FI85501B - Foerfarande foer framstaellning av polyoler genom pao industriell skala baserad fermentation av socker. - Google Patents

Description

1 85501

Teollista mittakaavaa oleva sokerien fermentointiin perustuva polyolien valmistusmenetelmä

Keksintö koskee teollista menetelmää glyserolia, 5 erytritolia ja ribitolia sisältävän polyoliseoksen valmis tamiseksi fermentoimalla aerobisesti sopivaa sokeria Moni-liella tomentosa var. pollinis-sienellä, joka on sokeria sietävä.

Tiedetään, että aerobisesti fermentoimalla sopivaa 10 sokeria hiivamaisen sienen Moniliella tomentosa var. pollings: n kanssa, saadaan erytritolia; tämän esittivät ensimmäisinä G.J. Hajny. J.H. Smith ja J.C. Garver, Applied Microbiology 12, sivut 240-246 (toukokuu 1964), jotka ni-mesivät mikrobin Torula I2A:ksi. Myöhemmin Antonie van 15 Leeuwenhoek:ssa sivulla 107-118 (1971), L.Dooms, G.L. Hen- nebert ja H. Verachtert luokittelivat sienen Moniliella tomentosa var. pollinis:ksi ja varmistivat sen kyvyn tuottaa erytritolia; kirjoittajat esittivät myös mikrobin täydellisen morfologisen kuvauksen, johon tässä viitataan. 20 Lisäksi he havaitsivat, että Moniliella voi esiintyä kahdessa eri muodossa hiivamaisena ja homemaisena muotona riippuen pääasiassa käytetyistä kasvatusolosuhteista; sivulla 10 he esittävät: "Agar-vinopinnoilla tuotetaan molempia muotoja. Stationaarisessa nestealustassa syntyy 25 homemaista muotoa, Jolla on runsaasti rihmastoa ja enemmän artrosporeja kuin blastosporeja. Ravistuspulloissa kasva-tetuissa kasvustoissa on vallitsevana hiivamainen muoto, jossa on pyöreitä, soikeita ja suorakulmaisia soluja, jot-ka ovat muodostuneet kuroutumalla ja jakautumalla, samal-30 la kun rihmastoa ei muodostu".

Aikaisemmat alan tutkijat ovat esittäneet glyserolin, erytritolin ja arabitolin tuottamisen fermentoimalla sokereita Moniliella tomentosa var. pollinis:n kanssa, mutta me olemme havainneet prosessin teollisessa kehittä-35 misessä, että fermentointituote sisältää glyserolia, ery- 2 85501 tritolia ja ribitolia erilaisina määrinä. Glyseroli on hyvin tunnettu kaupallinen artikkeli, mutta erytritolia ja ribitolia ei ole tähän asti ollut saatavana merkittävässä teollisessa mittakaavassa. Molemmilla näillä aineilla on 5 mielenkiintoisia ominaisuuksia kemiallisina välituotteina niiden polyhydroksyylifunktionaalisuuden merkitessä erilaisia käyttötapoja esim. raaka-aineena tuotettaessa polyuretaania ja muita polymeerejä. Siksi on ilmeisesti arvokasta pystyä vaikuttamaan fermentointireaktioon siten, 10 että tuotetaan enemmän erytritolia ja ribitolia kuin glyserolia, koska glyserolia on helposti saatavissa muista lähteistä. Lisäksi fermentoinnin teoreettisesti kulkiessa heksoosin kautta monofosfaattitietä, on suurempi osa fer-mentoitavasta sokerista muutettavissa ribitoliksi (83 %) 15 ja erytritoliksi (66 %) kuin glyseroliksi (50 %).

Me olemme löytäneet menetelmiä, joilla voidaan vaikuttaa fermentoinnin polymeerikomponenttien jakautumiseen kasvavaan ribitolituotannon suuntaan ja samalla suurentaa kokonaispolyolisaantoa kontrolloimalla fermentointialustan 20 ilmastusastetta. Lisäksi voidaan polyolisaantoa kasvattaa uudelleenkierrättämällä edellisten fermentointien soluja fermentointialustaan.

Hanjy on aikaisemmin esittänyt, että alemmilla il-mastusnopeuksilla tuotetaan pääasiassa erytritolia yhdessä 25 etanolin kanssa. Me olemme havainneet, että suuremmilla ilmastusnopeuksilla etanolituotanto minimoituu ja lisäksi ribi tolin osuus tuotteessa kasvaa olennaisesti (alle 2 %:sta aina 20 %:iin tai suuremmaksi). Suuremmilla hapen siirtonopeuksilla siten voidaan optimoida sokerien muutos-30 ta taloudellisesti parhaimmiksi polyoleiksi. Muuttamalla hapen siirtonopeutta voidaan saada erilaisia polyoliosuuk-. siä polyolituotteessa, kuten on toivottavaa erilaisia käyttökohteita varten.

Toinen menetelmä lisätä fermentoinnin muuntosaantoa *:·1: 35 on biomassan uudelleenkierrätys, siis käytetään seuraavas- • « · • · • 1 ♦ · 3 85501 sa fermentoinnissa siirroksena soluja, jotka on poistettu edellisestä fermentoinnista.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että kokonaispolyolisaanto ja ribitolin osuus seoksesta 5 nostetaan nostamalla fermentointialustan ilmastusastetta, jolloin tämä aikaansaadaan nostamalla fermentointiin syötetyn hapen määrää ja/tai nopeuttamalla fermentointialustan sekoitusnopeutta, ja fermentointialustasta eristetään polyolikoostumus, joka sisältää glyserolia, erytritolia ja 10 ribitolia.

Lisäksi voidaan polyolisaantoa vielä kasvattaa uu-delleenkierrättämällä aikaisemman fermentoinnin soluja.

"Ilmastointiaste" on yhdistetty tekijä, jossa ovat mukana reaktioalustaan syötetty hapen määrä ja alustan 15 sekoitusnopeus ilmoitettuna sekoittimen nopeutena tai se- koittimen pyörimisnopeutena. Yleisesti annetun kokoiselle fermentointiastialle aiheuttaa astian sisällön sekoitusas-teen suurentaminen annetulla hapensyöttötilavuudella muodostuneen ribitolimäärän kasvamisen. Samalla tavalla va-20 kiosekoituksella hapen tilavuutta kasvattamalla saadaan aikaiseksi sama vaikutus. Fermentointiastiaan syötetyllä tietyllä hapen tilavuudella on kuitenkin selvästi optimi-sekoitusmäärä ja kääntäen, ja optimiolosuhteet voidaan määrittää yksinkertaisella kokeella muistaen, että opti-25 miin saakka hapen syöttömäärän kasvattaminen tai sekoitus- asteen lisääminen on edullista toivotulle ribitolin tuottamiselle. Me olemme myös havainneet, että optimi vaihte-lee fermentointiastian koon mukaisesti ja yleisesti sekoi-tusaste voi olla pienempi annetulle hapen syöttönopeudelle 30 suuremmassa fermentointiastiassa verrattuna pienempään fermentointiastiaan.

Edullisesti happi syötetään ilmana tai happi/inert-tikaasu -seoksena, joka läheisesti muistuttaa ilman kaasu- • · · seossuhdetta, nopeudella, joka on 0,1 - 1,5 edullisesti *:**: 35 0,5 1,5 litraa/litra fermentointialustaa/minuutti siten, 4 85501 että sekoitusaste valitaan optimiksi tällä alueella olevalle ilmamäärälle tietyn kokoiselle fermentointiastialle.

"Edellisen fermentoinnin solujen uudelleenkierrä-tyksellä" me tarkoitamme, että osa siirrostuksessa käyte-5 tyistä soluista on johdettu aikaisemmasta fermentoinnista. Uudelleenkierrätetyn biomassan prosentuaalinen määrä voi vaihdella 5 - 100 %:iin aikaisemmasta fermentoinnista. Typpilähdettä, joka esitetään tämän jälkeen, voidaan myös lisätä erilaisina määrinä fermentointiastiaan, riippuen 10 uudelleenkierrätetyn biomassan määrästä. Kun soluista kierrätetään 100 % voidaan typpilähde jättää lisäämättä siten, että solut fermentoivat ainoastaan sokeria samalla pienentäen merkittävästi fermentointialustan muodostamis-kustannuksia. Jokaisessa tapauksessa tulisi uudelleenkier-15 rätettyjen solujen määrä ja lisätyn typpilähteen määrä valita siten, että varmistetaan tehokas fermentoimisteho kasvatuksesta toiseen.

Toimittaessa kyseisen keksinnön prosessin mukaisesti voi fermentoinnissa tuotettu polyolien seos, siis gly-20 serolin, erytritolin ja ribitolin seos, sisältää enemmän kuin 20 p-% ribitolia.

Moniliella tomentosa var. pollinis’ta toimittaa Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Hollanti merkinnällä CBS 461.61 ja sitä oli myös tallennettu-‘25 na ja on yleisesti saatavissa Commonwelt Mycological Institute Culture Collection'1ta (CMI cc) Ferry Lane, Kew, Richmond, Surrey TW9 3AF, Yhdistynyt Kuningaskunta numerolla (CMI cc) 271648. Mikrobisolut kasvatetaan kiinteässä alustassa, joka sisältää mallasuutetta (4 %), hiivauutetta 30 (0,2 %) ja agaria (2 %). Näin muodostunut kasvusto siir- rostetaan tämän jälkeen steriloidulle alustalle, jossa on _ . sokeria (määrästä puhutaan myöhemmin) ja typpilähdettä.

Fermentointi suoritetaan lämpötilassa 27-32 °C aloi-tus-pH:n ollessa 3-6, edullisesti 4-5. Fermentointi lope-35 tetaan, kun kaikki sokeri on käytetty. Alustan sisältämä 5 85501 sokerimäärä voi olla 20-45 %, edullisesti se on 30-35 %. Sopivia sokereita käytettäväksi sekä kasvatuksessa että fermentoinnissa ovat dekstroosi (glukoosi), sakkaroosi, fruktoosi tai maltoosi. (Selityksessä ja patenttivaati-5 mukeissa on kaikki prosentit ja osat annettu tilavuutta kohti, ellei toisin ole ilmoitettu).

Aikaisemmissa prosesseissa, kuten Hajnyn esittämässä prosessissa, esitetään fermentoinnissa käytettäväksi erilaisia typpilähteitä kuten esimerkiksi hiivauutetta, 10 ureaa, maissin liotusnesteitä, mallasituja, sokeriruokome-lassia, mallasuutetta ja tislainten kuivia liukoisia aineita. Kyseisen keksinnön prosessissa saavutetaan hyviä tuloksia käyttämällä 0,5 % hiivauutetta ja 0,1 % ureaa tai 2 % maissin liotusnestettä ja 0,2 % ureaa. Aloitus-pH:n 15 tulisi olla noin 3,0 - 6,0 ja se laskee noin 2,0 - 3,5 fermentoinnin aikana. L. Hanssensin, A. Van Regenmortelin ja H Veractertin, Applied Microbiology, Voi. 24, No. 5 sivut 831-833 (marraskuu 1972), mukaan saadaan erilaisia kokonaispolyolien ja erytritolin saantoja laboratoriofer-20 mentoinneilla, jotka on suoritettu erilaisilla vakio pH-arvoilla. Me olemme havainneet, että työskenneltäessä suuremman mittakaavan fermentoreilla (2-litran fermenttorit tai suuremmat), ovat kokonaispolyoli- ja erytritolisaannot vähemmän herkkiä aloitus-pH:lie, sen vaihdellessa alueella : * 25 4,0 - 6,0. Kontaminoitumisongelmien välttämiseksi tai nii den tekemiseksi mahdollisimman pieniksi, on edullinen aloitus-pH 4-5. Fermentointia jatketaan, kunnes kalkki sokeri on käytetty (fermentoimisaika vaihtelee tavallisesti alueella 4-12 päivää riippuen käytetyn sokerin määrästä), 30 jonka jälkeen kasvatus lopetetaan ja solut poistetaan kas-vatusliuoksesta esimerkiksi sentrifugoimalla. Kasvatus-. liuos, josta on poistettu solut ja joka sisältää erytrito- lia, ribitolia ja glyserolia, voidaan käyttää sellaise- • · · ·* naan, joko puhdistettuna tai ilman puhdistusta (esim. ult- *:*·: 35 rasuodatus ja demineralisointi), tiettyihin sovellutuksiin 6 85501 esim. polymeeri teollisuudessa. Puhdistettua kasvatusliuos-ta voidaan myös konsentroida 60-80 % liuotettua kiintoainesta ja kiteyttää erytritoli siitä esim. menetelmällä, jonka ovat esittäneet J.M. Roxburg, J.F.T. Spencer ja H.R.

5 Sallens, Canadian Journal Of Technology, Voi. 34 sivut 248-253 (1956). Erytritolikiteiden kiteyttämisen jälkeen jäänyt liuos, jossa on seoksena (kiteytymätöntä) erytrito-lia, ribitolia ja glyserolia, voidaan myös käyttää sopivan käsittelyn jälkeen.

10 Keksinnön mukainen prosessi suoritetaan edullisesti siten, että läsnä on polysakkaridi ksantaanikumi, jolla on kyky säilyttää Moniliella tomentosa var. pollinis:n solut fermentointialustassa ja vähentää niiden poistumista vaahdon välityksellä, jota muodostuu fermentoinnin aikana.

15 Läsnä voi edullisesti olla 100-500 ppm ksantaanikumia ja erinomaisia tuloksia saadaan noin 300 ppm:llä. Voidaan käyttää myös enemmän kumia kuin on tarpeellista solujen pitämiseksi fermentointialustassa (siis enemmän kuin noin 500 ppm), mutta tällainen ylimäärä on epätaloudellista.

20 Kokonaisprosessia parannetaan myös lisäämällä fer- mentointialustaan konventionaalista vaahtoamisenestoainet-ta. Edullisempia ovat synteettiset vaahtoamisenestoaineet (esim. silikonityyppi tai rasva-alkoholit) kuin luonnontuotteet (kuten sianihraöljy), koska niitä voidaan käyttää 25 pienempinä pitoisuuksina ja koska lopullista fermentointi-liuosta ei tarvitse tehokkaasti puhdistaa niiden poistami-; ' : seksi. Useimmilla synteettisillä kaupallisilla vaahtoani! - senestoaineilla on 200-300 tai 400 ppm riittävä optimi-vaahtoamiskontrolliin.

30 Seuraavat esimerkit on tarkoitettu esittämään ky seisen keksinnön käytännöllistä puolta.

Siirrosviljelmien valmistaminen 500 ml:n Erlenmeyerelhln, joissa on 50 ml kasvatus-\ alustaa, joka sisältää 20 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutet- ' ·: 35 ta, 0,1 % ureaa ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostettiin 7 85501 kasvustoa kiinteästä alustasta ja kasvatusta jatkettiin 3-4 päivää aloittaen pH-arvosta 5, lämpötilassa 30 °C ja edestakaisella sekoituksella, jonka nopeus oli 100 heilahdusta minuutissa. Näitä kasvustoja käytettiin seuraavissa 5 esimerkeissä.

Esimerkki 1

Kuuteen 2-litran fermenttoriin, joissa oli 1,5 litraa kasvatusalustaa, jossa oli 32 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutetta, 0,1 % ureaa, 300 ppm ksantaanikumia ja 300 10 ppm SAG 471® (dimetyylipolysiloksaani vaahtoamisenestoaine

Union Carbidilta), siirrostettiin siirrosviljelmällä 2 %:n määrällä fermentoimisalustan tilavuudesta. Ilman virtausnopeus oli 0,6 litraa ilmaa/litra fermentointialustaa/ minuutti. Fermenttorissa käytettiin erilaisia sekoittimen 15 nopeuksia, jotka vaihtelivat välillä 400-740 kierrosta mi nuutissa. Lämpötila pidettiin vakiona 30 °C:ssa ja fermen-tion annettiin jatkua 11 päivää. Tämän ajan lopussa analysoitiin fermentointialustan koostumus ja laskettiin poly-olisaannot ja koostumukset. Tulokset esitetään taulukossa 20 1.

Taulukko 1

SekoUtLlnc-n nopeus EvtrlloU Glyseroli RlMtoll kierrosta min aanto |~--Saanto | % Saanto Γ~ 25__% (D (2) % ^ (2) * (1) 400 28,5 87 3;8 12 0,4 1 V 485 28 89 3,2 10 0,3 1 :*: 30 535 30,7 88 3,5 10 0,5 2 620 36,8 80 6,5 14 2,4 6 665 35,8 70 10;0 20 5 ,2 10 740 29/6 56 13,7 26 9, 1 17 -“· 35 (1) käytettyä dekstroosia kohti *:·*: (2) kokonaispolyolia kohti β 85501

Esimerkki 2

Viiteen 2-litra fermentoriin, joissa oli 1,5 litraa kasvatusalustaa, jossa oli 3 % dekstroosia, 300 ppm ksantaanikumia ja 300 ppm SAG 471, siirrostettiin soluja, 5 jotka oli otettu talteen aikaisemmasta fermentoinnista sentrifugoimalla. Uudelleen kierrätettyjen solujen määrä vaihteli välillä 7-100 % ja typpilähteen määrä vaihteli välillä 0,5 - 0 % siis käänteisesti uudelleen kierrätettyjen solujen määrään verrattuna. Ilman virtausnopeus oli 10 0,6 litraa/litra/ minuutti ja sekoittimen nopeus oli 680 kierrosta minuutissa. Aloitus-pH oli säädettv 4:ään laimealla suolahapolla. Fermentoimisalustan koostumus analysoitiin 9 päivän kuluttua ja laskettiin saannot. Tulokset esitetään taulukossa 2.

15 Taulukko 2

Solujen uudel- Kokonaispolyoli- leen kierrätys Erytritolisaanto saanto (1) % 20__(1) %__ 7 35 43 20 40 47 40 38 55 : 25 60 38 55 100 50 70 :Y: 30 (1) käytettyä dekstroosia kohti "Kokonaispolyoleihin" kuuluvat erytritoli, glyseroli ja ... ribitoli.

• · *

Claims (9)

9 85501

1. Teollinen menetelmä glyserolia, erytritolia ja ribitolia sisältävän polyoliseoksen valmistamiseksi fer- 5 mentoimalla aerobisesti sopivaa sokeria Moniliella tomen-tosa var. pollinis-sienellä, tunnettu siitä, että kokonaispolyolisaanto ja ribitolin osuus seoksesta nostetaan nostamalla fermentointialustan ilmastusastetta, jolloin tämä aikaansaadaan nostamalla fermentointiin syötetyn 10 hapen määrää ja/tai nopeuttamalla fermentointialustan se-koitusnopeutta, ja fermentointialustasta eristetään poly-olikoostumus, joka sisältää glyserolia, erytritolia ja ribitolia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-15 n e t t u siitä, että ilmaa tai happi/inerttikaasuseos- ta, joka läheisesti muistuttaa ilman kaasuseossuhdetta, syötetään nopeudella 0,1 - 1,5 litraa/litra fermentointi-alustaa/minuutti.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että Moniliella tomentosa var. pollinis-sienen soluja aikaisemmasta fermentoinnista kierrätetään uudelleen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5-100 % aikaisemman fermentoinnin 25 soluista uudelleenkierrätetään prosessiin.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen mene-telmä, tunnettu siitä, että sokeri on dekstroosi.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sokeria on fermentoin- 30 tiliuoksessa fermentoinnin alussa määrässä 20-45 %.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että pH fermentoinnin alussa säädetään arvoon 3-6, edullisesti arvoon 4-5.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen mene- ·:·1: 35 telmä, tunnettu siitä, että ksantaanikumia on läs-.· nä 100-500 ppm fermentointialustasta. · · * · · 10 85501

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myös tavanomaista vaahdonestoainetta lisätään fermentointiin. n 85501