CN116949106A - 利用赖氨酸芽孢杆菌处理发酵酿酒废弃物制备农用级γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种利用赖氨酸芽孢杆菌处理发酵酿酒废弃物制备农用级γ‑聚谷氨酸的方法。本发明利用从酱油发酵沼渣中分离获得的球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD‑LS‑156进行发酵酿酒废弃物的处理，首先将酿酒废弃物通过酸水解、调节pH和膜过滤除盐处理，为后续微生物发酵提供碳源能源和谷氨酸底物；之后采用球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD‑LS‑156在高盐条件下发酵处理；再将发酵液在特定的条件下酸解处理至聚合物达到农用级别20～100KD，再利用微滤膜除菌、纳滤膜浓缩，并对产物进一步浓缩制备得到农用级γ‑聚谷氨酸产品，实现了酿酒废弃物的高值化利用，且降低了原料成本。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产γ-聚谷氨酸技术领域，具体涉及一种利用赖氨酸芽孢杆菌处理发酵酿酒废弃物制备农用级γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
酿酒废弃物主要包括酒糟、窖底物、黄水等，酿酒过程中所产生废弃物的营养和微生物一般都比较丰富，不进行处理极易引起环境污染。现有技术中最常见的处理方式是将其制备成肥料进行利用，然而，酿酒废弃物中主要是谷物类，且其中谷氨酸含量非常高，将其直接转化为肥料等的方式难以实现其高值化利用，现有技术中已报道的也有利用其内丰富的谷氨酸含量制备γ-聚谷氨酸的方法，但是使用的是枯草芽孢杆菌等，发酵制备γ-聚谷氨酸时还需要添加多种物质进行营养元素等的调整，导致成本较高且产量也不理想。
发明内容
发明人在研究过程中获得了一株球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)LD-LS-156，该菌株具有在5％以上的盐水溶液中生长并以谷氨酸为底物发酵生产γ-聚谷氨酸的特性，进一步对筛选到的球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)LD-LS-156进行酿酒废弃物的处理，发现该菌非常适合酿酒废弃物酸水解、中和后含高谷氨酸和盐浓度的水解液发酵生产γ-聚谷氨酸。由此，本发明的目的在于提供一种利用赖氨酸芽孢杆菌处理发酵酿酒废弃物制备农用级γ-聚谷氨酸的方法，其包括以下步骤：
S1，酿酒废弃物的预处理：通过酸水解将酿酒废弃物中的蛋白质水解至谷氨酸和葡萄糖含量不再发生变化，调节pH至中性，固体颗粒浓度低于10％，使用板框过滤机过滤固体颗粒，压滤液使用微滤膜浓缩并滤除去不溶物，将浓缩液使用纳滤膜除去NaCl成分，并截留分子量100KD以上的化合物成分；
S2，制备发酵种子液：制备嗜盐球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)LD-LS-156发酵种子液；
S3，调节步骤S1中获得的渗透液至谷氨酸质量体积终浓度为1～5％、葡萄糖质量体积终浓度为1～5％，将步骤S2中的发酵种子液接种至调节后的浓缩液中，25～35℃、120～300rpm条件下，发酵培养12～96h，获得发酵液；
S4，将发酵液调节pH至2.0～5.0，在温度为70～90℃条件下酸解2～6h，离心去除菌体，收集上清液获得20～100KD的γ-聚谷氨酸初级产品；
S5，将γ-聚谷氨酸初级产品使用微滤膜浓缩除去不溶物，再使用纳滤膜截留分子量100KD以上产物，得到的浓缩液即为农用级γ-聚谷氨酸；
作为一种优选的实施方式，步骤S5中农用级γ-聚谷氨酸中γ-聚谷氨酸的聚合度为20～100KD，质量体积浓度为2～4％。
作为一种优选的实施方式，步骤S3中的发酵条件为30℃，200rpm，发酵培养48h。
作为一种优选的实施方式，步骤S1中酿酒废弃物酸水解的条件为盐酸终浓度为6.0～7.0mol/L，水解温度为120～130℃，水解时间为10～12h。
作为一种优选的实施方式，板框压滤机过滤固体颗粒时的压力为0.3～1.0Mpa。
作为一种优选的实施方式，步骤S2中发酵种子液的制备包括以下步骤：先将嗜盐球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156在LB培养基中培养获得一级种子液，将一级种子液按2～5％的接种量接种至二级培养基中，在25～35℃，120～220rpm培养12～24h，即得发酵种子液。
作为一种优选的实施方式，所述二级培养基的成分为：糖蜜20～50g/L、柠檬酸钠20～50g/L、尿素5～20g/L、氯化钠20～100g/L、磷酸二氢钾0.5～3g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L。
作为一种优选的实施方式，步骤S4中酸解的条件为pH为3.5，温度为85℃，处理时间为4h。
作为一种优选的实施方式，所述酿酒废弃物选自白酒酿酒废弃物，包括但不限于固体酒糟、黄水、窖底液。
本发明利用从酱油发酵沼渣中分离获得的球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)LD-LS-156进行酿酒废弃物的处理，首先将酿酒废弃物通过酸水解、调节pH和膜过滤除盐处理，为后续微生物发酵提供碳源能源和谷氨酸底物；之后采用球形赖氨酸芽孢杆菌LD-LS-156在高盐条件下发酵处理；再将发酵液在特定的条件下酸解处理至聚合物达到农用级别20～100KD，再利用微滤膜除菌、纳滤膜浓缩，并对产物进一步浓缩制备得到农用级γ-聚谷氨酸产品，其可直接应用于农业生产中，如土壤改良剂、保水剂等，实现了酿酒废弃物的高值化利用，降低了原料成本。
将酱酒酿造过程中产生的窖底液浓缩后经过盐酸水解，其谷氨酸含量调整为1～5％(换乘成浓缩液原始浓度计算)，采用嗜盐球形赖氨酸芽孢杆菌LD-LS-156以该水解液发酵生产γ-聚谷氨酸，其转化率可达到75％以上，一吨窖底浓缩液可以生产12公斤γ-聚谷氨酸产品(以γ-聚谷氨酸纯计)，通过多级膜浓缩工艺，一吨窖底浓缩液最终可生产获得质量浓度为3.5％的γ-聚谷氨酸340L。
附图说明
图1为本发明利用发酵废弃物生产农用级γ-聚谷氨酸的流程图；
图2为实施例2中酿酒废弃物预处理工艺中不同盐酸终浓度条件下水解后谷氨酸和葡萄糖含量的变化情况；
图3为实施例2中酿酒废弃物预处理工艺中不同水解温度条件下水解后谷氨酸和葡萄糖含量的变化情况；
图4为实施例2中酿酒废弃物预处理工艺中不同水解时间谷氨酸和葡萄糖含量的变化情况；
图5为实施例3中γ-聚谷氨酸产量随发酵时间的变化情况；
图6为实施例4中不同pH酸解条件对低聚合度γ-聚谷氨酸产量的影响；
图7为实施例4中不同温度酸解条件下对低聚合度γ-聚谷氨酸产量的影响；
图8为实施例4中不同水解时间下低聚合度γ-聚谷氨酸产量的变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1菌株的筛选
(1)菌体的富集：将收集的酱油发酵沼渣样品(来自于巧媳妇食品集团)加入到纯水中搅拌均匀，并取适量接种到LB液体培养基中，30℃、220rpm，培养24h；
(2)初筛：将菌液稀释涂布到LB固体培养基(培养基中添加适量的谷氨酸钠)，30℃、220rpm，培养24h；
(3)分离纯化：从平板上选取生长速度快、菌落大且有粘液的菌落，进一步在平板上纯化；
(4)复筛：将分离纯化的菌种接种至LB液体培养基(培养基中添加5％NaCl及4％的谷氨酸钠)，选取能在该培养基中快速生长，且能使发酵液变粘稠的菌株，并检测发酵液中的聚谷氨酸含量，得到一株耐盐且产γ-聚谷氨酸性能较好的菌株。
该菌株在LB平板培养基上的形态学特征为：菌落呈乳白色，表面光滑有粘性，边缘不规整，中央隆起或者凹陷，菌落直径2～4mm。
其生理生化特征为：革兰氏阳性，细胞壁具有较厚的肽聚糖层，能够抵抗晶体染色过程中的脱色，呈现革兰氏阳性染色反应；在不利的环境条件下能形成耐热、耐干燥、耐化学消毒的芽孢；可完全利用无机盐作为营养物质生长；好氧菌，最适生长温度28～30℃；为嗜盐菌，在含盐时有更好的发酵性能，最高可在质量浓度10％的氯化钠中生长；谷氨酸依赖型菌株，可在有谷氨酸时产生聚谷氨酸。
利用16sRNA进行鉴定，通过Gene Bank比对，最终确定为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156。
该菌株命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156，并于2023年5月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2023775，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例2酿酒废弃物的预处理优化
(1)将浓缩后的窖底液加入适量的浓盐酸进行酸水解，以水解液中谷氨酸和葡萄糖浓度不再增加为终点。以贵州某酒厂废弃物(通过蒸发工艺浓缩的窖底液)为例，通过实验优化确定水解条件，结果如图2-4所示，其中，图2为不同盐酸浓度条件下水解后谷氨酸和葡萄糖的含量变化，图3为不同温度下水解后谷氨酸和葡萄糖的含量变化，图4为不同水解时间谷氨酸和葡萄糖的含量变化。
由此确定水解工艺为：盐酸终浓度为3.0～8.0mol/L，水解温度为100～140℃，水解时间为8～15h，优选的条件为：盐酸终浓度为6.0～7.0mol/L，水解温度为120～130℃，水解时间为10～12h。
(2)将水解后的产物使用NaOH调节pH值为7.0左右，并调整固体颗粒浓度低于10％，使用板框压滤机过滤固体颗粒，操作压力为0.3～1.6Mpa，优选为0.5～1.3Mpa，更优选的为0.8～1.2Mpa；将压滤液使用微滤膜浓缩，并滤除去不溶物，将浓缩后清夜用纳滤膜除去其中NaCl(＞90％)成分，并截留分子量100KD以上的化合物分子，同时使得液体浓缩5～20倍，其中最优浓缩倍数为10～12倍。
实施例2发酵工艺确定
以实施例1得到的谷氨酸和葡萄糖浓度均不在增加的水解液体为原料确定发酵工艺如下：
(1)菌体活化：将球形赖氨酸芽孢杆菌LD-LS-156斜面从4℃冰箱中取出，在25～35℃培养箱中活化2～8h；
(2)一级种子液：将活化好的菌接种至灭菌好的液体LB培养基中，在25～35℃，转速120～220rpm条件下培养12～24h；
(3)二级种子液：将一级种子液按照2～5％的接种量接种至二级培养基中，在25～35℃，转速120～220rpm条件下培养12～24h，即得二级种子液，其中二级培养基成分为：糖蜜20～50g/L、柠檬酸钠20～50g/L、尿素5～20g/L、氯化钠20～100g/L、磷酸二氢钾0.5～3g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L；
(4)将实施例1中得到的浓缩后的渗透液稀释，使其谷氨酸浓度为1～5％，优选为2～4％，同时补充葡萄糖，使其终浓度为1～5％，优选为2～4％；将二级种子液按照1～3％的接种量接种至上述调节好的浓缩液中，在25～35℃，120～300rpm条件下发酵培养12～96h，γ-聚谷氨酸产量随发酵时间的变化情况参见图5。
实施例3发酵液后处理工艺的确定
(1)为了得到农用级20～100KD分子量的γ-聚谷氨酸，首先对酸解工艺进行探究：使用浓盐酸调节实施例2中获得的发酵产物，其目的是降低发酵液粘度，同时使得γ-聚谷氨酸的分子量降低至20～100KD水平，结果如图6～8所示，其中图6为不同pH条件对低聚合度γ-聚谷氨酸产量的影响，图7为不同温度条件对低聚合度γ-聚谷氨酸产量的影响，图8为不同水解时间对低聚合度γ-聚谷氨酸产量的影响。
由此确定水解工艺为：pH为2.0～5.0，温度为70～90℃，时间为2～6h，优选的为终pH为3.5，温度为85℃，时间为4h。
将水解产物使用管式离心机，8000～12000rpm离心除去菌体，收集上清液，即为20～100KD的γ-聚谷氨酸初级产品。
(2)将获得的农用级γ-聚谷氨酸初级产品使用微滤膜浓缩除去不溶物，然后使用纳滤膜截留分子量20KD以上产物，产品浓缩3～15倍，使γ-聚谷氨酸的产品浓度为2～4％。
实施例4
本实施例提供一种利用赖氨酸芽孢杆菌处理发酵酿酒废弃物制备农用级γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
S1，酿酒废弃物的预处理：将发酵酿酒废弃物窖底液(来自于贵州省某酒厂)浓缩后，加入浓盐酸至盐酸终浓度在6～7mol/L，在120～130℃条件下水解10～12h至谷氨酸和葡萄糖浓度均不在增加后，调节pH至中性，固体颗粒浓度低于10％，使用板框压滤机过滤固体颗粒，操作压力为0.8～1.2Mpa；
将压滤液使用微滤膜浓缩，并虑去不溶物，将浓缩后清夜使用纳滤膜除去其中NaCl(＞90％)成分，同时使得液体浓缩10倍；
S2，制备发酵种子液，发酵菌液的制备方法如下：
一级种子液：将活化好的球形赖氨酸芽孢杆菌LD-LS-156接种至灭菌好的液体LB培养基中，在30℃，200rpm条件下培养16h；
二级种子液(即发酵菌液)：将一级种子液按照接种量2～5％接种至二级培养基中，30℃、220rpm条件下培养18h，其中二级培养基的成分为：糖蜜30g/L，柠檬酸钠20g/L，尿素10g/L，氯化钠50g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.3g/L；
S3，将步骤S1中浓缩后的渗透液转移到发酵罐中并稀释调整，使谷氨酸终浓度为2～4％，同时补充葡萄糖，使其终浓度为2～4％，将制备好的发酵菌液按照2％接种量接种至发酵罐中，在30℃、200rpm条件下，培养48h得发酵产物；
S4，向发酵产物中添加浓盐酸调节pH至3.5，加热至85℃，酸解4小时后，将水解产物使用管式离心机，8000～12000rpm除去菌体，收集上清液，即得20～100KD的γ-聚谷氨酸初级产品；
S5，将获得的γ-聚谷氨酸初级产品使用微滤膜浓缩除去不溶物，然后使用纳滤膜截留分子量20KD以上产物，产品浓缩10倍，得到的浓缩液即为农用级γ-聚谷氨酸，其聚合度为20～100KD，测得γ-聚谷氨酸的浓度为3.5％。
本发明首次使用酿酒副产物为原料，利用嗜盐球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156发酵生产具有高附加值的γ-聚谷氨酸产品，由于酿酒废弃物成分相对复杂，本发明采取合适的工艺，在保证经过发酵后制备得到的γ-聚谷氨酸的产量的同时使得发酵处理后的废渣中必须氨基酸和pH值提高，大分子化合物降解成了易吸收的小分子产物，更符合饲料原料的要求，本发明通过对富含谷氨酸的酿酒废弃物的多次高质化利用，提升了酿酒废弃物的价值，降低了废弃物的处理成本，实现了环境和经济的双赢发展。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.利用赖氨酸芽孢杆菌处理发酵酿酒废弃物制备农用级γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，酿酒废弃物的预处理：通过酸水解将酿酒废弃物中的蛋白质水解至谷氨酸和葡萄糖含量不再发生变化，调节pH至中性，固体颗粒浓度低于10％，使用板框过滤机过滤固体颗粒，压滤液使用微滤膜浓缩并滤除去不溶物，将浓缩液使用纳滤膜除去NaCl成分，并截留分子量100KD以上的化合物成分；
S2，制备发酵种子液：制备嗜盐球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156发酵种子液；
S3，调节步骤S1中获得的渗透液至谷氨酸质量体积终浓度为1～5％、葡萄糖质量体积终浓度为1～5％，将步骤S2中的发酵种子液接种至调节后的浓缩液中，25～35℃、120～300rpm条件下，发酵培养12～96h，获得发酵液；
S4，将发酵液调节pH至2.0～5.0，在温度为70～90℃条件下酸解2～6h，离心去除菌体，收集上清液获得20～100KD的γ-聚谷氨酸初级产品；
S5，将γ-聚谷氨酸初级产品使用微滤膜浓缩除去不溶物，再使用纳滤膜截留分子量100KD以上产物，得到的浓缩液即为农用级γ-聚谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中农用级γ-聚谷氨酸中γ-聚谷氨酸的聚合度为20～100KD，质量体积浓度为2～4％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中的发酵条件为30℃，200rpm，发酵培养48h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中酿酒废弃物酸水解的条件为盐酸终浓度为6.0～7.0mol/L，水解温度为120～130℃，水解时间为10～12h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，板框压滤机过滤固体颗粒时的压力为0.3～1.0Mpa。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中发酵种子液的制备包括以下步骤：先将球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156在LB培养基中培养获得一级种子液，将一级种子液按2～5％的接种量接种至二级培养基中，在30～37℃，120～220rpm培养12～24h，即得发酵种子液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述二级培养基的成分为：糖蜜20～50g/L、柠檬酸钠20～50g/L、尿素5～20g/L、氯化钠20～100g/L、磷酸二氢钾0.5～3g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中酸解的条件为pH为3.5，温度为85℃，处理时间为4h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒废弃物选自白酒酿酒废弃物，包括但不限于固体酒糟、黄水、窖底液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒废弃物为浓缩后的窖底液。
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