CN109504719B

CN109504719B - 一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法

Info

Publication number: CN109504719B
Application number: CN201811554340.3A
Authority: CN
Inventors: 李德衡; 赵兰坤; 徐庆阳; 马延和; 刘元涛; 赵春晓; 许传高
Original assignee: Hulunbeier Northeast Fufeng Biotechnologies Co ltd; Tianjin University of Science and Technology; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Hulunbeier Northeast Fufeng Biotechnologies Co ltd; Tianjin University of Science and Technology; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109504719A

Abstract

本发明属于氨基酸技术领域，公开了一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法，其包括如下步骤：将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵至24h时，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，将滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加发酵罐培养基B，继续发酵16h，完成发酵。本发明培养基的优化不但使得谷氨酸发酵过程更加稳定，易于控制，而且提高了谷氨酸产量和糖酸转化率，提高了发酵液的质量，降低了谷氨酸提取的成本，综合效益得到了提高。

Description

一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，涉及一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是谷氨酸发酵的菌株，属于兼性好氧菌，培养基成分及培养条件不同，产物也不同。在谷氨酸发酵过程中，当培养基中碳氮比的改变会影响菌株增殖和谷氨酸合成。当发酵液 pH 呈酸性时，生成的谷氨酸会进一步转化为乙酰谷氨酰胺。因此，谷氨酸发酵条件优化主要为培养基组分和发酵过程参数控制优化两方面。在发酵过程中，菌种自身的发酵特性有时会发生变化，导致批次间发酵性能出现巨大差异。一旦菌种发酵特性发生改变，菌体对环境变化的适应能力和产酸能力就会下降，表现为补料之后出现“只耗糖、不产酸”的现象，最终谷氨酸浓度很低，造成发酵性能不稳定。谷氨酸发酵的前期主要菌株增殖迅速，中后期菌株增殖速度放缓，但是谷氨酸合成加快，是合成分泌谷氨酸的关键时期。

以酵母粉或玉米浆作为谷氨酸发酵培养基的氮源，存在着色素杂质多、内毒素毒害菌体和价格较高等不足，在副产品方面，发酵遗留菌体是其中最主要的副产物。一般的菌体处理方法都是将菌体经过简单处理后用作有机肥料，这样不仅降低了其产品附加值，还造成了资源的极大浪费。因此为了降低生产成本和实现绿色生产，可以将发酵菌体蛋白进行处理后用作其发酵原料，实现资源的循环利用。

发酵制备谷氨酸工艺中发酵培养基的优化是提高发酵效率的重要因素，申请人之前的专利技术“利用谷氨酸发酵废弃菌体制备发酵培养基的方法”对现有技术培养基进行了改进和优化，其包括高粱秸秆水解液15%，菌体水解液12%，葡萄糖5%，米糠提取物1.2%，玉米浆1%，贝壳粉0.02%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，其余为水；该培养基降低了成本，但是存在色素较多，粘度大以及杂质多的氮源和碳源物质，使得发酵过程难以控制，极易造成发酵的不稳定性及分离提取的困难；而且该专利文献对菌体蛋白的处理方法采用了浓度较高的盐酸，容易对氨基酸造成破坏，导致水解产物的营养价值较低。本研究继续对发酵培养基进行了进一步地探讨，旨在开发一种发酵效率高，后期分离谷氨酸相对容易的发酵培养基；旨在提高发酵效率和提取效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法，其包括如下步骤：

将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度35-39℃，通风比1∶（0.5-2），搅拌转速300-500r/min，溶氧维持在15-25％，将发酵罐与陶瓷膜偶联，发酵至24h时，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，将滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加发酵罐培养基B，继续发酵16h，完成发酵；整个发酵过程中，通过流加泡敌消泡，同时流加25％的氨水控制发酵液的pH值至7.0-7.2。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）将产谷氨酸的黄色短杆菌按10-15％接种量将种子液接入装有发酵培养基A的全自动发酵罐中进行发酵培养，发酵温度38℃，通风比1∶0.7，搅拌转速500r/min，溶氧维持在20％，将发酵罐与陶瓷膜偶联，发酵至24h时，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，将滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加发酵罐培养基B，继续发酵16h，完成发酵；整个发酵过程中，通过流加泡敌消泡，同时流加25％的氨水控制发酵液的pH值至7.0-7.2；

任选地，步骤2）提取谷氨酸。

进一步地，所述发酵培养基B是在发酵培养基A的基础上添加肌醇和甘油。

进一步地，所述发酵培养基A为：葡萄糖50g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L，KCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，V_B110mg/L，黄腐酸1mg/L，生物素7μg/L，菌体酶解液60ml/L，在115℃下灭菌15min。

进一步地，所述发酵培养基B为：葡萄糖50g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L，KCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，V_B110mg/L，黄腐酸1mg/L，生物素7μg/L，菌体酶解液60ml/L，肌醇100mg/L，甘油500mg/L，在115℃下灭菌15min。

优选地，

所述菌体酶解液的制备方法为：取谷氨酸发酵液中的废弃菌体，干燥至水分含量小于5wt％的干菌体，用水稀释至干菌体浓度为40g/L，置于高速剪切机中以10000rpm的速度剪切120s，得到菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的浓度为0.8mol/L的盐酸溶液，混匀，在95℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶进行水解，然后陶瓷膜过滤，收集滤液，即得菌体酶解液。

优选地，

所述陶瓷膜的截留分子量为5000-20000Da。

优选地，

所述的胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为6h。

优选地，

所述的胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，胰蛋白酶与底物的质量比为4%。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明依据不同阶段菌株产氨基酸的特点，将发酵培养基分为发酵培养基A和发酵培养基B，采用膜偶联透析分批发酵使用，减少发酵过程中副产物乙酸、乳酸等物质的产生，提高了发酵效率，并且氨基酸发酵液透明度高，杂质少，分离提取更为简易，后期更容易获得纯度高的产品；

本方法以谷氨酸发酵液中的废弃菌体蛋白为原料，经胰蛋白酶水解后代作为有机氮源制成发酵培养基，原料来自发酵后遗留菌体，成本低廉，与用做饲料相比，蛋白效价更高，效益更好，可以直接降低工业成本，提高产品效益。通过添加菌体酶解液来替代玉米浆，可以减少发酵过程中色素含量高、容易起泡、溶氧效率低以及传质阻力大等问题。

本发明在水解菌体中，利用高速剪切机剪切处理120s，能够大幅提高菌体破壁率，从而提高水解效率；本发明采用稀盐酸进行预处理，所用酸浓度较小，则酸对氨基酸破坏程度很小，继而采用温和的酶解方式，总游离氨基酸含量更高，从而能保留水解产物的营养价值。由于菌体酶解液中含有一定量的甲硫氨酸，因此培养基中无需添加甲硫氨酸，节省了原料开支。

黄腐酸中含有大量酚羟基、羰基等基团，电解程度较高，能够促进谷氨酸合成过程中利用O₂作为氢受体，进而减少丙酮酸作为氢受体，因此副产物乳酸和丙氨酸的生成量减少，进而提高谷氨酸的产量。

菌体发酵中后期加入适量的肌醇，既可以强化CO₂固定反应, 削弱乙醛酸循环,保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给α-酮戊二酸，通过还原氨基化反应，大量积累谷氨酸，提高发酵转化率；甘油提供碳骨架，促进氨基酸的合成，并且能够提高细胞膜通透性，促进氨基酸分泌到细胞外。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种氨基酸发酵培养基，其包括发酵培养基A和发酵培养基B，所述发酵培养基A和发酵培养基B分开使用，所述氨基酸为谷氨酸；

所述发酵培养基B是在发酵培养基A的基础上添加肌醇和甘油；

所述发酵培养基A为：葡萄糖50g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L，KCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，V_B110mg/L，黄腐酸1mg/L，生物素7μg/L，菌体酶解液60ml/L，在115℃下灭菌15min；

所述发酵培养基B为：葡萄糖50g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L，KCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，V_B110mg/L，黄腐酸1mg/L，生物素7μg/L，菌体酶解液60ml/L，肌醇100mg/L，甘油500mg/L，在115℃下灭菌15min；

所述菌体酶解液的制备方法为：取谷氨酸发酵液中的菌体，干燥至水分含量小于5wt％的干菌体，用水稀释至干菌体浓度为40g/L，置于高速剪切机中以10000rpm的速度剪切120s，得到菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的浓度为0.8mol/L的盐酸溶液，混匀，在95℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶进行水解，然后陶瓷膜过滤，收集滤液，即为菌体酶解液；陶瓷膜的截留分子量为10000Da；过滤去除难以被菌株利用的大分子物质，包括细胞壁组分、大分子蛋白等。

所述的胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为6h；所述的胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，添加量为：酶与底物干质量比为4%。

实施例2

一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法，其包括如下步骤：

将黄色短杆菌GDK-9（来源于天津科技大学，菌株出处参见“L-谷氨酸发酵的变温控制工艺研究，天津化工2010年”）按12％接种量将种子液（OD_600nm为10）接入装有30L发酵培养基A的50L全自动发酵罐中进行发酵培养，发酵温度38℃，通风比1∶0.7，搅拌转速500r/min，溶氧维持在20％，将发酵罐与陶瓷膜偶联，发酵至24h时，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜（截留分子量为20000Da）分离，将滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加发酵罐培养基B，使与未经陶瓷膜分离之前的发酵液体积相同，继续发酵16h，完成发酵；整个发酵过程中，通过流加泡敌消泡，同时流加25％的氨水控制发酵液的pH值至7.0-7.2。

实施例3

水解工艺对菌体蛋白酶解组分的影响：

设置对照组，

对照组1：不采用高速剪切机处理，其余同实施例1；

对照组2：采用浓度为5mol/L的盐酸进行水解6h的方式。

破壁率、蛋白质含量以及总游离氨基酸含量见表1：

表1

组别	实施例1	对照组1	对照组2
				破壁率%	97.2	83.4	68.7
蛋白质含量mg/g（干菌体）	226.1	285.9	268.5
				总游离氨基酸含量mg/g（干菌体）	371.5	256.3	187.4

通过表1可见，利用高速剪切机剪切处理120s，能够大幅提高菌体破壁率，从而提高水解效率；本发明采用稀盐酸进行预处理，酸浓度较小，则酸对氨基酸破坏程度很小，继而采用温和的酶解方式，从而能保留水解产物的营养价值；由于对照组破壁率降低，导致水解效率变低，大分子蛋白质以及细胞壁组分过滤去除，导致总游离氨基酸含量和小分子蛋白含量均下降明显，营养价值降低。

本发明还检测了总游离氨基酸中各主要氨基酸的成分，具体如下表2所示：

表2

主要氨基酸名称	氨基酸成分（%）
		天冬氨酸	7.76
苏氨酸	4.77
		丝氨酸	5.42
谷氨酸	13.13
		甘氨酸	9.85
丙氨酸	3.84
		胱氨酸	4.62
缬氨酸	3.13
		蛋氨酸	4.64
异亮氨酸	5.22
		亮氨酸	7.98
酪氨酸	4.65
		组氨酸	3.61
赖氨酸	5.86
		精氨酸	6.91

实施例4

发酵培养基中各组分对发酵液中菌体浓度和谷氨酸产量的影响。

设置对照组，对照组1：采用10g/L玉米浆替代菌体蛋白液，其余同实施例1；对照组2：发酵培养基A和B中不添加黄腐酸，其余同实施例1；对照组3：发酵培养基B中不添加肌醇和甘油，其余同实施例1。每个组别的发酵罐的发酵工艺均参照实施例2，发酵罐外的环境完全相同，具备可比性；检测发酵24h时的发酵液中菌体浓度和谷氨酸浓度、发酵完成时（40h）发酵液中菌体浓度和谷氨酸浓度；具体见表3：

表3

组别	24h菌体OD<sub>600nm</sub>	24h谷氨酸产量g/L	40h菌体OD<sub>600nm</sub>	40h谷氨酸产量g/L
					实施例1	50.3	103.7	86.4	89.5
对照组1	46.2	89.0	77.5	80.8
					对照组2	50.1	95.2	85.6	83.4
对照组3	50.4	104.1	84.7	78.3

结论：通过对照组比较试验发现，与常规的玉米浆氮源进行比较，菌体酶解液营养组分更佳全面，游离氨基酸含量高，更容易被菌株吸收利用，不管在菌体浓度，还是谷氨酸含量，本发明均有所提高；在菌体的发酵体系完全建立后，加入适量的肌醇，既可以强化CO₂固定反应，削弱乙醛酸循环，保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给α-酮戊二酸，通过还原氨基化反应，大量积累谷氨酸，提高发酵转化率；甘油提供碳骨架，促进谷氨酸的合成，并且能够提高细胞膜通透性，促进谷氨酸分泌到发酵液中；通过数据可见，肌醇和甘油对菌体的生长营养并不大；黄腐酸中能够促进谷氨酸合成过程中利用O₂作为氢受体，进而减少丙酮酸作为氢受体，因此副产物乳酸和丙氨酸的生成量减少，进而提高谷氨酸的产量。综上所述，本发明通过对培养基的优化，提高了氨基酸的发酵效率。

实施例5

普通发酵和分批发酵对比。

普通发酵方式：采用发酵培养基A进行发酵，发酵时间为34h，超过34h后，发酵环境变差，菌体出现大量死亡，产酸率下降。检测指标分别包括产酸量、透光率以及杂酸量等，结果见表4：

表4

发酵方式	普通发酵（34h）	分批发酵（24h）	分批发酵（40h）
				透光率（T<sub>430</sub>）	3.59	9.71	15.76
乳酸g/L	3.06	1.98	1.29
				丙氨酸g/L	2.59	1.45	1.16
谷氨酸g/L	168.3	103.7	89.5

可见，本发明膜偶联透析发酵工艺在L-谷氨酸发酵生产中有着十分有效的应用；该发酵工艺能够解除产物反馈调节、改善发酵液质量以及提高经济效益，有利于后续分离工艺中谷氨酸提取率的提升。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种提高谷氨酸产酸率及提取率的方法，其包括如下步骤：

将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液接入装有发酵培养基A的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度35-39℃，通风比1∶（0.5-2），搅拌转速300-500r/min，溶氧维持在15-25％，将发酵罐与陶瓷膜偶联，发酵至24h时，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，将滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加发酵培养基B，继续发酵16h，完成发酵；整个发酵过程中，通过流加泡敌消泡，同时流加25％的氨水控制发酵液的pH值至7.0-7.2；

所述发酵培养基A为：葡萄糖50g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L，KCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，V_B110mg/L，黄腐酸1mg/L，生物素7μg/L，菌体酶解液60ml/L，在115℃下灭菌15min；

所述发酵培养基B为：葡萄糖50g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L，KCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 3mg/L，FeSO₄·7H₂O 3mg/L，V_B110mg/L，黄腐酸1mg/L，生物素7μg/L，菌体酶解液60ml/L，肌醇100mg/L，甘油500mg/L，在115℃下灭菌15min；

所述菌体酶解液的制备方法为：取谷氨酸发酵液中的菌体，干燥至水分含量小于5wt％的干菌体，用水稀释至干菌体浓度为40g/L，置于高速剪切机中以10000rpm的速度剪切120s，得到菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的浓度为0.8mol/L的盐酸溶液，混匀，在95℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶进行水解，然后陶瓷膜过滤，收集滤液，即得菌体酶解液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液按10-15％接种量接入装有发酵培养基A的全自动发酵罐中进行发酵培养，发酵温度38℃，通风比1∶0.7，搅拌转速500r/min，溶氧维持在20％，将发酵罐与陶瓷膜偶联，发酵至24h时，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，将滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加发酵罐培养基B，继续发酵16h，完成发酵；整个发酵过程中，通过流加泡敌消泡，同时流加25％的氨水控制发酵液的pH值至7.0-7.2；

步骤2）分离提取谷氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述陶瓷膜的截留分子量为5000-20000Da。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为6h。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，胰蛋白酶与底物的质量比为4%。