DE2502706A1

DE2502706A1 - Verfahren zur herstellung von 7-amino-cephem-verbindungen

Info

Publication number: DE2502706A1
Application number: DE19752502706
Authority: DE
Inventors: Tadashiro Fujii; Tetsuo Matsuda; Kunio Matsumoto; Masataka Morishita; Yuzo Shibuya; Mitsuru Tukushima; Tsutomu Yamaguchi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1974-01-23
Filing date: 1975-01-23
Publication date: 1975-09-25
Also published as: SE405361B; JPS50101584A; BE824681A; JPS5417032B2; DE2502706C2; US3960662A; ATA50075A; CH613973A5; SE7500607L; GB1490634A; AT341668B; HU169942B

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. "Weicxmakn, 2 j U Z / υ

Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke HATE/MY Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 820

MÖHLSTRÄSSE 22, RUFNUMMER 4839 21/22

<983921/22>

TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA, 632-1, Mifuku, Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken / Japan

Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen aus 7-subst.-Cephem-Verbindungen durch enzymatische Einwirkung von Kulturen, die aus den Mikroorganismen Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 oder Pseudomonas ovalis ATCC 950 stammen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein mikrobiologisches Herstellungsverfahren von 7-Arainocephem-Verbindungen der Formel

CI)

ί COOH

worin

X ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Acetoxy- oder nukleophile Restgruppe bedeutet, _:

aus Cephalosporinanalogen. ,

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Es wurde gefunden, daß ein Mikroorganismus, der zum Genus Comamonas Stamm SY-77-1 gehört und der aus Bodenproben abgetrennt wurde, eine Aktivität besitzt, um 7-Amino-cephem-Verbindungen aus einer Verbindung der Formel

-COMH ' ^X

₀).

²³ ' ' CD

0* T ^CH2^X COOH

herzustellen, worin

R eine -COOH- oder -COCOOH-Gruppe bedeutet und X die oben gegebene Bedeutung besitzt,

wobei die Amidbindung davon gespalten wird.

Der oben beschriebene Mikroorganismus besitzt die folgenden taxonomisehen Eigenschaften:

A. Morphologie:

Bouillon-Agar-Schrägkulturen wurden bei 30⁰C optisch und durch das Elektronenmikroskop geprüft.

(1) Form und Größe: kurzer Stab mit runden Enden,

0,1 bis 0,3 x 0,3 bis 0,5/u

(2) Metamorphose: einfache oder kurze Kette, keine Kapseln

(3) Motilität: ja, geißelartig

(4) Sporen: keine Sporulation

(5) Gramfärbung: negativ

(6) Säurebeständxgkeit: negativ

B. Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien: (1) Bouillon-Agarplatte (30⁰C, 24 Stunden):

die Kolonie ist rund, konvexes Wachsen, glatte Oberfläche, wellige Kanten, weiß bis etwas gelblich-weiß, etwas klebrig, durchscheinend bis opak, keine Dispersion.

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(2) Bouillon-Agarschrägplatte (30⁰C, 24 Stunden):

gutes Wachstum, lineares Wachstum, glatte Oberfläche, glänzend, feucht, trübe bis schwach gelblich-weiße Oberfläche, durchscheinend bis opak, Medium keine Farbänderung.

(3) Bouillon (3O⁰C, 1 bis 3 Tage):

einheitlich trübe, Spurenausfällung, fadenartige Suspension beim Schütteln, kein Film und Ring.

(4) Bouillon-Gelatine-Ausstich (30⁰C, 24 Stunden):

lineares Wachstum längs der Ausstichlinie, insbesondere in der Mitte bis zum Boden.

(5) Sojabohnen-Agarsehrägkultur (30⁰C, 24 Stunden):

gutes V/achstum, gleich wie auf Bouillon-Agar, glatte Oberfläche, glänzend.

(6) Kartoffel-Agarschrägkultur:

gutes Wachstum, weiße Kolonieoberfläche, glatte Oberfläche, etwas klebrig, durchscheinend bis opak, feucht, glänzend, keine Pigmentbildung. ■

(7) Lackmusmilch (30⁰C, 25 Tage): ' fast keine Verflüssigung.

(8) Glucose-Bouillon-Agarschrägkultur (30⁰C, 24 Stunden): besseres Wachstum, verglichen mit der Bouillon-Agarschrägkultur, etwas klebrig.

(9) Glucosenitrat-Agar-Schrägkultur (30°C, 1 bis 3 Tage): fast kein Wachstum. .

(10) Tyrosin-Agarschrägkultur (30⁰C, 48 Stunden): Wachstum, Medium wird leicht braun.

(11) Mannit-Hefeextrakt-Agarplatte (30⁰C, 48 Stunden): gutes Wachstum, weiß bis schwachgelb, glatte Oberfläche, feucht, konvex, Medium keine Farbänderung. .

(12) Bouillon-Agarplatte, 7% NaCl zugegeben (30°C, 10 Tage): fast kein Wachstum.

•609839/0978 * '' ■

(13) Glycelin bzw. Glycerin-Pepton-Agarplatte (3O°C, 3 Tage): gutes Wachstum, glatte Oberfläche, glänzend, konvex, Medium wird braun.

(14) Milch-Agarplatte (3O°C, 5 Tage): keine Caseinhydrolyse.

(15) Taurocholat-Agarplatte (30⁰C, 15 Tage): kein Wachstum.

C. Physiologische Eigenschaften:

(1) Nitratreduktion:

(2) Denitrifikation:

(3) Methylrot-Test: - (gelb)

(4) Voges-Proskauer-Reaktion: +

(5) Indolbildung:

(6) Hydrogensulfatbildung:

(7) Stärkehydrolyse:

(8) Verwendung von Citrat: +

(9) Verwendung einer anorganischen

Stickstoffquelle: keine Verwendung v.Nitrat

(10) Pigmentbildung: hängt vom Medium ab

(11) Urease:

(12) Oxidase: +

(13) Catalase +

(14) Gelatineverflüssigung:

(15) Argininhydrolyse:

(16) Gluconatoxydation:

(17) Wachstumsbereich:

Wachstum: pH 5 bis 12, 5 bis 42°C optimales Wachstum: pH 7,0 bis 8,5, 28 bis 35°C

(18) aerob oder anaerob: aerob

(19) O-F-Test: keine Änderung beim 0-

Typ- und F-Typ-Test

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(20) Fermentation von Kohlenhydraten:

Säurebildung Gasbildung

L-Arabinose

D-Xylose

D-Glucose - -

D-Mannose - -

D-Fractose - -

D-Galactose - -

Maltose - -

Saccharose

Lactose - -

Treharose - -

Sorbit - -

Mannit - -

Inosit - -

Stärke - -

Wurden die taxonomisehen Eigenschaften des Mikroorganismus Stamm SY-77-1 mit den oben erwähnten mycologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf das "Manual for the Identification of Medical Bacteria" von Cowan und Steel (Ed. 1965) und "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (7.Ed. 1961) geprüft und mit Typkulturen der entsprechenden Stämme verglichen, so wurde er als Stamm identifiziert, der zu dem Genus Comamonas gehört. Die Anmelderin hat daher den Stamm SY-77-1 mit einem Kulturtyp verglichen, der von American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich ist, und erkannt, daß der Stamm ähnlich ist wie Comamonas terrigena, das er sich aber in einer Hinsicht unterscheidet, nämlich der Stamm SY-77-1 besitzt eine stärkere Aktivität, um eine Amidbindung der Verbindung (II) zu spalten.

Aus dem Obigen ist erkennbar, daß der Stamm SY-77-1 ein neuer Stamm ist, der zu dem Genus Comamonas gehört und als Comamonas sp. SY-77-1 bezeichnet wird. Dieser Stamm wurde unter der

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Nummer "FEIM-P 2410" im Research Institute for Microbiological Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, und ebenfalls im US Department of Agriculture, ARS, Northern Utilization Research and Development Division hinterlegt und erhielt die numerische Bezeichnung "NRRL".

Es wurde gefunden, daß Pseudomonas ovalis ATCC 950 die gleiche Aktivität aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der Formel [I] (die im folgenden als "Aminoverbindung [I]" bezeichnet wird), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der Formel [II] durch Behandlung in Anwesenheit eines wäßrigen Mediums mit einer mikrobischen Kultur oder Präparation davon entacyliert, die eine Aktivität besitzt, um die Verbindung [II] zu entacylieren und eine Verbindung der Formel [i] zu bilden und aus einer Kultur von einem Mikrobenstamm herrührt, der Entacylierungsenzyme bilden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein mikrobiologisches neues Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen aus analogen Verbindungen des Cephalosporins C zu schaffen. Dabei sollen wichtige Zwischenprodukte für die Herstellung von pharmazeutisch wertvollen Cephalosporinderivaten gebildet werden.

Bei der erfindungsgemäßen Entacylierungsreaktion können Mikroorganismen, die zum Genus Comamonas oder zum Genus Pseudomonas gehören und die Entacylierungsaktivität besitzen und die Verbindung [i] aus der Verbindung [II] bilden können, verwendet werden.

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Um eine höhere Aktivität für die Herstellung der Aminoverbindung [I] aus der Verbindung [II] zu erhalten (im folgenden wird diese Aktivität als "N-Entacylierungsaktivität" bezeichnet), können bekannte Mutationsverfahren für die Behandlung von Bakterien wie die selektive Behandlung von Stämmen- durch Ultraviolett-, Röntgenstrahlen und mutagene Mittel verwendet werden und Auswahl der Medien und der Fermentationsbedingungen kann auf geeignete Weise erfolgen.

Beispiele von Mikroorganismen, die N-Entacylierungsaktivität besitzen und zuvor erwähnt wurden, sind:

Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 und Pseudomonas ovalis ATCC 950

Die Bildung einer Aminoverbindung [i] unter Verwendung der Mikroorganismen mit einer N-Entacylierungsaktivität kann erreicht werden, indem man die Mikroorganismen züchtet und die Verbindung [II] mit der Mikrobenkultur oder Präparation davon behandelt. ■

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt vorteilhafterweise bei aeroben Bedingungen, mehr bevorzugt in einer untergetauchten Belüftungskultur. Nährmedien können umfassen eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, eine assimilierbare Quelle für Stickstoff und Salze. Die Kulturtemperatür beträgt bevorzugt 25 bis 37°C und die Kulturzeit beträgt im allgemeinen 2 bis 10 Tage und zu dem Zeitpunkt, wenn die N-Entacylierungsaktivität das Maximum erreicht, sollte die Kultivierung natürlich beendet werden.

Die so erhaltene Mikrobenkultur oder Präparation davon kann zur N-Entacylierungsreaktion von Verbindungen [II] verwendet werden. Die Herstellung der Mikrobenkultur bringt mit sich, daß die behandelte, gezüchtete Masse eine verbesserte N-Entacylierungsaktivität für die bevorzugte Bildung der Aminoverbindung [i] besitzt, und beispielsweise können, bedingt durch

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die endo-enzymatische Eigenschaft der N-Entacylierungsaktivität, gewaschene Mikrobenzellen, die aus der Kulturmasse gesammelt werden, ein zellfreier Extrakt wie gemahlene oder beschallte Zellen, Zell-Lysat, das mit Pufferlösungen oder Cetylpylidiniumchlorid behandelt wurde, gereinigtes oder teilweise gereinigtes N-Entacylierungsenzym, erhalten von ' dem zellfreien Extrakt nach bekannten Verfahren wie Aussalzen, Chromatographie o.a., immobilisierte Enzympräparationen oder Mikrokapseln, die Mikrobenzellen oder Präparationen davon enthalten, verwendet werden und diese besitzen N-Entacylierungsaktivität.

Die Mikrokapseln besitzen bevorzugt eine dreidimensionale Struktur (Gelstruktur) und enthalten semipermeables Membranwandpolymer, welches die N-Entacylierungsaktivität nicht inaktiviert und die Kernsubstanz der aktiven N-Entacylierungsaktivitätspräparation umhüllt.

Beispiele von Einkapselungsverfahren sind beispielsweise das Düsenverfahren, wobei die Kernsubstanz in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst oder dispergiert wird und wobei das Polymer, das die semipermeable Membranwand bildet, in wäßrigem Medium gelöst wird (japanische Offenlegungsschrift 49-25128); ein komplexes Emulsionsverfahren in wäßrigem Vehiculum, bei diesem Verfahren wird das Wandpolymer in einem Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, gelöst, welches einen Siedepunkt besitzt, der niedriger ist als der von Wasser,und einen Dampfdruck, der höher ist als der von Wasser, wobei das Lösungsmittel die N-Entacylierungsaktivität nicht zerstören darf, und anschließend wird eine Kernsubstanz darin dispergiert und die dispergierte Lösung wird in eine wäßrige Lösung getropft oder darin suspendiert, die ein oberflächenaktives Mittel oder Schutzkolloid enthält, und dann wird das Lösungsmittel entfernt, wobei Mikrokapseln gebildet werden (publizierte japanische Patentanmeldung 47-43803, japanische Offenlegungsschrift 49-49679); oder

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durch Mikroeinkapselung, wobei das Lösungsmittel aus einer Nicht-Lösungsmittelemulsion entfernt wird, beispielsweise wird eine Kernsubstanz in einem organischen Lösungsmittel dispergiert oder gelöst, nachdem das Wandpolymer gelöst ist, und dann wird die Lösung in einem Träger emulgiert, der mit dem Lösungsmittel für die Wandpolymerlösung schlecht mischbar ist, so daß eine Emulsion erhalten wird, und zu der Emulsion wird ein Nicht-Lösungsmittel für das Wandpolymer zugegeben, das Nicht-Lösungsmittel für das Wandpolymer,... das NichtLösungsmittel sind mit dem Lösungsmittel für das Wandpolymer mischbar, jedoch unmischbar oder schlecht mischbar mit dem Vehiculum,und dabei werden Mikrokapseln gebildet, wobei die N-Entacylierungsaktivität nicht verschlechtert wird (FR-PS 2 166 062); und das Komplexemulsionsverfahren in einem lipophilen Vehiculum, beispielsweise wird das Wandpolymer unter Verwendung eines Lösungsmittels gelöst, wobei das Lösungsmittel mit dem Vehiculum schlecht mischbar ist, mischbar mit Wasser ist und einen Siedepunkt besitzt, der niedriger ist als der von Wasser, und die N-Entacylierungsaktivität nicht zerstört. Dann wird die Kernsubstanz in der Lösung gelöst oder dispergiert und diese Dispersion wird in einem Vehiculum, das flüssiges Paraffin oder ein Silikonöl enthält, emulgiert und dann wird das organische Lösungsmittel entfernt, wobei Mikrokapseln erhalten werden (US-PS 3 714 065).

Die N-Entacylierungsreaktion der Verbindung [II] erfolgt Im allgemeinen in wäßrigem Medium, bevorzugt bei einem pH-Wert von 6 bis S. Alternativ können wasserunlösliche Mikrobenzellen oder Präparationen davon in Form einer Suspension oder in Form einer Säule verwendet werden, wobei die Verbindung [II], die N-entacyliert werden soll, in wäßriger Lösung der Verbindung [il] durch die Säule geleitet wird.

Die Umsetzungszeit beträgt im allgemeinen 3 bis 30 Stünden und sollte beendigt werden, wenn die Bildung der Aminoverbindung [i] ihr Maximum erreicht hat. Die Reaktionstemperatur kann

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von 20 bis 45⁰C, bevorzugt 30 bis 37°C, betragen. Die Substratkonzentration hängt von der N-Entacylierungsaktivität ab und kann im allgemeinen 0,1 bis 5% betragen.

Die Ausgangsmaterialien der Formel [II] der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel [II], die eine COOH-Gruppe als R aufweist, aus einer Verbindung der Formel

-ooc *.

. CH(CH₉),CONH HN/ ^{2 3}

hergestellt werden, worin X die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, oder aus einem Salz davon durch Einwirkung von D-Aminosäureoxydase, die von den Mikroorganismen Trigonopsis variabiris usw. stammt, bei aeroben Bedingungen (GB-PS 1 272 769);die Verbindung [III] oder ein Salz davon wird mit aktivierten Zellen von Trigonopsis variabiris oder Fusarium sp. (japanische Offenlegungsschrift 47-39595 und japanische Patentanmeldung 49-117,205) behandelt. Die Verbindung [il] mit einer -COCOOH-Gruppe als R kann aus der Verbindung [ill] in Anwesenheit von Catalase-Aktivität und D-Aminosäureoxydase-Aktivität hergestellt werden.

Der Substituent X in der Formel [II] bedeutet ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, Acetoxygruppe oder eine nukleophile Restgruppe und diese Gruppe kann aus Cephalosporin C nach bekannten Verfahren gebildet werden. Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel [Hl] mit einem Wasserstoffatom in der Gruppe X durch katalytische Reduktion in Anwesenheit von Palladium-Kohle hergestellt werden (US-PS 3 124 576); eine Verbindung der Formel [III] mit einer Hyxroxygruppe in der Gruppe X kann durch Einwirkung von Esterase hergestellt werden (publizierte japanische Patentanmeldung 42-7553); eine Verbindung der

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Formel [III] mit einer nukleophilen Restgruppe in der Gruppe X kann durch Behandlung mit einem schwachen basischen heterocyclischen tertiären Amin wie Pyridin (publizierte japanische Patentanmeldung 38-26179) oder nach anderen bekannten Verfahren (publizierte japanische Patentanmeldungen 39-17926, 41-4714, 43-5010, 42-1305, 46-14735, 46-13025, 46-15951 und 40-9155) hergestellt werden.

Die Verbindung [IIj kann in Form eines wasserlöslichen Salzes wie eines Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalzes verwendet werden. ■

Die so gebildete Aminoverbindung [ij kann nach bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden wie durch Säulenchromatographie, Ionenaustausch, Ausfällung o.a.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Untersuchungsverfahren für die Aminoverbindung [I]:

Aliquote Teile der Reaktionsmischung werden mit 1n HCl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und dann wird die Lösung dreimal mit der halben Menge an Butylacetat gewaschen und dann wird der pH-Wert der Lösung mit 1n NaOH auf 7,5 eingestellt. Eine aliquote Menge davon wird mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und mit Bacillus subtilis PCI 211 während 16 Stunden bei 37°C geprüft.

Dünnschichtchromatographie (TLC): Träger: mit Silikagel vorbeschichtet Entwickler I : n-BuOH:Essigsäure:Wasser (3:1:1)

II: n-BuOH:Essigsäure:Pyrddin:Wasser

(15:3:10:12)

III:n-Bu0H:Essigsäure formaldehyd:Wasser

(3:1:5:1)

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Beispiele 1 bis 5

100 ml eines wäßrigen Mediums (pH 10,0), welches 0,5% Fleischextrakt, V/a Pep ton, 0,1% Hefeextrakt, 0,05% Glutarsäure und 0,5% NaCl enthält, werden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, mit Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 inokuliert und dann unter RotationsschütteIn 8 Tage bei 30⁰C kultiviert. Nach der Kultivierung wird die kultivierte Brühe bei 12 000 U/min während 10 Minuten unter Kühlen zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu sammeln. Die Masse wird in 50 ml einer 0,1 Mol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Anschließend v/erden 50 ml . eines 0,1 Mol Phosphatpuffers (pH 7,0), die je 3% 3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamid)-ceph-3-em-4-carbonsäure enthalten, zugegeben und dann wird bei 37°C 10 Stunden inkubiert, wobei die Aminoverbindung [i] erhalten wird. Die Züchtung der Bakterien auf gleiche Weise wird wiederholt und alle folgenden Verbindungen werden damit inkubiert.

3-Methyl-7-(4-carboxybutanamid)-ceph-3-em-4-carbonsäure; 3-Hydroxymethyl-7-(4-carboxybutanamid)-ceph-3-em-4-carbonsäure;. N-[7-(4-Carboxybutanamid)-ceph-3-em-3-yl-methyl]-pyridinium-

4-carboxylat; und

7-(4-Carboxybutanamid)-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-thio-

methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure.

Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt, Bei- Aminoverbindung fll (R = COOH)

spiel	X	Bildungs-	-	Rf	TLC
		verhältnis, %	0,32
1	H	72	0,15	Lösungsmittelsvstem
2	-OCOCH₃	53	0,33
3	-OH	64	0,23
4	-ⁿS>	58	0,17
5	N-N ι Il It	50

I
I
II
III
I

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Die Aminoverbindungen wurden durch Dünnschichtchromatographie mit Ninhydrin-Entwickler, Ultraviolett- und Bioversuch identifiziert.

Beispiele 6 bis 9

Man arbeitet wie in den Beispielen 1 bis 5 beschrieben und ersetzt die 3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxy-butanamid)-ceph-5-em-4-carbonsäure und die anderen Verbindungen durch die folgenden Verbindungen und erhält die im folgenden aufgeführten Ergebnisse.

3-Methyl-7-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4-carbönsäure 3-Acetoxymethyl-7- (T-carboxy-S-oxopentanamido ) -ceph^-enl··^-

carbonsäurej

3-Hydroxymethyl-7-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4~

carbonsäure und

N-[7-(5-Carboxy-5-oxopentanamido)-ceph~3-em-3-yl-methyl]-■

pyridinium-4-carboxylat.

Bei	Aminoverbindung 11	X	Bildungs-	I (R =--C	OCOOH)
spiel		verhältnis		TLC
	H	65	R£	Lösungsmittelsystem
6	-OCOCH₃	50	0,32	I
7	-OH	58	0,15	I
8	-"©	52	0,34	II
9	spiele	10 bis 13	0,23	III
Bei

100 ml eines wäßrigen Mediums (pH 7,0), das 0,5% Fleischextrakt, -]% Pepton, O,1?o Hefeextrakt, 0,05% Glutarsäure und 0,5% NaCl enthält, werden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, 15 Minuten bei 120°C sterilisiert, mit Pseudomonas ovalis ATCC 950 inokuliert und unter Rotationsschütteln 8 Tage bei 30⁰C gezüchtet; nach dem Züchten wird die Kulturbrühe bei 12 000 U/min 10 Minuten unter Kühlen abfiltriert, um die Bakterienzellen zu sammeln. Die gezüchteten Zellen werden in

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50 ml eines 0,1 Mol Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert. Die Züchtung wird auf gleiche Weise wiederholt und Zellsuspensionen werden hergestellt. Die Zellsuspensionen werden bei 37°C 10 Stunden mit jeder der folgenden Substanzen (2% in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung) inkubiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle angegeben.

Verbindung [H]:

3-Methyl-7- (4-carboxybutanamido ) -ceph~3-em-4-carboxylat; 3-Hydroxymethyl-7- (4-carboxybutanamido ) -ceph-3-em-4~carboxylat'; 3-Acetoxymethyl-7- (4-carboxybutanamido ) -ceph-3-em-4-carboxylat; und

N- [7- (4-Carboxybutanamido) -ceph-3-em~3-yl-methyl ]-pyridinium-

4-carboxylat.

Bei	X	Aminoverbindung	III	TLC-
spiel			Lösungsmittelsystem
	H -OH -OCOCH_x	Rf	I II I
10 11 12	0,33 0,33 0,15

13 -N_V 0,22 III

Beispiel 14

Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 4 beschrieben gezüchtet, wobei man 6 1 Kulturbrühe erhält. Die Zellen werden mit einer Zentrifuge bei 12 000 U/min während 10 Minuten gesammelt und gewaschen. Die so erhaltenen Zellen werden in 0,1 Mol Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, um 300 ml Suspension herzustellen. Anschließend fügt man 15 ml Kation-oberflächenaktives Mittel hinzu, rührt 30 Minuten bei Zimmertemperatur, zentrifugiert bei 10 000 U/min während 10 Minuten, und man erhält 288 ml überstehendes Material.

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Das überstehende Material wird in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) unter Verwendung eines Cellophanrohrs bei 4°C während 48 Stunden dialysiert. 300 ml Dialysat mit einer N-Entacylierungsaktivität werden erhalten.

Das so erhaltene Dialysat kann ebenfalls als Präparation der Mikrobenkultur bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden und es kann als mikro-eingekapselte Präparation, als gepulverte Präparation, durch Trocknen,Lyophilisierung oder durch Ammoniumsulfat-Ausfällung hergestellt werden.

Pseudomonas ovalis kann ebenialls auf gleiche Weise behandelt werden. .

Beispiel 15

3 g Celluloseacetat (Triacetatform) werden in 100 ml Methylenchlorid gelöst. 3 g gezüchtete Zellen von Comamonas sp.-'SY-77-1 FERM-P 2410, erhalten auf gleiche Welse-wie in Beispiel 1, suspendiert in destilliertem Wasser, werden einheitlich darin dispergiert bzw. emulgiert. Die so erhaltene Emulsion wird gerührt, in 800 ml 2%iger wäßriger Gelatinelösung bei Zimmertemperatur dispergiert und weiter gerührt, bis das Methylenchlorid verdampft ist, wobei man Mikrokapseln erhält (Durchmesser 0,1 bis 0,3 mm), die Comamonas sp. SY-77-1 FERM^-P 2410 enthalten. Diese Mikrokapseln können zur Herstellung von Aminoverbindungen [i], wie es im folgenden näher erläutert wird, verwendet werden.

Beispiel 16 - _:

Beispiel 15 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß 2 g Celluloseacetat, 70 ml Methylenchlorid und 2 g Pseudomonas ovalis ATCC 950 verwendet werden. Man erhält -Mikrokapseln, die die Bakterien enthalten.

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Bei s pi el 17

Beispiel 15 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß 20 ml überstehendes Material mit einer N-Entacylierungsaktivität, v/ie es in Beispiel 14 erhalten wurde, anstelle von 3 g Comamonas-Zellen, suspendiert in 20 ml Wasser, verwendet wurden; man erhielt Mikrokapseln der gleichen Größe.

Beispiel 18

21,9 g (Feuchtgewicht) Mikrokapseln, erhalten wie in Beispiel beschrieben, werden in eine Säule mit Mantel (2 χ 9,6 cm, V = 30 ml) gegeben und mit 0,1 Mol Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. 840 ml Lösung von 3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamid) -3-cephem-4-carbonsäure in 0,1 Mol Phosphatpuffer (9,92 mg/ml) werden mit einer SV von ungefähr 0,4 eingefüllt. 865 ml Eluat, welches 7-ACA enthält, werden erhalten (Bildungsverhältnis 84,550 und dann auf 80 ml konzentriert, dann wird der pH-Wert auf 3,2 eingestellt. Das Konzentrat wird über Nacht bei 4⁰C stehengelassen, dabei fällt 7-ACA aus (Ausbeute 4,6 g, Reinheit 86,2%). '

Beispiel 19

Beispiel 18 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß Mikrokapseln, die Comamonas sp. SY-77-; FERM-P 2410 enthalten, durch Mikrokapseln, die Pseudomonas ovalis ATCC 950 enthalten, hergestellt wie in Beispiel 16, ersetzt werden und daß eine 1%ige * Lösung der im folgenden- angegebenen Verbindungen anstelle des Substrats in Beispiel 18 verwendet werden, um Aminoverbindungen [i] herzustellen.

Substanz Ausbeute an Verbindung [I]

3-Methyl-7-(4-carboxybutanamid)-3-cephem-

4-carboxylat 84,2%

3-Hydroxymethyl-7-(4-carboxybutanamid)-3-cephem-4-carboxylat 83,1%

N-[7-(4-carboxybutanamid)-3-cephem-3-ylmethyl-pyridinium-4-carboxylat 79,2%

S09839/Ö978

Beispiel 20

In Beispiel 18 werden die Mikrokapseln, die Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 enthalten, durch Mikrokapseln, die überstehendes Material mit einer N-Entacylierungsaktivität, erhalten in Beispiel 17, ersetzt und das Substrat wird durch eine 1%ige Lösung von 3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamid)-3-cephem-4-cärboxylat, 3-Methyl-7-(5-carboxy-5-oxopentanamid)-3-cephem-4-carboxylat und 3-Hydroxymethyl-7-(5-carboxy-5-oxopentanamid)-3-cephem-4-carboxylat ersetzt, vrobei man die Aminoverbindung [I] in Ausbeuten von 87,5%, 78,8% bzw. 79,5% erhält.

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Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der Formel

[i]

X ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, Acetoxygruppe oder eine nukleophile Restgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von Verbindungen der Formel

R-(CH ) -CONH

[II]

R eine -COOH- oder -COCOOH-Gruppe bedeutet,

mit einer Mikrobenkultur oder Präparation davon in wäßrigem Medium behandelt, die sich von Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 oder Pseudomonas ovalis ATCC 950 ableitet.

609839/0978