DE3018767A1

DE3018767A1 - Verfahren zur herstellung von isopenicillin n unter verwendung eines zellfreien pilzkultur-extraktes

Info

Publication number: DE3018767A1
Application number: DE19803018767
Authority: DE
Inventors: Jack E Prof Baldwin; Arnold L Prof Demain; Toshio Konomi
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1979-05-17
Filing date: 1980-05-16
Publication date: 1980-11-27
Also published as: JPS5629999A; GB2052486B; US4248966A; DE3018767C2; GB2052486A

Description

HOEGER, STELLRECHT & PARTNER

PATENTANWÄLTE UHLANDSTRASSE 14 c · D 7OOO STUTTGART 1 3018767

A 44 144 b Anmelderin:

t - 189 Massachusetts Institute of

12. Mai 1980 Technology

77 Massachusetts Avenue Cambridge, Massachusetts 02139 USA

Verfahren zur Herstellung von Isopenicillin N unter Verwendung eines zellfreien Pilzkultur-Extraktes

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zur Herstellung von Penicillin N aus dem Tripeptid £-(L-oC-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin (LLD) unter Verwendung eines zellfreien Pilzkultur-Extraktes als Katalysator.

Ein solches Verfahren ist aus dem Aufsatz von Fawcett et al "Synthesis of o~(oC-aminoadipyl)-cysteinvaline and its role in Penicillin Biosynthesis" in der Zeitschrift "Biochem. J." vol. 157 (1976), Seite 651, und aus der Vortragszusammenfassung "Aspects of Cephalosporin and Penicillin Biosynthesis" in dem von K.D. McDonald herausgegebenen Buch "Second Internat. Symp. Genetics of Industrial Microorganisms" (Academic Press, London, 1976) bekannt. Weiterhin ist in der US-Anmeldung Ser.No. 880 036 vom 17. März 1978 eine zellfreie Synthese von Cephalosporinen vorgeschlagen worden.

Die bekannten Verfahren sind jedoch nur für die Biosynthese von Penicillin N geeignet und können für die Herstellung von Isopenicillin N nicht angewendet werden.

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Das Isopenicillin N ist ein wasserlösliches Antibiotikum in Form eines ß-Lactams und hat die Struktur:

CH, COOH
J ι

S Ii
\ C=O

•V

HlT-C -(CH₂) ,-CH(HH₂) -COOH 0

Die Struktur des Isopenicillins N ist dabei identisch mit derjenigen des Penicillins N₇ nur weist die Aminoadipyl-Seitenkette beim Isopenicillin N L-Konfiguration und beim Penicillin N D-Konfiguration auf. Die beiden Antibiotika unterscheiden sich in ihrer Wirkung darin, daß das Penicillin N nur gegen gramnegative und das Isopenicillin N nur gegen grampositive Bakterienstämme wirksam ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde/ das bekannte Verfahren der eingangs genannten Art zum Herstellen von Penicillin N derart abzuwandeln, daß es für die Herstellung von Isopenicillin N und dessen Derivaten geeignet wird.

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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die folgenden Verfahrensschritte gelöst:

(1) als Ausgangsmaterial wird das Tripeptid LLD oder ein Derivat der Struktur

R₁ COOH
/

HS KN

C=O
R \ .

HN-C-R-COOK
0

verwendet, worin die Radikale -R, R- und R₂ gleich oder verschieden und aus einer Gruppe gewählt sind, die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl umfaßt, und das Radikal R₃ zu einer Gruppe gehört, die

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-(CH₂J₃-CH(NH₂)-, -(CH₂J₃-CHBr-, -(CH₂J₃-CH(N₃)-, -CH (NH₂) - (CH₂J₂-CH (NH₂) - , - (CH₂) ₂-CH (NH₂) - , - (CH₂)₄-CH(NH₂)-, -CH₂-S-CH₂-CH(NH₂)-, -CH₂-S-C(CH₃)₂-CH(NH₂) -, -CH(CH₃)-S-CH₂-CH(NH₂) und -(CH₂).- enthält,

(2) in einem zellfreien oder nur permeabllisierte Zellen enthaltenden Extrakt der Pilzkultur Cephalosporium acremonium werden vorbestimmte, erst in einem späteren Teil der Biosynthese wirksam werdende Enzyme inaktiviert, die eine Umwandlung über die Isopenicillin-Stufe hinaus bewirken würden,

(3) das Ausgangsmaterial und der insoweit inaktivierte Pilzkultur-Extrakt werden zusammen mit Adenosin-Triphosphat (ATP) als Energielieferant in einem Reaktionsgefäß vermischt und

(4) die Reaktionsbestandteile werden bis zur Bildung eines Isopenicillin-N-Derivats der Struktur

R, COOH

S N \ C=O

/y

HN-C-R₅-COOH

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in dem Reaktionsgefäß belassen.

Nach diesem Verfahren gelingt die Biosynthese von Isopenicillin N selbst/ sowie von einer großen Anzahl seiner Derviate - mit Ausnahme von Penicillin N - einfach, rasch und mit relativ hoher Ausbeute. Der Wirkungsmechanismus ist dabei grob gesagt so, daß sich das Tripeptid LLD unter Steuerung des Katalysators in Ringform anordnet. Diese Ringbildung erfolgt auch, wenn anstelle des LLD die erwähnten synthetischen ß-substituierten Derivate von L-Cystein und D-Valin und analogen Verbindungen der cC-Amino-Adipinsäure verwendet werden, wodurch ganz neuartige Isopenicillin-Derivate entstehen. Bei diesen analogen Verbindungen zur oC-Amino-Adipinsäure handelt es sich im wesentlichen im folgende:

HHHH
-CO-C-C-C-C - COOH OC-Aminoadipinsäure

IiII

HHH

HHHH

Ii(I

CO-C-C-C-C- COOH 2-Bromoadipinsäure

I ι I I

H H H Br

HHHH

III!

CO-C-C-C-C- COOH 2~Azidoadipinsäure 111!

HHHN-,

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- 10 -

HHHH

I ι I I

-CO-C-C-C-C- COOH

NH₂ H

NH 2,5-Diamxnoadipinsäure

- CO -

H H

I I

C-C

ι ι

H H

- COOH Glutamin s äure

-CO-

- CO -

H	H	H	H	H
I	I	I	I	I
C -		-C-	C -	C -
I	I	I	I	I
H	H	H	H
H		H	H
I		ί	I
C -	S	-C-	C -	COOH
I		I	I
H		H	NH₂
H		CH	H
I		I ³	I
C -	S	-C-	C -	COOH
I		I	I
H		CH₃	NH₂
H		H	H
I		I	I
C -	S	-C-	C -	COOH
I		I	I
CH.		H	NH^

- COOH cC~ Aminopimelinsäure

S - Carboxymethyl-Cystein

3,3-Dimethyl-S-Carboxymethyl-Cystein

5-Methyl-S-Carboxymethyl-Cystein

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HHHH

I I I I
-CO-C-C-C-C- COOH Adipinsäure,

I I I I

HH H H

sämtliche in L-Kondiguration.

Besonders einfach läuft das Verfahren ab, wenn die Radikale R, R₁ und R- Wasserstoff sind.

Nach einer anderen Ausgestaltung der Erfindung ist das Radikal R Wasserstoff, eines der Radikale R₁ und R Methyl und das andere Radikal aus der Gruppe gewählt, die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl umfaßt. Wenn dabei beide Radikale R₁ und R₂ die Methylgruppe sind, ergibt sich das Isopenicillin N selbst.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird das als Energielieferant dienende ATP durch ein Regeneriersystem erneuert, das einen Phosphatlieferanten und ein Phosphotransferase-Enzym enthält, wobei vorteilhafterweise der Phosphatlieferant Phosphoenolpyruvat und das Phosphotransferase-Enzym Pyruvatkinase ist. Die Reaktion läuft übrigens auch ohne Zugabe von ATP ab, doch ist dann die Ausbeute zu gering.

Der zellfreie oder permeabilisierte.Zellen enthaltende Pilzkultur-Extrakt kann auf mannigfaltige Weise erzeugt werden, beispielsweise durch Behandlung mit Dimethylsulfoxid, Benzol, Toluol, Triton X-100 usw., welche die Zellwände permeabel machen. Vorteilhafterweise wird

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er jedoch durch Behandeln der Pilzkultur Cephalosporium acremonium mit Zellwände lysiereiiden Enzymen erzeugt, wobei zweckmäßigerweise die lysierenden Enzyme Endo-ß-(1—5> 3) -Glukanase, Endo-ß-(1—^4)-Glukanase und Zymolyase enthalten. Die enzymatisch aktiven Fraktionen des Extraktes können dabei auch isoliert werden, wodurch ihre Aktivität erhöht und die Ausbeute an Antibiotika gesteigert werden kann.

Gemäß anderen Ausgestaltungen der Erfindung nach dem Hauptanspruch werden die Reaktionsbestandteile zur Beschleunigung der Sauerstoffübertragung in dem Reaktionsgefäß geschüttelt und mit Mannitol sowie Spuren von Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat versetzt und auf einen pH-Wert von ungefähr 7,2 gepuffert. Schließlich kann zum Inaktivieren der unerwünschten Enzyme der Pilzkultur-Extrakt vor dem Schritt (3) eine vorbestimmte Zeitspanne lang eingefroren und dann wieder aufgetaut werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen ausführlicher erläutert, wobei sich weitere Vorteile, Merkmale und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben.

Das Verfahren nach der Erfindung besteht darin, daß das Tripeptid LLD oder seine Derivate mit einem zellfreien Extrakt aus Cephalosphorium acremonium innig in Kontakt gebracht und in Gegenwart von ATP durch die Enzyme in dem Extrakt in ein Isopenicillin-Derivat umgewandelt wird. C. acremonium ist ein gut bekannter Mikroorganismus und in verschiedenen Kulturen bei der "American Type Culture Collection" erhältlich, beispielswsise UHtSr^- dem Namen

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ATCC 20 339 (Cephalosporium sp. Kultur F. 12), ATCC 14 553 (C. Acremonium) und ATCC 36 255 (Acremonium strictum). Das Verfahren nach der Erfindung kann auch mit sogenannten nicht produzierenden Mutanten von ATCC 36 255 ausgeführt werden, z.B. mit M-0198, M-0199 und M-1836. Diese Mutanten werden sehr frühzeitig blockiert, vermutlich bei der Bildung von LLD, und erzeugen daher in dem eigentlichen Kulturmedium keine Antibiotika. Jedoch können aus ihnen hergestellte Extrakte LLD in ein Antibiotikum überführen, so daß bei der Zugabe von LLD oder seiner Derivate Antibiotika erzeugt werden.

Gemäß einer bevorzugten Methode zum Herstellen des zellfreien Extraktes wird eine Protoplasmapille aus ganzen Zellen eines 40 bis 70 Stunden alten Myzels beispielsweise mit einem Präparat aus dem lythischen Enzym Cytophaga L 1 und Zymolyase-5000 behandelt. Anschließend wird die Suspension des Protoplasma zentrifugiert und vorsichtig homogenisiert. Eine zweite Zentrifugierung ermöglicht dann die Abtrennung der darüberstehenden Extraktflüssigkeit, die dann - nach Inaktivierung spät wirkender Enzyme - zur Erzeugung von Isopenicillin verwendet werden kann. Wenn eines der erwähnten Ausgangsmaterialien mit diesem zellfreien Extrakt und mit ATP vermischt wird, entsteht dann eine Lösung, die reich an Isopenicillin-Derivaten ist.

Dabei hat sich gezeigt, daß ständige Belüftung durch Schütteln und die Zufuhr von ATP, insbesondere mit einem zusätzlichen Regeniersystern für das ATP _f die Ausbeute an Isopenicillin erheblich steigert. Das ATP-Regeneriersystem besteht zweckmäßigerweise aus einem

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Phosphatlieferanten und einem Phosphotransferase-Enzym. Der bevorzugte Phosphatlieferant ist dabei Phosphoenolpyruvat und sein zugehöriges Phosphotransferase-Enzym Pyruvatkinase.

Es können jedoch auch andere Regeniersysteme aus Lieferant und Enzym verwendet werden. Zu diesen gehören beispielsweise Creatinkinase, Azetatkinase, Carbamatkinase/ Phosphoramidatkinase, Argininkinase-3-Phosphoglyceratkinase und Aspartatkinase und die zugehörigen Phosphatlieferanten Creatinphosphat, Azetylphosphat, Carbamylphosphat, Phosphoramidat, Argininphosphat/ L-3-Diphosphoglycerat und Asparty!phosphat. Da der Extrakt bereits etwas ATP enthält, werden geringe Mengen Antibiotika auch ohne Zusatz von ATP erzeugt.

Die tatsächliche Anwesentheit von Isopenicillin kann mit Hilfe von Mutanten der Bakterienkulturen Escheria coli (im folgenden mit Ess bezeichnet) oder Pseudomonas aeruginose (Pss) nachgewiesen werden (s. Agr. Biol. Chem. vol. 38 (9), (1974), 1761 bis 1752), die speziell gegenüber Antibiotika in Form von ß-Lactam äußerst empfindlich sind. Brauchbar für diesen Zweck ist auch Penicillinase (der Firma Difco Laboratories), ein Enzym, das die antibiotischen Eigenschaften sowohl von Isopenicillin N als auch von Penicillin N zerstört.

Es hat sich nun gezeigt, daß das nach dem erfinderischen Verfahren hergestellte Produkt antibiotische Eigenschaften gegenüber Ess und Pss aufweist und daher tatsächlich einen ß-Lactam-Bestandteil besitzt. Weiterhin wurde seine

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antibiotische Wirkung erwartungsgemäß durch Penicillinase zerstört. Es steht somit fest, daß ein ß-Lactam-Antibiotikum mit 5-gliedrigem Thiazolidinring vorliegt. Daß das erhaltene Produkt Isopenicillin und nicht Penicillin ist, wurde durch Vergleich der antibakteriellen Eigenschaften des Syntheseproduktes mit denjenigen bekannter Proben von Penicillin N und Isopenicillin N gegenüber grampositiven und gramnegativen Bakterien nachgewiesen.

Um Isopenicillin N gegenüber Penicillin N zu differenzieren, wurde die antibiotische Wirkung in vitro gegenüber zwei gramnegativen Bakterienstämmen (Salmonella typhimurium ATCC 13 311 und Pseudomonas aeruginose Pss) und gegenüber zwei grampositiven Bakterienstämmen (Staphylococcus aureus ATCC 25 923 und Sarcina lutea ATCC 9341) verglichen. Es ergab sich tatsächlich, daß Isopenicillin N gegenüber grampositiven Stämmen wirksamer ist als gegenüber gramnegativen, während Penicillin N gegenüber gramnegativen Stämmen wirksamer ist als gegenüber grampositiven Bakterien. Da das Syntheseprodukt der zellfreien Umwandlung von LLD deutlich aktiver gegenüber grampositiven Stämmen ist als gegenüber gramnegativen, handelt es sich also tatsächlich um Isopenicillin N.

Der zellfreie Extrakt enthält somit bestimmte Enzyme, die aus den genannten Ausgangsmaterialien Isopenicilline erzeugen können.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen die folgenden Beispiele, auf welche jeodoch die Erfindung keineswegs beschränkt ist:

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Herstellung des Extraktes;

Zunächst wurde eine Keimflüssigkeit hergestellt/ die pro Liter 30 g Maisaufschwemmung, 10 g Glucose, 30 g Stärke und 5 g Calciumcarbonat enthielt. 40 ml dieser Flüssigkeit wurden auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt. Dann wurde aus einer 1 ml-Pipette ein Tropfen Methyloleat hinzugefügt und der Kolben in einem Autoklaven sterilisiert. Nach Abkühlung wurde der Kolben mit 1 ml der Aufschwemmung von C. Acremonium geimpft, die durch Abernten des Myzels einer geneigten Kultur mit 5 ml sterilen Wassers erhalten wurde. Der geimpfte Kolben wurde dann 72 Stunden lang in einer· mit 250 Umdrehungen pro Minute auf einer Bahn mit 50 mm Durchmesser rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet. Diese Bouillon diente dann zum Impfen der weiter unten angegebenen eigentlichen Kulturflüssigkeit.

In den Beispielen wurde eine Mutante M-0198 des C. acremonium-Stammes CW-19 verwendet, die kein Penicillin N und kein Cephalosporium C durch Fermentation bilden kann. Der Stamm CW-19 wurde von der Firma Eli Lilly & Co bezogen und steht ohne Einschränkung als Acremonium Strictum.ATCC 36 255 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD. zur Verfügung. Die Mutanten M-0198 ist ohne Einschränkung unter der Bezeichnung Cephalosporium acremonium NRRL-11 418 bei dem Northern Regional Research Center des US-Dept. of Agriculture, Peoria, IL 61 604, erhältlich. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese spezielle Mutante von C. acremonium beschränkt. Der Mutterstamm ATCC 36 255 ist in der Lage, Isopenicillin zu erzeugen.

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Die Hauptkulturen von C. acremonium wurden bei 25 C in einer mit 250 Umdrehungen pro Minute rotierenden Schüttelvorrichtung in 250 ml-Kolben mit 40 ml-Proben folgender Zusammensetzung bebrütet:

36/0 g Sukrose,

27,0 g Glukose,

7,5 g Ammoniumsulfat,

1,5 g Oleinsäure,

7,5 ml Salzlösung Nr. 1,

135,0 ml Salzlösung Nr. 2,

3,0 g L-Methionin

1,0 1 Wasser.

Der pH-Wert wurde auf 7,3 bis 7,5 eingestellt. Die Salzlösung Nr. 2 bestand aus 20 g/l Ammonium-eisen(II) sulfat.6H₂O (Mohrsches Salz) und die Salzlösung Nr. aus

208,0 g K₃HPO₄,

204,0 g KH₃PO₄,

22,7 g Na₃SO₄-IOH₂O,

4,8 g MgSO₄-7H₂O,

1,0 g CaCl₂-2H₂O,

0,4 g ZnSO₄-7H₂O,

0,4 g MnSO₄-H₂O,

0,1 g CuSO₄-5H₂O.

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Das nach 40 bis 70 Stunden Fermentation aus 6 Kolben eingebrachte Myzel wurde gefiltert und zweimal mit 40 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das feuchte Myzel wurde wieder in 40 ml einer 0,05 M Zitrat-Phosphat-Pufferlösung nach Mcllvaine (pH 7,2) unter Zusatz von 0,01 M Dithiothreitol suspendiert und eine Stunde lang bei 28°C und 150 Umdrehungen pro Minute bebrütet. Nach erneutem Filtern und Waschen wurde das Myzel wieder in 40 ml der zuvor genannten Pufferlösung suspendiert, diesmal jedoch unter Zusatz von 1,0 M Natriumchlorid, 0,02 M Magnesiumsulfat, 160 mg eines lysierenden Präparates des lytischen Enzyms Cytophaga L 1 und 160 mg Zymolyase-5000 aus Arthrobacter. luteus.

Das Enzym Cytophaga L 1 wurde von der Firma BDH Chemicals, Poole, Dorset, UK bezogen und ist in den USA bei der Firma Gallard-Schlessinger Chem. Mfg. Corp., New York 11514, erhältlich. Seine Herstellung ist in der GB-PS 1 048 887 beschrieben. Das Präparat wurde ursprünglich von einer Mikroorganismen Kultur isoliert, die zunächst mit L 1 bezeichnet und dann als NCIB 9497 bei der National Collection of Industrial Bacterial in Aberdeen, Schottland, hinterlegt worden ist. Das lytische Enzym L 1 besitzt die Wirkung von Endo-ß-(1—^3)- und Endo-ß-(1—5» 4)-Glukanase (Biochemical J., Vol. 135 (1973), Seite 11).

Die Zymolyase-5000 wurde von der Kirin Brewery Co, Ltd., Takasaki, Japan, bezogen. Sie ist ein Enzympräparat einer Unterwasserkultur von Arthrobacter. luteus und löst die Zellwände lebender Pilzkulturen auf. In der bezogenen Form kann die Zymolyase-5000 neben dem lytischen Enzym

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noch ß-1,3-Glukanase (EC 3.2.1.39), Mannanase, Protease und Säure-Phosphatase enthalten (Arch. Biochem. and Biophys., Vol. 153 (1972), Seite 403).

Die Suspension wurde 3 Stunden lang bei 28°C unter Schütteln bei 120 Umdrehungen pro Minute bebrütet und dann 10 Minuten mit 800 g zentrifigiert. Die sich ergebende Protoplasmapille wurde zweimal mit 20 ml Tris¹ scher Pufferlösung (Ph 7,2, 0,05 M) unter Zusatz von 1,0 M Sucrose, 0,01 M Magnesiumsulfat und 0,01 M Kaliumchlorid gewaschen. Nach weiterem Zentrifugieren wurde die Pille vorsichtig bei 4 C in einem Teflonbehälter homogenisiert, mit 6 ml Tris"scher Pufferlösung, 0,65 M Manitol, 0,01 M Magnesiumsulfat und 0,01 M Kaliumchlorid zersetzt und abschließend 10 Minuten lang mit 1000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann gefroren und wieder aufgetaut. Sie bildet den zellfreien Extrakt für das Verfahren nach der Erfindung.

Beispiel 1;

5 Mikromol ATP, 10 Mikromol Phosphoenolpyruvat und 100 Mikrogramm Pyruvatkinase wurden drei Stunden lang bei 25°C und einem pH-Wert von 7,2 zusammen mit 100 Mikrogramm LLD und 1,0 ml des vorbeschriebenen Extraktes aus dem Mutanten M-0198 bebrütet. Das Reaktionsgemisch zeigte eine äquivalente antibiotische Aktivität von 2,3 Mikrogramm pro ml, bezogen auf das ß-Laktam-Antibiotikum Cephalosporin C als Normal, d.h. also 2,3 Einheiten pro ml. Dabei entspricht eine Einheit antibiotischer Aktivität einer keimfreien Zone gleicher Größe, wie sie 1 mg des Cephalosporin C zeigt.

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Das Produkt zeigte keine antibiotischen Zonen, wenn der Probe Penicillinase zugefügt wurde, was darauf hinweist, daß ein Antibiotikum vom Penicillin- oder Isopenicillin-Typus hergestellt worden ist.

Beispiel 2:

Die Versuchsbedingungen waren wie in Beispiel 1, nur wurden unterschiedliche LLD-Konzentrationen verwendet und jeweils nach 0, 1/4, 1/2, 3/4, 1, 2, 3 und 5 Stunden Proben entnommen. Dabei, ergaben, sich ohne Zugabe von LLD keine antibiotischen Zonen und bei 50, 100 und 200 Mikrogramm LLD pro ml maximale antibiotische Zonen von 0,7 bzw. 1,2 bzw. 1,6 Einheiten pro ml. Die antibiotische Aktivität steigt also mit der Konzentration des Substrates an.

Beispiel 3;

Der zellfreie Extrakt von Beispiel 2 wurde jeweils zwei Tage lang gefroren und dann aufgetaut. Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 ergaben sich ohne LLD-Zugabe keine antibiotische Zone und für 0, 50, 100, 200, 400 und 800 Mikrogramm pro ml LLD jeweils 1, 1,5, 2,0, 2,2 bzw. 2,2 Einheiten pro ml maximale antibiotische Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, daß die antibiotische Aktivität beim Eingefrieren stabil geblieben ist.

Beispiel 4:

Der zellfreie Extrakt vom Beispiel 2 wurde zehn Tage lang eingefroren, aufgetaut und dann jeweils mit und ohne Schütteln und mit und ohne ATP-Regeneriersystern

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untersucht. Ohne LLD-Zugabe zeigt sich wieder keine Aktivität und bei 200 Mikrogramm LLD pro ml folgendes Verhalten:

Mit Energieerzeugungssystem und ohne Schütteln sowie Schütteln bei 120 und 140 Umdrehungen pro Minute ergab sich eine maximale antibiotische Aktivität von 1/7 bzw. 2,5 bzw. 2,5 Einheiten pro ml und mit Schütteln bei 240 Umdrehungen pro Minute stieg die Aktitität von 2 Einheiten pro ml ohne Regeneriersystem auf 2,5 Einheiten pro ml mit Regeneriersystem an. Die Ergebnisse zeigen,, daß ein Schütteln und die Anwendung des Energieregeneriersystems ein deutliches Ansteigen der Aktitität zur Folge haben.

Beispiel 5:

Der zellfreie Extrakt von Beispiel 2 wurde 15 Tage lang eingefroren, aufgetaut und dann mit unterschiedlichen Konzentrationen verwendet sowie auch gekocht. Ohne LLD-Zugabe ergab sich keine antibiotische Zone und bei 200 Mikrogramm LLD pro ml folgendes Verhalten:

Bei 0 und 0,2 ml Extrakt zeigten sich keine antibiotischen Zonen und bei 0,4, 0,6 und 0,8 ml Extrakt 1,1 bzw. 1,4 bzw. 1,7 Einheiten antibiotischer Aktivität. Bei Zugabe von 0,8 ml Extrakt, der 5 Minuten lang gekocht wurde, war keine antibiotische Aktivität mehr festzustellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität mit steigender Konzentration des Extraktes ansteigt und durch Kochen zerstört wird.

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Beispiel 6:

Zellfreie Extrakte von C. acremonium M-0198 wurden wie in Beispiel 1 erzeugt, nur wurden die Kulturen unterschiedlich lange wachsen gelassen. Es wurden 200 Mikrogramm LLD pro ml hinzugefügt und das Brüten dauerte eine Stunde. Es zeigte sich folgendes Verhalten:

Bei einem Alter der Kultur von 44, 56 und 68 Stunden betrug die antibiotische Aktivität 5,3 bzw. 1,8 bzw. 2,2 Einheiten pro ml. Diese Ergebnisse zeigen, daß 44 Stunden alte Kulturen mehr aktiven Wirkstoff aufweisen als- ältere Kulturen.

Beispiel 7:

Ein zellfreier Extrakt von C. acremonium M-0198 wurde wie in Beispiel 1 hergestellt und einmal mit 200 Mikrogramm LLD pro ml und zum anderen mit 100, 200, 400 und 800 Mikrogramm pro ml des Tripeptids O-(L-oC-aminoadipyl) ■ L-cysteinyl-L-valin (LLL) versetzt. Während sich bei dem LLD eine antibiotische Aktivität von 1,5 Einheiten pro ml zeigte, ergab sich bei allen LLL-Proben keine antibiotische Wirkung. Diese Ergebnisse zeigen, daß LLL nicht in ein Antibiotikum umgewandelt wird.

Beispiel 8:

Ein zellfreier Extrakt aus C. acremonium M-0198 wurde wie in Beispiel 1, jedoch mit einer Wachstumszeit von 48 Stunden hergestellt und sodann eine Stunde lang unter Zusatz von 200 Mikrogramm LLD pro ml sowie ATP und dessen Regeneriersystem bebrütet. Die antibiotische Wirkung betrug dann 5,5 Einheiten pro ml. Das Reaktions-

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produkt wurde dann in vitro mit authentischem Penicillin N und Isopenicillin N an je 2g positiven und 2 g negativen Kulturen verglichen. Die Aktivität der authentischen Antibiotika war dabei gemäß der chemischen Analyse des ß-Lactam-Ringes, der Hydroxylaminprobe, auf 5 Mikrogramm pro 5 ml eingestellt. Bei Anwesenheit von 10 Mikrogramm Penicillin N bzw. Isopenicillin N pro ml zeigten sich bei den grampositiven Kulturen Staphylococcus aureus ATCC 25 923 und Sarcxna lutea ATCC 9341 antibiotische Zonen nur bei Isopenicillin N und beim Reaktionsprodukt/ nicht dagegen beim Penicillin N; und bei den gramnegativen Kulturen Salmonella typhimurium ATCC 13 311 und Pseudomonas aeruginosa Pss ergaben sich antibiotische Zonen nur beim Penicillin N, nicht dagegen beim Isopenicillin N und beim Reaktxonsprodukt. Diese Ergebnisse zeigen, daß bei den verwendeten Konzentrationen das Reaktxonsprodukt in seiner antibiotischen Aktivität nicht dem Penicillin N nachschlägt, sondern ganz deutlich dem Isopenicillin N.

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Claims

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Patentansprüche

i) Verfahren zur Herstellung von Penicillin N aus dem Tripeptid ö - (L-oC-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin (LLD) unter Verwendung eines zellfreien Pilzkultur-Extraktes als Katalysator,

gekennzeichnet, für die Herstellung von Isopenicillin N, durch folgende Abwandlung:

(1) als Ausgangsmaterial wird das Tripeptid LLD oder ein Derivat der Struktur

R₁ COOH

Γ /

HS HK

C=O

/V

■ EL^T-C-R_Z-COOH
Il J

— 0 —

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verwendet, worin die Radikale R, R₁ und R₂ gleich oder verschieden und aus einer Gruppe gewählt sind, die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl umfaßt, und das Radikal R₃ zu einer Gruppe gehört, die

-(CH₂J₃-CH(NH₂)-, -(CH₂J₃-CHBr-, -(CH₂J₃-CH(N₃)-,

-CH (NH₂) -(CH₂) ₂-CH(NH₂)-, -(CH₂J₂-CH(NH₂)-,

- (CH₂)₄-CH(NH₂)-, -CH₂-S-CH₂-CH(NH₂) -,

-CH₂-S-C(CH₃)₂-CH(NH₂) -, -CH(CH₃)-S-CH₂-CH(NH₂) -

und -(CH₂J₄- enthält,

(2) in einem zellfreien oder nur permeabilisierte Zellen enthaltenden Extrakt der Pilzkultur Cephalosporium acremonium werden vorbestimmte, erst in einem späteren Teil der Biosynthese wirksam werdende Enzyme inaktiviert, die eine Umwandlung über die Isopenicillin-Stufe hinaus bewirken würden,

(3) das Ausgangsmaterial und der insoweit inaktivierte Pilzkultur-Extrakt werden zusammen mit Adenosin-Triphosphat (ATP) als Energielieferant in einem Reaktionsgefäß vermischt und

(4) die Reaktionsbestandteile werden, bis zur Bildung eines Isopenicillin-N-Derivats der Struktur '

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R, COOH

C=O

/γ

HN-C-R-COOH

Il *
0

in dem Reaktionsgefäß belassen.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Redikale R, R₁ und R« Wasserstoff sind.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Radikal R Wasserstoff, eines der Radikale R₁ und R₂ Methyl und das andere Radikal aus der Gruppe gewählt ist, die Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl umfaßt.
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das als Energielieferant dienende ATP durch ein Regeneriersystem erneuert wird, das einen Phosphatlieferanten und ein Phosphotransferase-Enzym enthält.

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5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet/ daß der Phosphatlieferant Phosphoenolpyruvat und das Phosphotransferase-Enzym Pyruvatkinase ist.
6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der zellfreie oder nur permeabilisierte Zellen enthaltende Pilzkultur-Extrakt durch Behandeln der Pilzkultur Cephalosporium acremonium mit Zellwände lysierenden Enzymen erzeugt wird.
7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die lysierenden Enzyme Endo-ß -(1—* 3)-Glukanase, Endo-ß-(1—> 4)-Glykanase und Zymolyase enthalten.
8) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbestandteile zur Beschleunigung der SauerstoffÜbertragung in dem Reaktionsgefäß geschüttelt werden.
9) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbestandteile mit Mannitol sowie Spuren von Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat versetzt und auf einen pH-Wert von ungefähr 7,2 gepuffert werden.
10) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Pilzkultur-Extrakt vor dem Schritt (3) eine vorbestimmte Zeitspanne lang eingefroren wird.

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