DE2428957C2 - Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C - Google Patents

Description

in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare

IO

15

20 Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält, so lange züchtet, bis Desacetoxycephalosporin C sich in wesentlicher Menge in der KulturbrShe angereichert hat, worauf man das Desacetoxycephalosporin C aus der durch Zentrifugieren oder Filtrieren vom Mycel befreiten Kulturbrühe durch Fraktionierung unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Chromatographie auf Ionenaustauschharz, Aktivkohle, Cellulose, Kieselgel und Gelfiltration isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Züchten der genannten Stämme der Gattungen Cephalosporium oder Emericellopsis ein Kulturmedium einsetzt, dem 0,01 bis 2,0% Methionin zugegeben sind, und beim Züchten der genannten Stämme der Gattungen Paecilomyces, Arachnomyces, Anixiopsis oder Spiroidium ein Nährmittel, dem 0,01 bis 1,0% Cystein und/oder Cystin zugegeben sind.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C, wobei in der nachfolgenden Beschreibung und in den Ansprüchen das Desacetoxycephalosporin C und/oder dessen Salze, soweit nichts anderes angegeben wird, aus Zweckmäßigkeitsgründen als DACPC bezeichnet werden.

DACPC stellt als solches ein wertvolles Antibiotikum da/ und kann als Ausgangsverbindung für die Herstel-

HOOC —CH- (CHj)₅-C-NH-C C

NH₂

C⁴—N⁵ lung von Cephalosporinantibiotika, wie z. B. Cephalexin, für die orale Verabreichung verwendet werden.

Solche Antibiotika sind für klinische Zwecke sehr wertvoll, weil sie bei bestimmten Infektionen hervorragende Wirkungen gegen grampositive und gramnegative Bakterien und auch hervorragende Wirkungen bei Infektionen durch gegen verschiedene Antibiotika resistente Bakterien besitzen. DACPC besitzt in der freien Form die folgende Formel:

COOH

Das Überführen von DACPC in Cephalexin kann so durchgeführt werden, daß man den a-Aminoadipinsäurerest chemisch vom DACPC abspaltet, wobei man die 7-AminodesacetoxycephaIosporansäure erhält, worauf man eine von verschiedenen Acylgruppen entweder chemisch oder enzymatisch, beispielsweise nach der Methode gemäß Journal of American Chemical Society 94, 4035 (1972), in die 7-StelIung zur Aminogruppe einführt. Eine der bekannten Methoden für die Herstellung von Cephalosporinantibiotika, welche eine 3-Methylgruppe aufweisen, besteht darin, daß man ein durch Fermentation erhältliches Penicillin auf chemische Weise so zur Umsetzung bringt, daß eine Erweiterung des Ringes unter Bildung einer Cephalosporinverbindung mit einer Methylgruppe in der 3-Stellung gebildet wird, welche man dann als synthetisches Zwischenprodukt für die Herstellung der gewünschten Antibiotika verwendet (Journal of American Chemical Society 85,1896 (1963),

Gemäß einer anderen Methode wird Cephalosporin C (nachstehend der Kürze wegen lediglich als CPC bezeichnet), durch einen Fermentierungsprozeß chemisch katalytisch zu DACPC reduziert, welches hierauf als Zwischenprodukt für die gewünschten Antibiotika verwendet wird [Journal of Medicinal Chemistry 7, 117 (1964)]. Diese Methoden bedingen aber eine Kombination sowohl eines Fermentierungsverfahrens als auch eines chemischen Verfahrens, wodurch die Methoden erschwert und die verschiedenen Arten von Ausrüstungen verteuert werden, so daß sie voifl wirtschaftlichen Standpunkt aus betrachtet Nachteile aufweisen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen und wirtschaftlich vorteilhaften Verfahrens für die Herstellung von DACPC in hoher Ausbeute.

Dementsprechend betrifft die Erfindung das im Patentanspruch 1 genannte Verfahren. Eine Ausgestaltung dieses Verfahrens ist im Patentanspruch 2 angegeben.

Im folgenden sind die Mikroorganismen aufgezählt, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden:

Streptomyces griseus IFO-13550,
Streptomyces hygroscopius IFO-13598,
Cephalosporium sp. ATCC-14553,
Cephalosporium acremonium IFO-9918,
Cephalosporium polyaleurum IFO-9920,

24	3	28 957	4	5	Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme	d) Oberflächenstruktur und Größe der Sporen:	1 bis 3 Wochen finden sich in der folgenden Tabelle 1.	normal, pulvrig; hellgelblich- keines	65 Verflüssigung von Gelatine:
Emericellopsis microspora IFO-9922,	Arachnomyces minimus IFO-9917,	sind die folgenden:	glatt, 0,8 auf 0,8 bis 1,2 μ.		weiß bis creme- orange	positiv
Paecylomyces carneus IFO-9729,	Spiroidhim fuscum IFO-5479,	(A) Streptomyces griseus IFO-13550	15 el FIagellen:	Art des Mediums Wachstum Vegetatives Mycel Luftmycel Rückseite Lösliches Pigment	farben	Melaninproduktion:
Paecylomycescarneus IFO-9730,	Spiroidium fuscum IFO-9923 und	1. Moφhologische Eigenschaften	nicht beobachtbar.	Saccharose- schlecht bis farblos	reichlich, pulvrig; hellgelb bis hell-lohfarben	negativ
Paecylomyces persicinus IFO-9731,	Cephalosporium sp. ATCC-14553.	a) Art der Verzweigung der sporogenen Hyphen:	f) Sporangien:	Nitrat-Agar mäßig	weiß bis hellgelb- lohfarben
Anixiopsis peruviana C.B.S.-301.67,	monopodial verzweigt; Büschel bildend.	nicht feststellbar.		lichtanninfarben
Anixiopsis peruviana IFO-9916,	b) Konfiguration der sporogenen Hyphen:	2. WachsUimseigenschaften auf	Glucose- gut farblos	reichlich, pulvrig; helloliv helloliv
Arachnomyces minimus C.B.S.-324.70,	Rectus-flexibilis.	verschiedenen Medien	Asparagin-Agar	elfenbeinfarben
c) Zahl der Sporen:	Die Resultate bei der Züchtung bei 28° C während		bis leicht grün
nicht weniger als 10.	Tabelle 1	Glycerin- gut farblos bis	lichgraue Tönung
Asparagin-Agar cremefarben	spärlich, pulvrig; farblos äußerst helloliv
	staubförmiges
	Gelb
Stärke-anorga- mäßig farblos	reichlich, pulvrig; farblos bis hell- äußerst helloliv
nisches SaIz-	hellzitronengelb; elfenbeinfarbig
Agar	nachträglich
Tyrosin-Agar gut farblos	rötlich (krebs-
	farben) werdend;
	mäßig bis reich- bräunlichgelb keines
	Hch, pulvrig; weiß
	bis hellgrau
i Nähragar mäßig farblos bis	reichlich, pulvrig; senffarbig zinnamonfarben
la cremefarben	zitronenfarben
1	bis bambusgelb-
I Hefemalzagar gut farblos bis	farben
ι cremefarben	spärlich, pulvrig; farblos senffarben
I	weiß
S	kein Luftmycel farblos keines
I Hafermehlagar gut, faltig farblos bis
' cremefarben
jjj Pepton-Eisen- mäßig dünnes farblos bis	& 3. Physiologische Eigenschaften
H Hefeextrakt-Agar Wachstum, cremefarben	'jti ;' Wachstumstemperatur:
Ij schillernd	f: gutes Wachstum bei 28 bis 37°C
ij Reduktion von Nitraten:
!■·; positiv

4. Assimilation von Kohlenstoffquellen (bei 28°C auf Pridham-Gottlieb-Agar)

+ : L-Arabinose, D-Glucose, D-Fructose,

D-Mannit, D-Xylose
± oder —: Saccharose, Inosit, L-Rhamnose, Raf finose.

Ein Vergleich der obenerwähnten Eigenschaften mit den Beschreibungen nach Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, S. A. Waksmans »The Actinomycetes«, (Bd. 2) und »International Journal of Systematic Bacteriology« zeigt, daß der Stamm IFO-13550 zur Gattung Streptomyces der Familie Streptomycetaceae gehört Der Stamm besitzt Eigenschaften, weiche stark jenen von Streptomyces griseus gleichkommen, obwohl dieser Stamm hinsichtlich der Verwertung von Kohlenstoffquellen sich leicht unterscheidet Daher wird dieser Stamm als ein Stamm identifiziert, welcher zu Streptomyces griseus gehört

(B) Streptomyces hygroscopicus IFO-13598 1. Morphologische Eigenschaften

Das Luftmycel ist im allgemeinen kurz, monopodial

ίο verzweigt, mit kräftigen Spiralen in dichter traubenförmiger Form. Die Zahl der Sporen in der Kette liegt bei nicht weniger als 10. Die Form der Sporen ist ellipsoid bis kurz zylindrisch, 0,5 bis 0,7 auf 0,6 bis 1,1 μ lang und die Oberfläche ist glatt Es sind weder Flagellen noch Sporangien feststellbar.

2. Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Medien siehe Tabelle 2

Tabelle 2

Medium

Wachstum

Luftmycel Rückseite

Lösliches Pigment

Saccharose-Nitrat-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

Glycerin-Asparagin-Agar

Stärke-anorganische
Salze-Agar

Tyrosin-Agar

Nähragar

Hefe-Ma!z-Agar

Hafermehlagar

Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar

gut, faltig, farblos bis blaßgelb

mäßig, farblos bis blaßgelb

mäßig, restriktiv, farblos

mäßig, farblos

mäßig, farblos mäßig, farblos gut, farblos

gut, dick, farblos

mäßig, restriktiv, farblos

mäßig, pulvrig, weiß bis olivgrau

schwach, weiß oöer mattes grau bis dunkelgrau

mäßig, pulvrig, natürlich oder mattes grau bis beigegrau

reichlich, pulvrig, weiß bis natürlich, teilweise hygroskopisch

keines keines

reichlich, pulvrig, weiß bis natürlich oder matt grau bis beigegrau, teilweise hygroskopisch

reichlich, pulvrig, weiß bis natürlich oder beigegrau, teilweise hygroskopisch

keines senf-lohfarben bis
senfbraun

farblos

farblos oder graulohfarben

farblos oder
cremefarben

farblos
farblos

bernsteinfarbig
bis topasfarbig

farblos bis hell
weizenfarben

farblos

senffarben keines

keines keines

keines keines

keines oder hellbernsteinfarben

keines oder bambusfarben

keines

3. Physiologische Eigenschaften

a) Wachstumstemperatur:

gutes Wachstum bei 20 bis 37° C, optimale Temperatur liegt bei 28 bis 32° C

b) Wachstum pH:

das Wachstum erfolgt in einem pH-Bereich von 5 bis 9 mit einem optimalen pH-Wert von 6 bis 7

c) Gelatineverflüssigung:
keine Verflüssigung

d) Stärkezerfall:
positiv (mäßig)

e) Wirkung auf Magermilch:

keine Koagulation, jedoch schwach peptonisiert

f) Reduktion von Nitraten:
negativ

g) Melaninähnlichis Pigment:

negativ

h) Assimilation von Kohlenstoffquellen (bei 28° C auf Pridham-Gottlieb-Agar)

+: L-Arabinose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannit, D-Xylose, Saccharose, Inosit, L-Rhamnose, Raf'inose.

Die taxonomischen Eigenschaften von IFQ-13598 lassen sich wie folgt wiedergeben:

(1) Sporenkettenmorphologie:
Spiralen

(2) Sporenoberfläche:
glatt

(3) Farbe des Wachstums:

farblos bis blaßgelb

(4) Luftmycel:
verschiedene Grauvarianten

(5) Hygroskopische Flächen finden sich im Luftmycel.

(6) Melaninähnliches Pigment: * keine Bildung.

Aus diesen Eigenschaften geht hervor, daß IFO 13598 als ein Stamm identifiziert werden kann, welcher zu Streptomyces hygroscopicus gehört, verglichen nach ^|0 dc-r Beschreibung gemäß Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage; S. A. Waksmans »The Actinomycetes«, Bd. 2; und »International Journal of Systematic Bacteriology«, 22,265 (1972).

(C) Cephalosporium sp. ATCC-14553 und
Cephalosporium acremonium IFO 9918

Die Kolonien auf Malzextraktagar und Kartoffel-Dextrose-Agar sind unregelmäßig, faltig, getrieben und üblicherweise feucht, farblos bis blaßgelb. Das Luftmyeel ist unzureichend. Die Rückseite ist farblos bis blaßgelb. Das lösliche Pigment ist gelb. Hyphen 1 bis 3 μ, septiert. Die als Seitenstämme auf Hyphen vorkommenden Konidiophoren sind 30 bis 60 μ lang und 2,5 bis 3,5 μ breit an der Basis. Die Konidien sind multiförmig, elliptisch oder rechteckig, geradlinig oder gebogen, glasklar, 6—9x2—3 μ. Diese beiden Stämme besitzen verschiedene Produktivitäten an DACPC, Desacetylcephalosporin C [nachstehend kurzerhand mit DCPC bezeichnet] und CPC. ™

(D) Cephalosporium polyaleurum IFO 9920

1. Charakteristika auf Agarmedien

Manche kleine asexuellen Sporen, welche Weizenmehlsporen entsprechen, werden direkt aus den Spitzen und Seiten der Hyphen gebildet. Kurz und hin und wieder kurvig, 3 bis 4 auf 4 bis 6 μ, farblos. Wenn auch zeitweilig zwei davon miteinander vereinigt sind, so sind sie doch in manchen Fällen einzeln vorhanden.

Die Bildung von Konidien ist auf die Anfangsphase des Wachstums beschränkt und sehr spärlich. Andererseits werden manche Aleuriosporen, d. h. Weizenmehlsporen, in der Zwischenphase und nachher gebildet und können innerhalb der Kolonie überall festgestellt werden. Es werden keine Organe für die sexuelle Reproduktion auf den Medien beobachtet.

Die geeignete Wachstumstemperatur liegt bei 25 bis 30⁰C und der geeignete pH-Wert bei 5,0 bis 7,0.

Ein Vergleich der obenerwähnten Eigenschaften der Stämme IFO 9918 und IFO 9920 mit den Angaben in »Dictionary of Fungi«, 6. Auflage, und Barnett Hunter, »Illustrated Genera of Imperfect Fungi«. 3. Auflage, deutet eindeutig darauf hin, daß diese Stämme zur Gattung Cephalosporium, der Familie Moniliaceae, der Ordnung Moniliales von Fungi Imperfecti gehören.

Im Lichte der Beschreibungen gemäß Gilman, »A Manual of Soil Fungi (1957)« und Sukapure et al, »Mycologia 58, 351 (1966)« wurde der Stamm IFO 9918 als ein Stamm identifiziert, welcher zu Cephalosporium acremonium gehört.

Der Starim IFO 9920 ist ein Stamm, welcher zu einer neuen Art gehört, welche als Cephalosporium polyaleurum bezeichnet wurde.

(E) Emericellopsis microspora IFO 9922

35

(1)

(1) Malz-Extrakt-Agar:

Wachstum gut, sich ausbreitend. Luftmycel spärlich, durchwegs zottig, blaß geibiichbraun. Rückseite farblos.

(2) Kartoffel-Agar: «o Wachstum gut, sich ausbreitend. Luftmycel reich- (2) lieh, oft gebündelt in Strängen, weiß bis blaßbraun, mit radialen Falten, zottig. Rückseite farblos oder blaßgelb.

(3) Czapek-Agar: Wachstum gut, sich ausbreitend, Luftmycel reichlich, oft gebündelt in Strängen, rein weiß, zottig. (3) Rückseite farblos.

(4) Hafermehl:

Wachstum gut, sich ausbreitend, Luftmycel spärlich, 50 (4) niedrig und flach, zottig, hellfarben. Rückseite farblos bis blaßgelb.

(5) 1 % Glucose-Bouillon-Agar:

Wachstum gut, sich nicht ausbreitend, mit manchen (5) radialen Falten. Luftmycel reichlich, rein weiß, zottig. Rückseite blaßgelb.

2. Mikroskopische morphologische Eigenschaften

Extrem spärliche Bildung von Konidien. Die dünnen ^Μ Lufthyphen, 1,0 bis 1,5 μ breit, sind reichlich verzweigt und farblos. Die Konidiophoren breiten sich aus dem Luftmycel geradlinig aus, mit Längen von 40 bis 60 μ und Breiten von 1,0 bis 1,5 μ, jedoch mit einer Breite von 2 μ an den Haftstellen. Die Konidien sind ellipsoidal mit etwas zugespitzten Enden oder asymmetrisch; einzeilig und farblos. Größe 13 bis 2 auf 3 bis 6 μ; traubenförmig in einer Masse an der Extremität der Konidiophoren.

1. Eigenschaften auf Agarmedien

Malzextrakt-Agar:

Wachstum gut, mit leuchtenden Falten auf der Oberfläche, sich schwach ausbreitend, farblos bis blaß lachsrosa. Rückseite hellorange bis lachsrosa. Luftmycel spärlich, flockig und weiß.
Kartoff el-Glucose-Agar:

Wachstum gut, sich schwach ausbreitend, weiß bis hell lachsrosa. Rückseite gelb bis orangegelb. Luftmycel reichlich, flockig.

Manche schwärzlichbraune Sporenschläuche werden gebildet.
Czapek-Agar:

Wachstum gut, niedrig und flach. Luftmycel zottig und weiß. Rückseite hellorange.
Sabouraud-Agar:

Wachstum gut, niedrig und flach, schwach s"± ausbreitend, lachsrosa. Luftmycel flockig und weiß. Rückseite leicht orange.
Hafermehlagar:

gutes Wachstum, sich leicht ausbreitend, lachsrosa. Luftmycel spärlich, flockig und weiß. Rückseite hellorange bis lachsrosa. Schwärzlichbraune Sporenschläuche werden gebildet

2. Mikroskopische Morphologie

Die mikroskopische Morphologie des Stammes, gewachsen auf den obigen Medien, ist die folgende:

Das Luftmycel, 1,5 bis 2 μ breit, ist verzweigt und farblos. Die Konidiophoren erstrecken sich aus dem vegetativen oder Luftmycel in Längen von 30 bis 60 μ auf 1,5 bis 25 μ mit Konidien an den Extremitäten. Die Größe der Konidien schwankt von 3 bis 8 χ 1,5 bis 4 u:

oval bis rechteckig.

Die Ascocarpen sind dunkelfarbig und im wesentlichen sphärisch, mit Größen von ungefähr 30 bis 60 μ. Jeder Ascus enthält 8 Ascosporen, 9 bis 12 μ messend. Die Ascosporon sind rechteckig bzw. länglich bis oval und hellgrünlichbraun, 3 bis 3,5 auf 4,5 bis 5 μ messend. Die Sporen besitzen Flügel und scheinen verschiedene Formen aufzuweisen. Die Länge der Flügel liegt bei 1,5 bir Tr μ.

(F) Paecilomyces carneus IFO 9729 und IFO 9730
1. Eigenschaften auf Agarmedien

(1) Malzextrakt-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht übermäßig ausbreitend, kissenähnlich, weiß bis milchbraun, zuweilen mit blaßrosa Tönung. Rückseite gelblichgrünbraun bis dunkelgrünlichschwarz, ergeben aber kein grünes Piampnt.

(2) Kartoffel-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend, Luftmycel flockig bis kissenartig, weiß. Rückseite gelblichgrün bis tiefgrün.

(3) Czapek-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend, Luftmycel flockig bis kissenartig, weiß bis milchweiß. Rückseite gelblichgrün.

(4) Sabouraud-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend, Luftmycel flockig bis kissenartig und weiß. Rückseite gelblichgrün bis tiefgrün.

(5) Hafermehlagar:

gutes Wachstum, sich schwach ausbreitend. Luftmycel flockig bis kissenartig, hin und wieder pulvrig. Weiß bis milchweiß. Rückseite gelblichgrün bis tiefgrün.

2. Mikroskopische morphologische Eigenschaften

Luftmycel, 1,5 bis 2 μ breit, ist verzweigt. Die Konidiophoren werden auf dem Luftmycel gebildet, und zwar einzeln oder mono- oder biquirlich. Ca. 2 μ breit. Die Fiolen haben eine verlängerte Form (eine Form ähnlich einem verlängerten Kolben) mit Spitzen, die sich leicht ausdehnen unter Bildung von Konidien. Größe 15 bis 20 auf 2 bis 2,5 μ. Die Konidien sind elliptisch und scheinen leicht angerauht zu sein, bei langen Ketten von bis 4 auf 2 bis 2,5 μ. Keine Organe für sexuelle Reproduktion können auf den obigen Medien festgestellt werden.

Optimale Wachstumsbedingungen liegen bei 24 bis 28° C und einem pH-Wert von 5 bis 7.

(G) Paecilomyces persicinus IFO 9731
1. Eigenschaften auf Agarmedien

(1) Malzextraktagar:

gutes Wachstum, sich leicht ausbreitend, Luftmycel ist flockig bis kraus und hin und wieder strangförmig. Weiß bis milchbraun und zeitweilig blaß rötliche Färbung. Rückseite gelb bis gelblichbraun, wird nie grün. Ein gelblichbraunes Pigment wird im Medium erzeugt.

(2) Kartoffel-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend, Luftmycel flockig bis pulvrig, weiß. Rückseite hellbraun.

(3) Czapek-Agar:

äußerst schlechtes Wachstum. Luftmycel ist nur rudimentär.

(4) Sabouraud-Agar:

gutes Wachstum, sich nicht ausbreitend. Luftmycel ist relativ spärlich, flockig bis pulvrig und weiß bis hellbraun. Rückseite farblos bis hellbraun.

(5) Hafermehlagar:

gutes Wachstum, sich schwach im Medium ausbreitend. Reichliches Luftmycel, zottig bis flockig und in manchen Fällen gebündelt, wobei das Aussehen strangförmig wird. Weiß bis hellbraun, hin und wieder hellrötliche Färbung. Rückseite gelblichbraun bis gelblichrosa.

2. Mikroskopische morphologische Eigenschaften

Das Luftmycel tritt hin und wieder vereinzelt auf, in anderen Fällen aber sind verschiedene davon miteinander verbündelt und liefern die Form eines Stranges.

Es werden keine Konidiophoren gebildet, doch werden aus dem Luftmycel Fiolen oder Stränge von Luftmycelien gebildet.
Jede Fiole hat die Form eines verlängerten Kolbens, 10 bis 30 μ lang und an den Punkten des Zusammentreffens eine Breite von 1,8 bis 2,2 μ. Die Fiole trägt Konidien an den Enden. Das Konidium ist ellipsoidal bis eiförmig, die Oberfläche glatt oder schwach faltig. Größe 2 bis 3 auf 2,5 bis 4,0 μ. Lange Ketten werden gebildet. Keine Organe für sexuelle Reproduktion werden auf den obigen Medien festgestellt.

Das optimale Wachstum findet bei 24 bis 28° C und einem pH-Wert von ca. 5 bis 7 statt.
Gemäß Ainsworth et al, »Dictionary of Fungi«, 6.

Auflage, und Barnet Hunter, »Illustrated Genera of Imperfect Fungi«, 3. Auflage, fallen die Stämme IFO 9729, IFO 9730 und IFO 9731, welche die obengenannten mikrobiologischen Eigenschaften haben, unter die Gattung Paeciiomyces, die Familie Moniüaceac, die Ordnung Moniliales von Fungi Imperfecti.

Nach »Transactions British Mycological Society« 40, 17—89 (1957) dürften die Stämme IFO 9729 und IFO 9730 zu Paecilomyces carneus Duche et Heim gehören. Der Stamm IFO 9731 wurde aufgrund der obigen Literatur und »Micological Papers« Nr. 107, 1 — 23 (1967) gemäß Commonwealth Micological Institute als ein Stamm identifiziert, welcher zu Paecilomyces persicinus Nicot gehört.

(H) Anixiopsis peruviana CBS-301.67 und IFO 9916

Der Stamm CBS-301.67 ist ein bekannter Stamm, welcher in CBS-List of Cultures, 28. Auflage, 1972, beschrieben wird.

Der Stamm IFO 9916 hat ähnliche mikrobiologische Eigenschaften mit Ausnahme der Möglichkeit der Herstellung von DACPC, d. h. Desacetylcephalosporin C, und CPC.

Diese Stämme gehören zu Eurotiales-Eurotiaceae-Anixiopsis und haben die folgenden Eigenschaften:
Kolonien auf Malzextraktagar oder Leonian-Hefeextrakt-Agar breiten sich langsam oder nicht aus, sind weiß bis blaßbraun, werden später braun bis dunkelbraun unter Bildung von Perithezium. Rückseite erst gelb bis gelblichbraun, später jedoch dunkelbraun bis beinahe schwarz. Lösliches Pigment ist gelb, später olivenfarbenbraun. Hyphen: glasklar, dünnwandig, indirekt septiert, gezweigt, 1 bis 2£ μ Durchmesser.
Perithecia cleistocarpous: dunkelbraun, beinahe

schwarz im trockenen Zustande an gewissen unterhalb dem Luftmycel erzeugten Stellen, an anderen Stellen eine dichte, oberflächliche Schicht auf der Oberfläche des Agars mit wenig Luftmycel bildend, kugelförmig, unbehaart mit Ausnahme von spärlichen Haftstellcn an den Lufthyphen, 140 bis 350 μ Durchmesser.

Asci in großen, eng aneinanderhaftenden traubenartigen Formen, ohr..; bestimmte Orientierung, subkugelförmig, 6,5 bis 8,0 χ 5,5 bis 6,5 μ, achtsporig, dünnwandig, unendlich klein.

Paraphysen sind spärlich, fadenförmig, traubenförmig, septiert, 2 bis 4 μ Durchmesser, vermischt mit Asci.

Ascosporen sind scheibenförmig, 2,5 bis 3,0 χ 2,5 bis 3,0 χ 2,0 bis 2,5 μ in kugelförmiger Masse, fein seeigelartig, stark blaßgelb.

Chlamidosporen sind kugelförmig bis subkugelförmig, hyalin, glatt, 8 bis 10 μ mit schwach verdickten Wandungen, meistens endständig, zerstreut vorhanden auf den Hyphen, in der Hynhenmasse eingetaucht, nicht reichlich.

Keine anderen Konidien oder Spermatia.

(I) Arachnomyces minimus CBS-324.70
und IFO 9917

Stamm CBS-324.70 ist ein bekannter Stamm, welcher in CBS-List of Cultures, 28. Auflage, 1972, beschrieben wird.

Stamm IFO 9917 hat ähnliche mikrobiologische Eigenschaften mit Ausnahme der Fähigkeit zur Herstellung von DACPC, DCPC und CPC.

Diese Stämme gehören zu Eurotiales-Eurotiaceae-Arachnomyces und besitzen die folgenden Eigenschaften:

Kolonien auf Weitzman und Silva-Hutner-Medium erreichen einen Durchmesser von 2,5 cm in zwei Monaten bei Zimmertemperatur, sind filzig, grünlichgelb, erzeugen ein violettbraunes Pigment, das sich im Medium ausbreitet. Rückseite braun, gesprenkelt bzw. getüpfelt. Mycelium hyalin, dünnwandig, kaum septiert, mit zahllosen ampulienförmigen Anschwellungen, kugelförmige Zellen von 7 bis 11 μ Durchmesser in der Nachbarschaft der Sporenschlauchfruchtanfängen und Ascocarpen und gelegentlich auch an anderen Stellen erzeugend.

Ascocarpen: subkugelförmig bis kugelförmig, rötlichbraun durch reflektiertes Licht, beinahne opak im reifen Zustand, haarig zufolge reichlicher Mycelbildungen, welche im Reifezustand verschwinden, verschiedene lange haarähnliche Anhänge bildend, 100 bis 315 μ Durchmesser, im Reifezustand sich unregelmäßig öffnend.

Ascocarpanhängsel 2,5 bis 5,5 μ breit, bis zu 3 mm oder langer.

Asci: subkugelförmig bis kugelförmig, ohne Stiel, verschwindend klein, achtsporig, 5,5 bis 8,5 μ Durchmesser. Ascosporen: flachgedrückt, hellgelbüch bis braun bei transmittierendem Licht, hellrötlichbraun bis tonfarben in Masse, glatt, 2,8 bis 3,5x1,5 bis 2,0 μ. Konidialzustand: keinen.

(J)Spiroidium^fuscum IFO-5479und IFO 9923

Stamm IFO-5479 ist ein bekannter Stamm, welcher in IFO-List of Cultures, 5. Auflage, 1972, beschrieben ist.

Der Stamm IFO 9923 hat ähnliche mikrobiologische Eigenschaften mit Ausnahme des Vermögens zur Herstellung von DACPC, DCPC und CPC.

Diese Stämme gehören zu Fungi Imperfecti-Moniliales-Moniliaceae-Spiroidium und besitzen die folgenden

ίο morphologischen Eigenschaften:

Schwaches bis mäßiges Wachstum auf Maisstärke-Agar oder Czapek-Agar und gutes Wachstum auf Malz-Agar oder Glucose-Bouillon-Agar.
Die Kolonien sind zuerst weiß, werden allmählich grünlichgelb getönt, werden schließlich braun. Hyphen sehr fein, 1,5 bis 2 μ breit, schwach septiert, gelegentlich gebündelt. Die sporenbildenden Hyphen sind mit unregelmäßigen Spiralen verzweigt, durch Bildung von Scheidewänden geteilt und bilden allmählich Chlarnidosporen. Chlamidosporen: quadratförmig, rechteckig oder zylindrisch, 2 bis 3 μ, enthalten oft öltropfen, schwellen oft beim Keimen und bilden Keimrohre. Organe für sexuelle Reproduktionen werden aus den Medien nicht gebildet.

Beim Züchten der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen verwendet man ein Kulturmedium, welches Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, welche die Mikroorganismen assimilieren können. Als Kohlenstoffquellen kommen beispielsweise GIucose, Saccharose, Maltose, Stärke, lösliche Stärke, Abfallmelassen, Glycerin, verschiedene organische Säuren, z. B. Essigsäure, Fumarsäure, Benzoesäure usw., verschiedene Alkohole, z. B. Äthanol, Butanol usw., n-Paraffine und verschiedene öle und Fette in Frage.

Als Stickstoffquellen kann man verschiedene organische und anorganische Stickstoffquellen verwenden, z. B. Pepton, Sojabohnenmehl. Fleischextrakt, Baumwollsamenmehl, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Harnstoff, Ammoniumsalze [z. B. NH₄CI,

■Ό (NH₄J₂SO₄, NH₄NO₃, Ammoniumphosphat], Nitrate, (z.B. NaNO₃, KNO₃), etc.

Überdies kann man auch Metallsalze, z. B. Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate, und andere Metallsalze, z. B. solche des Kaliums, Magnesiums, Calciums, Natriums usw., zugeben. Nötigenfalls kann man dem Kulturmedium auch verschiedene Substanzen, welche das Wachstum und die Fähigkeit zur Erzeugung von DACPC erleichtern, zugeben, wie z. B. Methionin, Cystein, Cystin, Thiosulfate, Methyloleat, Specköl, verschiedene Vitamine, Aminosäuren, nukleinsäurehaltige Materialien usw. Auf diese Weise kann man die Anreicherung von DACPC weiter steigern.

So ist beispielsweise Methionin für die Erzeugung von DACPC durch die Mikroorganismen der Gattung Cephalosporium und Emericeilopsis besonders wirksam, während Cystein und/oder Cystin für die Erzeugung von DACPC durch die Mikroorganismen der Gattungen Paecilomyces, Arachnomyces, Anixiopsis und Spiroidium besonders geeignet sind. Die obigen Wirkungen ergeben sich aus den folgenden Vergleichsversuchen.

Tat/eile 3

Wirkung von Methionin

Stamm	Angereichertes DACPC (;j.g/mi)	0,1 0,3 0,5	0,1	0,3	70	0,5	1,0	2,0
	DL-Methionin		35	1500	105	100	Jj
	Konzentration (%)		500	400	1790	1900	500
	0 0,01	250	450	560	550	150
Cephalosporin sp ATCC 14553	20 25	300		540	550	260
Cephalosporium acremonium IFO 9918	50 70
Cephalosporium polyaleurum IFO 9920	70 90
Emericellopsis microspora IFO 9922	200 240
Tabelle 4			L-Cystin
Wirkung von L-Cystein und/oder L-Cystin
Stamm Angereichertes DACPC (,ug/ml)		0 0,01
Verbindung	1,0		0,1	0,3 0,5	1,0
L-Cystein
Konzentration (%)
O 0,01

Paecilomyces carneus IFO 9729 160 190 450 520 500

Paecilomyces persicinus 90 120 280 310 320

IFO 9731

Anixiopsis peruviana 130 150 200 250 210

CBS-301.67

Arachnomyces minimus 20 30 80 102 120

CBS-324.70

Spiroidium fuscum IFO-5479 50 65 90 145 130

160 180 300 400 420 225

90 105 150 220 200 120

130 145 180 200 220 160

20 30 80 105 110 45

50 60 85 115 100 65

In den obigen Versuchen wurde jeder Stamm unter den erwähnten Bedingungen, z. B. Medium, Temperatur, Bebrütungsdauer usw., bebrütet, wie dies aus den folgenden Beispielen im Zusammenhang mit den entsprechenden Stämmen gezeigt wird.

Wie aus den obigen Experimenten hervorgeht, wirkt sich die Zugabe von mindestens 0,01% und zweckmäßig von 0,01 bis 2,0% und insbesondere von 0,1 bis 1,0% Methionin für eine starke Produktion von DACPC durch die Mikroorganismen der Gattungen Cephalosporium und Emericellopsis günstig aus. Eine Zugabe von mindestens 0,01%, zweckmäßig von 0,01 bis 1,0% und insbesondere von 0,1 bis 0,5% Cystein und/oder Cystin ist für eine starke Produktion von DACPC durch die Mikroorganismen der Gattungen Paecilomyces, Arachnomyces, Anixiopsis und Spiroidium besonders wirksam.

Die Züchtung des Mikroorganismus kann stationär oder durch Schüttelkultur geschehen. Im allgemeinen ist es von Vorteil, ei:;e submerse Züchtung unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Züchtungstemperatur liegt mit Vorteil im Bereiche von ungefähr 18 bis 40° C und am besten im Bereiche von ungefähr 22 bis 35° C. Der pH-Wert wird auf einen pH-Wert zwischen 2 bis 10 daher rweckmäßig zwischen 4 bis 9 gehalten. Die Züchtung erfolgt während 72 bis 336 Stunden und insbesondere während 50 bis 480 Stunden.

Da der größere Teil des aufgearbeiteten DACPC in der flüssigen Phase der Kulturbrühe auftritt, ist es vorteilhaft, das Mycel aus der Brühe zuerst durch Zentrifugieren zu entfernen und hierauf die gewünschte Verbindung aus der darüberliegenden Schicht bzw. Filtrat zu gewinnen. Eine fraktionierte Isolierung von DACPC kann nach analogen Methoden, wie dies üblicherweise für die fraktionierte Gewinnung von schwach sauren organischen Produkten oder von Cephalosporin C oder anderen Verbindungen zur Anwendung gelangt, geschehen.

So kann man die Fraktionierung mit Vorteil unter Verwendung in geeigneter Kombination von Chromatographie auf Ionenaustauschharzen, Aktivkohle, Cellulose, Kieselgel usw. und Gelfiltrierung durchführen. Für eine quantitative Bestimmung des DACPC verwendet man die Methode zur Bestimmung des antibiotischen Wirkungsgrades von Produkten gegenüber Versuchsorganismen. Die Identifizierung des Produktes erfolgt beispielsweise durch Elementaranalyse, durch magnetische Kernresonanzspektrometrie, durch Infrarotspektrometrie, durch Ultraviolettspektrometrie, durch Papierelektrophorese und Dünnschichtchromatographie.

Verwendet man diese Methoden in Kombination, so kann man DACPC als freie Verbindung oder in Form eines Salzes davon gewinnen.

Die Erfindung sei durch die folgenden Beispiele erläutert, wobei die Teile jeweils Gewichtsteile bedeuten, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenem von g und ml.

Beispiel 1

Ein Fermentierkolben mit einem Fassungsvermögen von 2000 Vol.-Teilen wird mit 500 Vol.-Teilen eines Impfkulturmediums, enthaltend 2% Glucose, 1% Maltose, 1% Glycerin, 2% Baumwollsamenmehl, 1% Maisqueilwasser, 03% (NH₄)JSO₄, 03% NH₄NO₃, 0,01% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,005%

FeSO₄ - 7 H₂O,0,01% NaCl, 0,5 DL-Methionin und 1% CaCOs beschickt- Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit einer Anzahl Sporen aus einer Schrägkultur von Streptomyces griseus IFO-13550 angeimpft und auf einer Schüttelvorrichtung während 72 Stunden bei 28° C bebrütet

Getrennt davon wird ein 50 000 VoL-Teile fassender Fermentierbehälter mit 30 000 VoL-Teilen eines wäßrigen Mediums, enthaltend 3% Glucose, 3% Maisstärke, 2% Baumwollsamenmehl, 1% Maisquellwasser, 03% (NH₄J₂SO₄, 03% NH₄NO₃. 0.01% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ - 7 H₂O, 0,005% FeSO₄ · 7 H₂O, 0,01% NaCl, 0,5% DL-Methionin und 1% CaCO₃, gefüllt Der Behälter wird in an sich bekannter Weise sterilisiert und kühlengelassen. Dieses Medium wird aseptisch mit der obenerwähnten Impfkultur angeimpft und unter Schütteln bei 28° C bebrütet Nach 164stündigem Fermentieren wird die Kulturbrühe filtriert, worauf man 25 VoL-Teile eines Kulturfiltrates erhält Dieses Filtrat enthält l\0ag/nu DACPC Das Filtrat wird durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und auf einer mit 8000 VoL-Teilen Akth kohle beschickten Säule absorbiert Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 20 000 VoL-Teilen einer 50%igen wäßrigen Acetonlösung eluiert Das Eluat wird unverzüglich über eine Säule, weiche mit 3000 VoL-Teilen eines Anionenaustauschharzes, nämlich Amberlite IRA-900 (Acetatform), beschickt ist, geleitet und nach dem Waschen mit Wasser wird mit 10 000 VoL-Teilen einer 03 n-Ammoniumacetatlösung eluiert Das erhaltene Eluat wird ein zweites Mal über eine Säule von 1500 VoL-Teilen Aktivkohle geleitet und nach dem Waschen mit Wasser mit 3000 VoL-Teilen einer 50%igen wäßrigen Acetonlösung eluiert Das erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 50 VoL-Teile eines Konzentrates erhält

Das so erhaltene Konzentrat wird einer mit 3000 VoL-Teilen Cellulose beschickten Säule zugeführt und mit 70%igem wäßrigem Propanol eluiert Die an DACPC reichen Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt

Das so erhaltene Konzentrat wird Ober eine mit 150 VoL-Teilen Aktivkohle beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit Wasser wird das Material mit 300 VoL-Teilen einer 50%igen wäßrigen Acetonlösung eluiert Das Eluat wird mit Natriumhydroxyd neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt Dieses Konzentrat wird mit Äthanol versetzt und das Gemisch in der Kälte stehengelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden durch Filtrieren gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet Auf diese Weise erhält man 0,670 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC

Betspiel 2

Ein 5000 Vol.-Teile aufzunehmen vermögender Fermentierbehälter wird mit 2500 VoL-Teilen eines Kulturmediums, enthaltend 3% Glucose, 3% Maisstärke, 0,5% Hefeextrakt, 1% Baumwollsamenmehl, 0,5% rohes Sojabohnenmehl, Ö,Ö5% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,5% CaCO₃, gefüllt Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Streptomyces hygroscopicus IFO 13598 angeimpft und unter Schütteln während 144 Stunden bei 48° C bebrütet, wodurch man 820 μg/ml DACPC in der Kulturbrühe anreichert. Es werden bei dieser Arbeitsweise auch andere Cephalosporinverbindungen, z. B. CPC und DCPC, als Nebenprodukte gewonnen. Werden 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, so erhält man 030 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC

Beispiel 3

Ein 2000 VoL-Teile fassender Fermentierbehälter wird mit 500 VoL-Teilen eines Impfkulturmediums gefüllt welches 5% Glucose, 1,0% BaumwollsamenmehL 03% rohes SojabohnenmehL 0,5% Hefeextrakt, 03% Polypepton und 1% Calciumcarbonat enthält ίο Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit einer Masse von Sporen aus einer Schrägkultur von Cephalosporium sp. ATCC-14553 angeimpft und während 96 Stunden bei 28° C bebrütet Getrennt davon wird ein 50 000 VoL-Teile fassender Fermentierbehälter mit 30 000 VoL-Teilen eines Mediums beschickt, welches 8% Saccharose, 1% BaumwoilsamenmehL 3% Maisquellwasser, 03% DL-Methionin, 0,15% CaCO₃ und 0,05% Sojabohnenöl enthält Die Sterilisation erfolgt in üblicher Weise, worauf man kühlen läßt Das Medium wird aseptisch mit der obenerwähnten Impfkultur angeimpft und unter Schütteln und Rühren während 168 Stunden bei 24" C bebrütet

Nach beendeter Züchtung wird die Brühe isoliert und filtriert, wobei man 25 000 VoL-Teile eines Kulturfiltrates erhält

Dieses Ritrat enthält 105 μg DACPC/ml. Ferner enthält dieses Filtrat Penicillin N, CPC und DCPC

Dieses Filtrat wird hierauf mit Penicilünase versetzt, um Penicillin N zu zersetzen, worauf man das Material unmittelbar einer Säule zuführt, weiche mit 8000 VoL-Teilen Amberlite IRA-900 (Acetatform) beschickt isi, um das DACPC darauf zu adsorbieren. Das so adsorbierte DACPC wird mit 20 000 VoL-Teilen einer 03 n-Ammoniumacetatlösung eluiert und die an DACPC reichen Fraktionen werden gesammelt Dieses Eluat wird über eine Säule geführt, welche mit 3000 VoL-Teilen Aktivkohle beschickt ist, worauf man nach dem Waschen mit Wasser das adsorbierte DACPC mit 6000 VoL-Teilen einer 50%igen wäßrigen Acetonlösung eluiert. Die an DACPC reichen Fraktionen werden gesammelt, mit Natriumhydroxyd neutralisiert und eingeengt, wobei man ein DACPC enthaltendes Konzentrat erhält

Diese Lösung enthält nicht nur DACPC, sondern auch

« DCPC und CPC. Um die beiden letzteren Verbindungen fraktioniert zu entfernen, wird die Lösung über eine

Säule von Cellulose geleitet und das Material mit einer

70%igen wäßrigen Propanollösung eluiert, worauf CPC,

DACPC und DCPC in der genannten Reihenfolge

getrennt werden. Die DACPC-Fraktionen werden gesammelt, eingeengt und erneut auf einer Cellulosesäu-

Ie Chromatographien. Die DACPC-Fraktionen werden

gesammelt.

Die so erhaltene Lösung wird über eine Säule von Aktivkohle geleitet und nach dem Waschen mit Wasser

wird das Material mit einer 50%igen wäßrigen

Acetonlösung eluiert. Das Eluat wird mit einer Natriumhydroxydlösung neutralisiert, eingeengt und

nach der Zugabe von Äthanol in der Kälte stehengelas-

*ⁿ sen. worauf das Natriumsalz von DACPC ausfällt. Diese

Kristalle werden durch Filtrieren gewonnen und

getrocknet. Auf diese Weise erhält man 0,520 Teil von Kristallen von DACPC.

_b._; B e i s ρ i e I 4

Ein 50 000 Vol.-Teile fassender Fermentierbehälter wird mit 30 000 Vol.-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 6% Saccharose, 5% Glucose. 3%

308 139/55

Erdnußbrei, 3% Sojabohnenmehl, 1% DL-Methionin und 0,15% CaCO₃ enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Cephalosporium acremonium IFO-9918 angeimpft und unter Belüftung und unter Rühren (Belüftungsgeschwindigkeit 30 000 VoL-TeUe pro Minute; Rühren mit 250 Umdrehungen pro Minute) während 190 Stunden gezüchtet wodurch 1790 μ§/ηι1 DACPC in der Kulturbrühe angereichert werden. Als Nebenprodukte erhält man CPC und DCPC Behandelt man diese Kulturbrühe in der gleichen Weise wie in Beispiel 3, so erhält man 10,5 Teile von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC

Beispiel 5

Ein 5000 VoL-Teile fassender Fermentierbehälter wird mit 2500 VoL-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 5% Saccharose, 3% rohes SojabohnenmehL 1% DL-Methionin, 0,15% Calciumcarbonat und 3% Methyloleat enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Cephalosporium polyaleurum IFO-9920 angeimpft und unter Rühren während 192 Stunden bei 24° C bebrütet, wobei man 560μg/ml DACPC in der Kultarbrühe anreichert Als Nebenprodukte erhält man CPC und DCPC Behandelt man 2000 VoL-Teile dieser Kulturbrühe in der gleichen Weise wie in Beispiel 3, so erhält man 0,250 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC

Beispiel 6

Ein 5000 VoL-Teile fassender Fermentierbehälter wird mit 2500 VoL-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 8% Glucose, 2% Baumwollsamenme-hL 0,5% DL-Methionin und 1% Calciumcarbonat enthält Nach dem Sterilisieren des Mediums wird dieses mit Emericellopsis microspora IFO-9922 angeimpft und unter Schütteln während 144 Stunden bei 28°C bebrütet, worauf sich 540μg/ml DACPC in der Kulturbrühe angereichert haben. Als Nebenprodukte fallen CPC und DCPC an. 2000 VoL-Teile der Kulturbrühe werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 behandelt, wobei man 0,20 Teil Kristalle des Natriumsalzes von DACPC erhält

Beispiel 7

(a) 30 VoL-Teile eines Impfkulturmediums, welches 5% Glucose, 1% Baumwollsamenmehl, 0,5% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton und 1% Calciumcarbonat enthält werden in einen Fermentierbehälter von 200 VoL-Teilen Fassungsvermögen eingebracht Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Paecilomyces carneus lFO-9729 angeimpft und während 72 Stunden bei 28° C bebrütet Hierauf wird die Impfkultur portionsweise, und zwar jeweils mit 1,5 VoL-Teilen zu 30 VoL-Teilen Fermentierkulturen gegeben. Jede dieser Medien befindet sich in Fermentierbehältern von jeweils 200 VoL-Teilen Fassungsvermögen, wobei in diesen Behältern 4% Baumwollsamenmehl, 1% Calciumcarbonat und eine verschiedene Kohlenstoffquelle vorhanden ist Die Arten und Mengen dieser Kohlenstoffquellen finden sich in der nachstehenden Tabelle 5.

(b) 30 VoL-Teile eines Impfkulturmediums, welches 5% Glucose, 1% Baumwollsamenmehl, 0,5% rohes SojabohnenmehL 0,5% Hefeextrakt 0,5% Pe^iDn und 1 % Calciumcarbonat enthält werden in einen Fermentierbehälter von 200 VoL-Teilen Fassungsvermögen eingetragen. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Paeciiomyces persicinus IFO-9731 angeimpft und während 72 Stunden bei 28° C bebrütet Hierauf wird die Impfkuitur In Portionen von jeweils 1,5 VoL-Teilen in 30 VoL-Teile von verschiedenen Fermentierungsmedien eingetragen. Jedes dieser Medien ist in Fermentierbehältern von 200 VoL-Teüen Fassungsvermögen enthalten, wobei diese Behälter 4% Baumwollsamenmehl, 1% Calciumcarbonat und eine verschiedenartige Kohlenstoffquelle enthalten. Die Arten und Mengen dieser Kohlenstoffquellen Finden sich in der Tabelle 6.

Im Falle von (a) und (b) gibt man in jenen Fällen, in denen die Kohlenstoffquelle Essigsäure ist, eine 40%ige Essigsäurelösung, welche zuvor durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak teilweise neutralisiert und sterilisiert worden ist, nach 72 Stunden, nach Ablauf von 96 Stunden und nach 120stündiger Züchtung eine Menge von 0,75 Vol.-Teil davon hinzu. Ist die Kohlenstoffquelle ein Alkohol, z. B. 99,9%iges Äthanol, so wird diese Kohlenstoffquelle in Mengen von 0,4 Vol.-Teil nach 72 Stunden, 96 Stunden und 120stündiger Züchtung hinzugegeben. Die Züchtung wird während 168 Stunden bei 24° C durchgeführt.

Nach erfolgter Fermentierung wird jede Fermentierungsbrühe isoliert und zentrifugiert und die obenauf fließende Flüssigkeit in bezug auf DACPC, DCPC und CPC getestet Die Resultate finden sich in den Tabellen 5 und 6.

Tabelle 5 Paecilomyces carneus IFO 9729 KohlenstoiTquelle

Anfängliche Konzentration

Mengen an Antibiotic DACPC

angereichertem Cephalosporin-DCPC CPC

Glucose	8
Saccharose	8
Lösliche Stärke	8
Glycerin	5
Sojabohnenöl	5
n-Paraffine	8
Essigsäure	2

160

140

100

85

15

120

25

35	120
20	120
10	80
5	60
nicht feststellbar	10
25	110
nicht feststellbar	5

Tabelle 6

Paecilomyces persicinus IFO 9731

Kohlenstoffquelle

Anfangskonzenlration

Mengen an
Antibiotica DACPC

(.ag/ml) angereichertem Cephalosporin-DCPC CPC

Saccharose	8	90
Glucose	8	50
Essigsäure	2	10
Äthanol	2	15
	Beispiel 8

10	110
15	30
nicht feststellbar	15
nicht feststellbar	5

(a) Ein 200 VoL-TeHe Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 30 Vol.-Teilen eines Mediums beschickt welches 8% Glucose, 2% Baumwollsamenmehl, I^ Calciumcarbonat und die in der Tabelle 7 erwähnte Verbindung enthält Nach erfolgter Sterilisierung wird jedes Medium mit Paecilomyces carneus IFO-9729 angeimpft und unter Schütteln während 168 Stunden bei 24°Cbebrütet Nach erfolgter Fermentiening wird die Fermentierbrühe entnommen und zentrifugiert und obenauf fließend Flüssigkeit auf ihren Gehalt an DACPC getestet

(b) Ein Fermentierbehälter mit 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen wird mit 30 Vol.-Teilen eines Mediums gefüllt, welches 8% Glucose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% Calciui.icarbonat und eine Verbindung der Tabelle 7 enthält Nach erfolgter S-erilisierung wird Tabelle 7

jedes Medium mit Paecilomyces persicinus IFO-9731 angeimpft und hierauf unter Schütteln während 168 Stunden bei 24° C bebrütet Nach erfolgter Fermentierung wird die Fermentierbrühe entnommen und zentrifugiert und die obenauf fließende Flüssigkeit auf ihren Gehalt an DACPC getestet

(c) Ein 200 VoL-TeHe Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 30 Vol.-Teilen eines Mediums beschickt, welches 8% Glucose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% Calciumcarbonat und eine der Verbindungen der Tabelle 7 enthält Nach erfolgter Sterilisierung wird jedes Medium mit Paecilomyces carneus IFO-9730 angeimpft und unter Schütteln während 168 Stunden bei 24'C bebrütet Nach erfolgter Fermentierung wird die Fermentierbrühe entnommen und zentrifugiert und die obenauf fließende Flüssigkeit auf ihren Gehalt an D ACPC getestet

Zugegebene	Konzentration im	Stämme	Paecilomyces persicinus	Paecilomyces
Verbindungen	Medium	Paecilomyces carneus		carneus
			IFO 9731	IFO 9730
		IFO 9729	fcg/ml)	(ug/ml)
	(%)	fcg/ml)	310	110
L-Cystein	0,3	520	220	85
L-Cystin	0,3	400	90	30
keine	_	160

Als Nebenprodukte fallen DCPC und CPC an.

Ein 5000 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 2500 Vol.-Teilen des gleichen Mediums, wie es oben unter (a) beschrieben worden ist und 0,3% L-Cystein enthält, gefüllt Nach erfolgter Sterilisierung wird das Medium mit Paecilomyces carneus IFO-9729 angeimpft und nach der Methode gemäß obigem Absatz (a) gezüchtet. Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel l.so erhält man 0,210 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC.

Beispiel 9

60

Ein 2000 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 500 Vol.-Teilen eines Impfkulturmediums gefüllt, welches sich aus 5% Saccharose, 1% Baumwollsamenmehl, 3% Maisquellwasser und 0,15% Calciumcarbonat zusammensetzt. Nach erfolgter Sterilisierung wird mit Anixiopsis peruviana CBS-301.67 aus einer Schrägkultur angeimpft und hierauf während 96 Stunden bei 28° C bebrütet.

Getrennt davon wird ■i'in 50 000 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentiertank mit 30 000 Volumenteilen eines Mediums gefüllt, welches sich aus 8% Glucose, 2% Baumwollsamenmehl, 04% DL-Methionin und 1% Calciumcarbonat zusammensetzt. Das Medium wird sterilisiert und in üblicher Weise kühlen gelassen. Dann wird das Medium aseptisch mit der obenerwähnten Impfkultur angeimpft und bei 28°C unter Rühren und Schütteln (Belüftung: 30 000 Vol.-Teile/Minute unter Schütteln) während 184 Stunden bebrütet. Hierauf wird die erhaltene Kulturbrühe gewonnen und filtriert, um das Mycel zu entfernen, Wobei man 25 000 Völ.-Teile eines Kulturfiltrates erhält. Dieses Filtrat enthält 130 μg DACPC/ml, 25 μg DCPC/ml und 5 μg CPC/ml.

Behandelt man dieses Kulturfiltrat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,650 Teile von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC.

Beispiel 10
Ein Fermentierbehälter mit 5000 Vol.-Teilen Fas-

sungsvermögen wird mit 2500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums, welches 8% Glucose, 2% BaumwoIIsamenmehl, 0,5% DL-Methiöhih, 03% L-Cysteih und 1% Calciürricärböhat enthält, gefüllt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Änixiopsis peruviana CBS-301.67 ähgeimpft und während 168 Stunden bei 28^aC bebrütet, wodruch 250 μg DACPCmI in der Kulturbrühe angereichert werden.

Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,10 to Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC DCPC und CPC werden gleichfalls als Nebenprodukte erhalten.

Beispiel 11

15

Ein Fermentierbehälter mit 5000 VoL-Teilen Fassungsvermögen wird mit 2500 VoL-Teilen eines Kulturmediums gefüllt, welches 8% Glucose, 2°/o Baumwollsamenmehl, 0,5% DL-Methiönin, 03% L-Cystin und 1 % Calciumcarbonate enthält Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Anixfapsis peruviana CBS-301.67 angeimpft und während 168 Stunden bei 28° C bebrütet, worauf die Kulturbrühe 200 μg DACPC/ml in angereicherter Form enthält Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,08 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC.

Beispiel 12

30

Ein 5000 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 2500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums gefüllt, welches 8% Glucose, 2% Baumwollsamenmehl, 0,5% DL-Methionin und 1% Calciumcarbonat enthält Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Änixiopsis peruviana IFO-9916 angeimpft und dann während 168 Stunden bei 28°C bebrütet. Auf diese Weise werden der Kulturbrühe 1050 μ[·. DACPC/ml angereichert. Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,420 Teil Kristalle des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC.

Beispiel 13

45

Ein Fermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5000 VoL-Teilen wird mit 2500 Vol.-Teilen eines Kulturmediums gefüllt, welches 8% Saccharose, 1% Baumwollsamenmehl, 3% Maisquellwasser und 1% Calciumcarbonat enthält. Nach dem Sterilisieren wird so das Medium mit Arachnomyces minimus IFO-9917 angeimpft und dann während 168 Stunden bei 28° C bebrütet. Auf diese Weise werden 1200 μg DACPC/ml in der Kultuf'orühe angereichert.

Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise, so erhält man 0,500 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC Als Nebenprodukt erhält man DCPC und CPC.

Beispiel 14

Ein 5000 Vol.-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter vird mit 2500 Vol.-Teilen eines Mediums gefüllt, welches sich aus 8% Saccharose, 1 % Baumwollsamenmehl, 3% Maisquellwasser, 0,3% L-Cystein und 0,15% Calciumcarbonat zusammensetzt. Nach dem Sterilisierer: "/ird das Medium mit Arachnomyces minimus CBS-324.70 aus einer Schrägkultur angeimpft und während 168 Stunden bei 28°C bebrütet, wodurch in der Külturbrühe 102μg DACPC/ml angereichert werden. Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kultürfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,045 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebenfalls DCPC und CPC

Beispiel 15

Ein Fermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5000 VoL-Teilen wird mit 2500 VoL-Teilen eines Mediums gefüllt, welches sich aus 8% Saccharose, 1% Baumwollsamenmehl, 3% Maisquellwasser, 03% L-Cystin und 0,15% Calciumcarbonat zusammensetzt Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Arachnomyces minimus CBS-324.70 aus einer Schrägkultur angeimpft und während 168 Stunden bei 28°C bebrütet, wodurch 105 μg DACPC/ml in der Kulturbrühe angereichert werden. Behandelt man 2000 VoL-Teile des Kulturfiltrates in-der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man 0,048 Teil Kristalle des NatriuiUalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebehfalis DCPC und CPC.

Beispiel 16

Ein Fermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5000 VoL-Teilen wird mit 2500 VoL-Teilen eines Mediums gefüllt welches sich aus 8% Saccharose, 1% Baumwollsamenmehl, 3% Maisquellwasser, 03% L-Cystein und 0,15% Calciumcarbonat zusammensetzt. Nach dem Sterilisieren wird das Mediuin aus einer Schrägkultur mit Spiroidium fuscum IFO-5479 angeimpft und während 184 Stunden bei 28° C bebrütet, wodurch 145 μg DACPC/ml in der Kulturbrühe angereichert werden. Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen We'se wie in Beispiel 1, so erhält man 0,06 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebenfalls DCPC und CPC

Beispiel 17

Ein 5000 VoL-Teile Fassungsvermögen aufweisender Fermentierbehälter wird mit 2500 Vol.-Teilen eines Mediums beschickt, welches sich aus 8% Saccharose, 1% Baumwollsamenmehl, 3% Maisquellwasser, 03% L-Cystein und 0,15% Calciumcarbonat zusammensetzt Nach dem Sterilisieren wird das Medium aus einer Schrägkultur mit Spiroidium fuscum lFC-5479 angeimpft und während 184 Stunden bei 28° C bebrütet, wodurch 115 μg DACPC/ml in der Kulturbrühe angereichert werden. Behandelt man 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, so gelangt man zu 0,05 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC. Als Nebenprodukt erhält man ebenfalls DCPC und CPC

Beispiel 18

Ein Fermeutierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5000 Vol.-Teilen wird mit 2500 VoL-Teilen eines Kulturmediums beschickt, welches 8% Saccharose, 1% Baumwolltamenmehl, 3% Maisquellwasser und 1% Calciumcarbonat enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit Spiroidium fuscum IFO-9923 angeimpft und während 168 Stunden bei 28° C bebrütet, wodurch sich 1020 μξ DACPC/ml in der Kulturbrühe anreichern. Werden 2000 Vol.-Teile des Kulturfiltrates in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, so erhält man 0,410 Teil von Kristallen des Natriumsalzes von DACPC Als Nebenprodukte erhält man ebenfalls DCPC und CPC

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, daß man

Cephalosporium sp. ATCC-14553, Streptomyces griseus IFO-13550, Streptomyces hygroscopius IFO-13598, Cephalosporium acremenium IFO-9918, Cephalosporium polyaleurum IFO-9920, Emericellopsis microspora IFO-9922, Paecilomyces carneus IFO-9729, Paecilomyces carneus IFO-9730, Paecilomyces persirinus IFO-9731, Anixiopsis peruviana CBS-301.67, Anixiopsis peruviana IFO-9916, Arachnomyces minimus CBS-324.70, Arachnomyces minimus IFO-9917, Spiroidium fuscum IFO-5479 oder Spiroidium fuscum IFO-9923