CN113583877B - 一种发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法。以诱变的顶头孢霉菌通过三级种子培养，发酵生产而得，本发明方法能够以特定的诱变菌株成功发酵制备乙酰氧基脱头孢烷酸，简称DAOC，产物效价高达29300μg/mL，能够实现工业化生产，有利于进一步制备合成7‑ADCA，具备极大的应用价值。

Description

一种发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法。
背景技术
7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)是人工合成的头孢类抗生素，为头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉定等的主要起始原料，现有生产7-ADCA工艺是利用青霉素G钾盐为原料经过氧化、扩环和裂解等步骤合成而得到，然而，生产原料青霉素G钾盐的传统工艺需要利用产黄青霉素菌发酵，后经裂解得到7-ADCA，此过程中使用大量的过氧乙酸及醋酸丁酯，产生大量的废酸水，易造成环境污染；进一步地，青霉素G钾盐为原料生产的7-ADCA晶体不易结晶，存在7-ADCA不稳定，纯度低等问题。
以去乙酰氧基脱头孢烷酸(DAOC)作为原料，通过酶解法生产7-ADCA，具有不需要溶媒浸提、全水相处理的优点，而且成本低廉，较化学法生产7-ADCA具备显著优势、具备非常优异的工业应用价值。
公开号为CN1357051A的专利，公开了一种将A.chrysogenum菌株的cefEF基因失活，表达cefE基因得到的新菌株，能使DAOC的产量提高，但是，通过基因工程的方法改造菌株具有很大的不稳定性。
发酵法生产DAOC相比于基因工程方法具有独到的优势，DAOC可以从头孢菌素C(CPC)发酵过程中获得，然而，CPC发酵过程的产物中还包括有CPC、去乙酰头孢菌素C(DCPC)等物质，DAOC是CPC发酵过程中的副产物，CPC的结构类似物，因此在发酵中无法得到单纯的DAOC产物。微生物发酵是一个复杂的过程，影响发酵产物质量的因素较多，例如接种量、发酵pH、温度、时间、溶氧量等工艺参数对发酵产物的影响尤为明显。
因此，目前仍亟需一种通过微生物发酵制备得到高效价的DAOC产物的方法，具有重要意义和很高的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过特定的菌株，发酵生产高效价去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法。
本发明提供了一种发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法，包括如下步骤：
(1)取保藏编号为CGMCC NO:20270的顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)D-G3-B-2001，配制成菌悬液；
(2)将步骤(1)得到的菌悬液接种到一级种子培养基中，并在28±0.5℃、通气比0.8-1.1的条件下培养80-90h，得到离心菌浓为20～30％的一级种子液；
(3)将步骤(2)的一级种子液接种到二级种子培养基中，并在28±0.5℃、通气比0.8-1.2的条件下培养40-60h，得到离心菌浓为20～30％的二级种子液；
(4)将步骤(3)的二级种子液接种到三级种子培养基中，并在28±0.5℃、通气比0.8-1.3的条件下培养40-60h得到离心菌浓为20～30％的三级种子液；
(5)将步骤(4)的三级种子液接种到发酵培养基中，在28±0.5℃，通气比0.8-1.5的条件下培养120-128h，得到DAOC的发酵液，在发酵过程中，补入植物油、硫酸铵、液糖、氨水。
进一步地，上述步骤(2)所述接种的接种量为1％；和/或步骤(3)所述接种的接种量为5％；和/或步骤(4)所述接种的接种量为10％；和/或步骤(5)所述接种的接种量为25％。
进一步地，上述步骤(2)所述一级种子培养基包括如下成分：玉米浆38重量份，豆油4.5体积份，葡萄糖8重量份，蔗糖1.1重量份，消沫剂0.02重量份，碳酸钙0.22重量份，黄豆饼粉1.2重量份，花生饼粉1.2重量份，糊精0.45重量份；
和/或步骤(3)所述二级种子培养基包括如下成分：玉米浆9重量份，豆油1体积份，葡萄糖3重量份，糊精1.5重量份，白砂糖3重量份，黄豆饼粉3重量份，消泡剂0.06体积份，碳酸钙0.5重量份；
和/或步骤(4)所述三级种子培养基包括如下成分：玉米浆3重量份，豆油2.5体积份，葡萄糖1.6重量份，糊精1.5重量份，花生粉1.5重量份，硫酸铵1重量份，硫酸钙0.5重量份，蛋氨酸0.3重量份，谷朊粉1.05重量份，消泡剂0.03体积份，碳酸钙0.5重量份。
进一步地，上述步骤(5)所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆10～33重量份、花生粉9～21重量份、葡萄糖4～13重量份、糊精3～10重量份、甲硫氨酸1～5重量份、植物油4～20体积份、消泡剂0.01～0.06体积份、硫酸铵2～7重量份、硫酸亚铁0.01～0.04重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.06重量份、硫酸铜0.01～0.06重量份、碳酸钙2～7重量份，谷朊粉3～10重量份。
更进一步地，上述发酵培养基包括如下成分：玉米浆11～32重量份、花生粉10～20重量份、葡萄糖5～12重量份、糊精4～9重量份、甲硫氨酸2～4重量份、植物油5～19体积份、消泡剂0.02～0.05体积份、硫酸铵3～6重量份、硫酸亚铁0.02～0.03重量份、硫酸锰0.02～0.04重量份、硫酸锌0.02～0.05重量份、硫酸铜0.02～0.05重量份、碳酸钙3～6重量份，谷朊粉4～9重量份。
更进一步地，上述发酵培养基包括如下成分：玉米浆12～15重量份、花生粉12～15重量份、葡萄糖8～11重量份、糊精5～9重量份、甲硫氨酸1～3重量份、植物油7～8体积份、消泡剂0.01～0.02体积份、硫酸铵4～5重量份、硫酸亚铁0.01～0.02重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸锌0.01重量份、硫酸铜0.01重量份、碳酸钙3重量份，谷朊粉4重量份。
进一步地，上述步骤(5)中，所使用的植物油为大豆油、棉籽油、玉米油、米糠油中的一种或几种，补油时间为开始发酵后的第20-128h中任意时间，补油量为0.05-0.5L/h﹒m3。
进一步地，上述步骤(5)中，所使用的液糖为64％-70％(w/v)浓度液糖，优选为65％-69％浓度液糖；补糖时间为开始发酵后的第20-127h中的任意时间；补糖量为1-7.5L/h﹒m3。
进一步地，上述步骤(5)中，所使用的硫酸铵浓度为20-30％(w/v)，补硫酸铵时间为开始发酵后的第20-80h中任意时间；补硫酸铵量为0.05-0.4L/h﹒m3。
进一步地，上述步骤(5)中，所使用的液氨浓度为20-30％(w/v)，控制发酵全程发酵液pH为5.6±0.2。
实验结果表明，本发明实现了以本发明特定菌株作为发酵菌株，在本发明发酵条件下制备DAOC，能够实现工业化生产，产物效价高达29300μg/mL，有利于进一步制备合成7-ADCA，具备极大的应用价值。
术语说明：本发明所述液糖为玉米淀粉制糖。
生物材料保藏：
本发明的顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)D-G3-B-2001已于2020年9月16日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO:20270。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：DAOC的IR光谱谱图。
图2：DAOC的H-NMR谱图。
图3：DAOC的C-NMR谱图。
图4：DAOC的gCOSY谱图。
图5：DAOC的gHSQC谱图。
图6：DAOC的gHMBC谱图。
图7：DAOC的质谱谱图。
具体实施方式
本发明所用菌种：顶头孢霉菌经诱变产生的菌种，是通过诱变方法获得。顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)D-G3-B-2001已于2020年9月16日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO:20270。
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法
(1)制备一级种子
取经摇瓶验证过得的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，利用无菌水刮下斜面菌种，制备成菌悬液25％(w/v)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.1的条件下培养88h，待离心菌浓达到26％，作为一级种子液。
离心菌浓：是指菌液离心(离心参数：取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟)后的菌体重量与菌液体积比。
一级种子培养基：玉米浆38重量份，豆油4.5体积份，葡萄糖8重量份，蔗糖1.1重量份，消沫剂0.02重量份，碳酸钙0.22重量份，黄豆饼粉1.2重量份，花生饼粉1.2重量份，糊精0.45重量份。
(2)制备二级种子
取一级种子按照5％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养55h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为二级种子液。
二级种子培养基：玉米浆9重量份，豆油1体积份，葡萄糖3重量份，糊精1.5重量份，白砂糖3重量份，黄豆饼粉3重量份，消泡剂0.06体积份，碳酸钙0.5重量份。
(3)制备三级种子
取二级级种子按照10％接种量接种于三级级种子培养基中，在pH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养54h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为三级级种子液。
三级种子培养基：玉米浆3重量份，豆油2.5体积份，葡萄糖1.6重量份，糊精1.5重量份，花生粉1.5重量份，硫酸铵1重量份，硫酸钙0.5重量份，蛋氨酸0.3重量份，谷朊粉1.05重量份，消泡剂0.03体积份，碳酸钙0.5重量份。
(4)发酵罐发酵
取三级级种子按照25％接种量接种于发酵培养基中，在pH为5.6、在28±0.5℃，50-100rpm，通气比0.8-1.5的条件下培养128h，得到去乙氧基脱头孢烷酸(DAOC)的发酵液，在发酵过程中，补入大豆油、硫酸铵(22％w/v)、液糖(65％w/v)、氨水(23％w/v)。补油时间为开始发酵后的第20-128h中任意时间。补糖时间为开始发酵后的第20-127h中的任意时间。补硫酸铵时间为开始发酵后的第20-80h中任意时间。氨水用于控制发酵全程发酵液pH为5.6±0.2。
发酵罐培养基：玉米浆15重量份、花生粉12重量份、葡萄糖8重量份、糊精5重量份、甲硫氨酸2重量份、植物油8体积份、消泡剂0.01体积份、硫酸铵5重量份、硫酸亚铁0.01重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸锌0.01重量份、硫酸铜0.01重量份、碳酸钙3重量份，谷朊粉5重量份。
实施例2、本发明发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法
(1)制备一级种子
取经摇瓶验证过得的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，利用无菌水刮下斜面菌种制备成菌悬液25％(重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.1的条件下培养88h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为一级种子液。
一级种子培养基：玉米浆38重量份，豆油4.5体积份，葡萄糖8重量份，蔗糖1.1重量份，消沫剂0.02重量份，碳酸钙0.22重量份，黄豆饼粉1.2重量份，花生饼粉1.2重量份，糊精0.45重量份。
(2)制备二级种子
取一级种子按照5％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养55h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为二级种子液。
二级种子培养基：玉米浆9重量份，豆油1体积份，葡萄糖3重量份，糊精1.5重量份，白砂糖3重量份，黄豆饼粉3重量份，消泡剂0.06体积份，碳酸钙0.5重量份。
(3)制备三级种子
取二级级种子按照10％接种量接种于三级级种子培养基中，在PH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养54h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为三级级种子液。
三级种子培养基：玉米浆3重量份，豆油2.5体积份，葡萄糖1.6重量份，糊精1.5重量份，花生粉1.5重量份，硫酸铵1重量份，硫酸钙0.5重量份，蛋氨酸0.3重量份，谷朊粉1.05重量份，消泡剂0.03体积份，碳酸钙0.5重量份。
(4)发酵罐发酵
取三级级种子按照25％接种量接种于发酵培养基中，在PH为5.6、在28±0.5℃，50-100rpm，通气比0.8-1.5的条件下培养128h，得到去乙氧基脱头孢烷酸(DAOC)的发酵液，在发酵过程中，补入大豆油、硫酸铵(22％w/v))、液糖(65％w/v)、氨水(23％w/v)。补油时间为开始发酵后的第20-128h中任意时间。补糖时间为开始发酵后的第20-127h中的任意时间。补硫酸铵时间为开始发酵后的第20-80h中任意时间。氨水用于控制发酵全程发酵液pH为5.6±0.2。
发酵罐培养基：玉米浆14重量份、花生粉13重量份、葡萄糖8重量份、糊精6重量份、甲硫氨酸1重量份、植物油7体积份、消泡剂0.01体积份、硫酸铵4重量份、硫酸亚铁0.01重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸锌0.01重量份、硫酸铜0.01重量份、碳酸钙3重量份，谷朊粉5重量份。
实施例3、本发明发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法
(1)制备一级种子
取经摇瓶验证过得的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，利用无菌水刮下斜面菌种制备成菌悬液25％(重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.1的条件下培养88h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为一级种子液。
一级种子培养基：玉米浆38重量份，豆油4.5体积份，葡萄糖8重量份，蔗糖1.1重量份，消沫剂0.02重量份，碳酸钙0.22重量份，黄豆饼粉1.2重量份，花生饼粉1.2重量份，糊精0.45重量份。
(2)制备二级种子
取一级种子按照5％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养55h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为二级种子液。
二级种子培养基：玉米浆9重量份，豆油1体积份，葡萄糖3重量份，糊精1.5重量份，白砂糖3重量份，黄豆饼粉3重量份，消泡剂0.06体积份，碳酸钙0.5重量份。
(3)制备三级种子
取二级级种子按照10％接种量接种于三级级种子培养基中，在PH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养54h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为三级级种子液。
三级种子培养基：玉米浆3重量份，豆油2.5体积份，葡萄糖1.6重量份，糊精1.5重量份，花生粉1.5重量份，硫酸铵1重量份，硫酸钙0.5重量份，蛋氨酸0.3重量份，谷朊粉1.05重量份，消泡剂0.03体积份，碳酸钙0.5重量份。
(4)发酵罐发酵
取三级级种子按照25％接种量接种于发酵培养基中，在PH为5.6在28±0.5℃，50-100rpm，通气比0.8-1.5的条件下培养128h，得到去乙氧基脱头孢烷酸(DAOC)的发酵液，在发酵过程中，在发酵过程中，补入大豆油、硫酸铵(22％w/v)、液糖(65％w/v)、氨水(23％w/v)。补油时间为开始发酵后的第20-128h中任意时间。补糖时间为开始发酵后的第20-127h中的任意时间。补硫酸铵时间为开始发酵后的第20-80h中任意时间。氨水用于控制发酵全程发酵液pH为5.6±0.2。
发酵罐培养基：玉米浆14重量份、花生粉14重量份、葡萄糖9重量份、糊精7重量份、甲硫氨酸2重量份、植物油8体积份、消泡剂0.02体积份、硫酸铵5重量份、硫酸亚铁0.02重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸锌0.01重量份、硫酸铜0.01重量份、碳酸钙3重量份，谷朊粉5重量份。
实施例4、本发明发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法
(1)制备一级种子
取经摇瓶验证过得的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，利用无菌水刮下斜面菌种制备成菌悬液25％(重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.1的条件下培养88h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为一级种子液。
一级种子培养基：玉米浆38重量份，豆油4.5体积份，葡萄糖8重量份，蔗糖1.1重量份，消沫剂0.02重量份，碳酸钙0.22重量份，黄豆饼粉1.2重量份，花生饼粉1.2重量份，糊精0.45重量份。
(2)制备二级种子
取一级种子按照5％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养55h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为二级种子液。
二级种子培养基：玉米浆9重量份，豆油1体积份，葡萄糖3重量份，糊精1.5重量份，白砂糖3重量份，黄豆饼粉3重量份，消泡剂0.06体积份，碳酸钙0.5重量份。
(3)制备三级种子
取二级级种子按照10％接种量接种于三级级种子培养基中，在PH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养54h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为三级级种子液。
三级种子培养基：玉米浆3重量份，豆油2.5体积份，葡萄糖1.6重量份，糊精1.5重量份，花生粉1.5重量份，硫酸铵1重量份，硫酸钙0.5重量份，蛋氨酸0.3重量份，谷朊粉1.05重量份，消泡剂0.03体积份，碳酸钙0.5重量份。
(4)发酵罐发酵
取三级级种子按照25％接种量接种于发酵培养基中，在PH为5.6、在28±0.5℃，50-100rpm，通气比0.8-1.5的条件下培养128h，得到去乙氧基脱头孢烷酸(DAOC)的发酵液，在发酵过程中，在发酵过程中，补入大豆油、硫酸铵(22％w/v)、液糖(65％w/v)、氨水(23％w/v)。补油时间为开始发酵后的第20-128h中任意时间。补糖时间为开始发酵后的第20-127h中的任意时间。补硫酸铵时间为开始发酵后的第20-80h中任意时间。氨水用于控制发酵全程发酵液pH为5.6±0.2。
发酵罐培养基：玉米浆13重量份、花生粉16重量份、葡萄糖10重量份、糊精8重量份、甲硫氨酸3重量份、植物油8体积份、消泡剂0.02体积份、硫酸铵5重量份、硫酸亚铁0.02重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸锌0.01重量份、硫酸铜0.01重量份、碳酸钙3重量份，谷朊粉5重量份。
实施例5、本发明发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法
(1)制备一级种子
取经摇瓶验证过得的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，利用无菌水刮下斜面菌种制备成菌悬液25％(重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.1的条件下培养88h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为一级种子液。
一级种子培养基：玉米浆38重量份，豆油4.5体积份，葡萄糖8重量份，蔗糖1.1重量份，消沫剂0.02重量份，碳酸钙0.22重量份，黄豆饼粉1.2重量份，花生饼粉1.2重量份，糊精0.45重量份。
(2)制备二级种子
取一级种子按照5％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养55h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为二级种子液。
二级种子培养基：玉米浆9重量份，豆油1体积份，葡萄糖3重量份，糊精1.5重量份，白砂糖3重量份，黄豆饼粉3重量份，消泡剂0.06体积份，碳酸钙0.5重量份。
(3)制备三级种子
取二级级种子按照10％接种量接种于三级级种子培养基中，在PH为5.6、在28±0.5℃、300-500rpm，通气比0.8-1.2的条件下培养54h，取10ml发酵液，3000rpm离心10分钟，待离心菌浓达到26％，作为三级级种子液。
三级种子培养基：玉米浆3重量份，豆油2.5体积份，葡萄糖1.6重量份，糊精1.5重量份，花生粉1.5重量份，硫酸铵1重量份，硫酸钙0.5重量份，蛋氨酸0.3重量份，谷朊粉1.05重量份，消泡剂0.03体积份，碳酸钙0.5重量份。
(4)发酵罐发酵
取三级级种子按照25％接种量接种于发酵培养基中，在PH为5.6在28±0.5℃，50-100rpm，通气比0.8-1.5的条件下培养128h，得到去乙氧基脱头孢烷酸(DAOC)的发酵液，在发酵过程中，在发酵过程中，硫酸铵(22％w/v)、液糖(65％w/v)、氨水(23％w/v)。补油时间为开始发酵后的第20-128h中任意时间。补糖时间为开始发酵后的第20-127h中的任意时间。补硫酸铵时间为开始发酵后的第20-80h中任意时间。氨水用于控制发酵全程发酵液pH为5.6±0.2。
发酵罐培养基：玉米浆12重量份、花生粉15重量份、葡萄糖11重量份、糊精9重量份、甲硫氨酸3重量份、植物油8体积份、消泡剂0.01体积份、硫酸铵4重量份、硫酸亚铁0.02重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸锌0.01重量份、硫酸铜0.01重量份、碳酸钙3重量份，谷朊粉5重量份。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、DAOC的检测
对本发明制备的发酵产物进行红外(IR)、H-NMR、C-NMR、gCOSY、gHSQC、gHMBC和质谱检测，结果如图1～7所示。
上述结果说明本发明方法能成功制备得到DAOC。
实验例2、本发明发酵液的效价检测
1、实验方法
发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到DAOC混合液，取制得的DAOC，检测效价。
色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS 5μm×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1体积份/min，进样量：20uL。
2、实验结果
如表1所示：
说明本发明方法能最高发酵放罐效价达到29300μg/mL，具备极大的应用价值。
综上，本发明提供了一种发酵生产DAOC的方法，能够以本发明特定菌株作为发酵菌株，在本发明发酵条件下制备DAOC，能够实现工业化生产，产物效价高达29300μg/mL，有利于进一步制备合成7-ADCA，具备极大的应用价值。

Claims (5)

1.一种发酵生产去乙酰氧基脱头孢烷酸的方法，其特征是，包括如下步骤：
（1）取保藏编号为CGMCC NO:20270的顶头孢霉菌（Cephalosporium acremonium）D-G3-B-2001，配制成菌悬液；所述菌悬液的浓度为20~30%w/v；
（2）将步骤（1）得到的菌悬液接种到一级种子培养基中，并在28±0.5℃、通气比0.8-1.1的条件下培养80-90h，得到离心菌浓为20~30%的一级种子液；所述接种为：接种量为1%，所述离心菌浓为26%；所述一级种子培养基包括如下成分：玉米浆38重量份，豆油4.5体积份，葡萄糖8重量份，蔗糖1.1 重量份，消沫剂0.02 重量份，碳酸钙0.22 重量份，黄豆饼粉1.2重量份，花生饼粉1.2重量份，糊精0.45重量份；
（3）将步骤（2）的一级种子液接种到二级种子培养基中，并在28±0.5℃、通气比0.8-1.2的条件下培养40-60h，得到离心菌浓为20~30%的二级种子液；所述接种的接种量为5%，所述离心菌浓为26%；所述二级种子培养基包括如下成分：玉米浆9重量份，豆油1体积份，葡萄糖3 重量份，糊精1.5重量份，白砂糖3重量份，黄豆饼粉3重量份，消泡剂0.06体积份，碳酸钙0.5重量份；
（4）将步骤（3）的二级种子液接种到三级种子培养基中，并在28±0.5℃、通气比0.8-1.3的条件下培养40-60h得到离心菌浓为20~30%的三级种子液；所述接种的接种量为10%，所述离心菌浓为26%；所述三级种子培养基包括如下成分：玉米浆3重量份，豆油2.5体积份，葡萄糖1.6重量份，糊精1.5重量份，花生粉1.5重量份，硫酸铵1重量份，硫酸钙0.5重量份，蛋氨酸0.3重量份，谷朊粉1.05重量份，消泡剂0.03体积份，碳酸钙0.5重量份；
（5）将步骤（4）的三级种子液接种到发酵培养基中，在28±0.5℃，通气比0.8-1.5的条件下培养120-128h，得到DAOC的发酵液，在发酵过程中，补入植物油、硫酸铵、液糖、氨水；所述接种的接种量为25%；所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆10～33重量份、花生粉9～21重量份、葡萄糖4～13重量份、糊精3～10重量份、甲硫氨酸1～5重量份、植物油4～20体积份、消泡剂0.01～0.06体积份、硫酸铵2～7重量份、硫酸亚铁0.01～0.04重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.06重量份、硫酸铜0.01～0.06重量份、碳酸钙2～7重量份，谷朊粉3～10重量份；所使用的植物油为大豆油，补入植物油时间为开始发酵后的第20-128h中任意时间； 补入植物油量为0.05-0.5L/h﹒m³；所使用的液糖为64%-70%（w/v）浓度液糖；补入液糖时间为开始发酵后的第20-127h中的任意时间；补入液糖量为1-7.5L/h﹒m³；所使用的硫酸铵浓度为20-30%（w/v），补硫酸铵时间为开始发酵后的第20-80h中任意时间；补硫酸铵量为0.05-0.4L/h﹒m³；所使用的氨水浓度为20-30%（w/v），控制发酵全程发酵液pH为5.6±0.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述菌悬液的浓度为25%w/v。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆11～32重量份、花生粉10～20重量份、葡萄糖5～12重量份、糊精4～9重量份、甲硫氨酸2～4重量份、植物油5～19体积份、消泡剂0.02～0.05体积份、硫酸铵3～6重量份、硫酸亚铁0.02～0.03重量份、硫酸锰0.02～0.04重量份、硫酸锌0.02～0.05重量份、硫酸铜0.02～0.05重量份、碳酸钙3～6重量份，谷朊粉4～9重量份。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆12～15重量份、花生粉12～15重量份、葡萄糖8～11重量份、糊精5～9重量份、甲硫氨酸1～3重量份、植物油7～8体积份、消泡剂0.01～0.02体积份、硫酸铵4～5重量份、硫酸亚铁0.01～0.02重量份、硫酸锰0.01重量份、硫酸锌0.01重量份、硫酸铜0.01重量份、碳酸钙3重量份，谷朊粉4重量份。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，所使用的液糖为65%-69%（w/v）浓度液糖。
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