Nacht vorgebrütet worden war und in den Kolben 68 Stunden lang bei 37°C unter Schütteln gezüchtet wurde. Nach dem Entfernen der Zellen enthielt 1 ml dieses Kulturfiltrats 2100 Einheiten alkalische Amylase.

Diese Kulturbrühe wurde gründlich abgekühlt. Dann wurden 3 Volumen Aceton zugesetzt, worauf das Enzym quantitativ ausfiel. Dieses Fällungsprodukt wurde mit Aceton gründlich gewaschen und luftgetrocknet. Von einem Liter der Kulturbrühe warden etwa Hg eines bräunlichen Pulvers erhalten.

Die auf diese Weise erhaltene Probe hat einen optimalen pH-Wert von etwa 10,5 und stellt eine alkaiische Amylase mit einer spezifischen Aktivität von 220 000 μg pro Gramm Amylase dar.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von alkalischer Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus ATCC 21591, Bacillus ATCC 21592, Bacillus ATCC 21593, Bacillus ATCC 2ί594, Bacillus ATCC 21595 oder Bacillus ATCC 21596 in einem für die Züchtung von Bacillus-Stämmen üblichen carbonathaltigen und alkalischen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen aerob züchtet.