CN110904168B - 一种提高谷氨酸发酵转化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸生产技术领域,公开了一种提高谷氨酸发酵转化率的方法,其包括如下步骤:1)将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液接入发酵培养基A中进行发酵培养,发酵培养18‑24h;2)然后添加发酵培养基B,继续发酵培养24h以上,收集发酵液;控制总发酵时间为48‑50h;3)发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为15‑25g/L的K2HPO4水溶液,在发酵结束前停止流加。本发明通过对培养基和工艺进行优化,提高了转化率。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域,具体涉及一种提高谷氨酸发酵转化率的方法。
背景技术
谷氨酸发酵生产是谷氨酸产生菌在其生命活动过程中分解代谢营养物质、合成所需产物、谷氨酸的生化过程。目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。在发酵生产过程中,影响谷氨酸产生菌生长、繁殖、代谢及合成产物的因素很多,通过人工干预有目的地控制这些因素,使其最终满足谷氨酸菌种的代谢合成需要,可以达到增加产物"降低消耗的目的。谷氨酸产生菌既是反应过程的主体,也是反应过程的生物催化剂,它摄取原料的营养,通过细胞内特定的酶系列进行复杂的生化反应。其底物中的反应物透过细胞壁和细胞膜进入细胞体内,在酶的作用下进行催化反应,将反应物转化为产物并释放出来,细胞的内在特性及其代谢规律是影响生化反应的关键因素。因此,发酵是一个比其他工业过程更为复杂的动态过程。
谷氨酸的生物合成途径大致是:葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸,再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA),然后进入三羧酸循环,生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下,生成谷氨酸。当生物素缺乏时,菌种生长十分缓慢;当生物素过量时,则转为乳酸发酵。因此,一般将生物素控制在亚适量条件下,才能得到高产量的谷氨酸。
在谷氨酸发酵中,如果能够改变细胞膜的通透性,使谷氨酸不断地排到细胞外面,就会大量生成谷氨酸。研究表明,影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此,对谷氨酸产生菌的选育,往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手,如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素,从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此,磷脂的合成量也相应减少,这就会导致细胞膜结构不完整,提高细胞膜对谷氨酸的通透性。谷氨酸发酵的好坏,有两个相联系的技术指标可以考核和衡量一个指标是发酵产酸率,另一个指标是发酵的糖酸转化率。若要两个指标同时达到高水平,目前还有不少工厂是很难做到的。糖酸转化率即糖发酵成酸后与未发酵的糖的比值,是衡量酸发酵成绩好坏的主要指标。
谷氨酸发酵过程是一个复杂的生物化学过程,生物化学的过程变化,其实就是发酵糖酸转化率变化的过程。影响发酵结果的因素很多,提高发酵转化率指标的方法也很多。在发酵过程中,氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下:①氧。谷氨酸产生菌是好氧菌,通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率,而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。②温度。当菌体生长到稳定期,适当提高温度有利于产酸。③pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在6.0~8.0。但在发酵过程中,随着营养物质的利用,代谢产物的积累,培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用,放出氨,pH会上升;当糖被利用生成有机酸时,pH会下降。④磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的,但浓度不能过高,否则会转向缬氨酸发酵。
申请人之前的专利技术“CN2019109133482,氨基酸的高效绿色制造工艺”,该工艺使得谷氨酸的发酵转化率大幅提高,利用了优化发酵培养基,包括分开使用的发酵培养基A和发酵培养基B;所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl3 10mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB1 10mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A;所述发酵培养基B的制备方法为:取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B。上述工艺属于实验室阶段的小规模试验,需要对其进一步优化,以验证在中试试验中的发酵情况。
发明内容
为了进一步提高谷氨酸的糖酸转化率,本发明提供了一种提高谷氨酸发酵转化率的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种提高谷氨酸发酵转化率的方法,其包括如下步骤:
1)将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液接入发酵培养基A中进行发酵培养,发酵培养18-24h;
2)然后添加发酵培养基B,继续发酵培养24h以上,收集发酵液;控制总发酵时间为48-50h;
3)发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为15-25g/L的K2HPO4水溶液,在发酵结束前的2h之内停止流加;
整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.8-0.9,搅拌转速300r/min,通过流加葡萄糖溶液维持残糖不低于1.0%,通过流加氨水控制pH为6.5-7.0,流加消泡剂消泡。
优选地,所述葡萄糖溶液的质量分数为60-65%。
优选地,所述K2HPO4水溶液的浓度为15-25g/L。
优选地,所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl3 10mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB1 10mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A。优选地,所述发酵培养基B的制备方法为:取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B。
进一步地,所述方法包括如下步骤:
将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液按8-10%接种量接入装有500L发酵培养基A的1000L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养18h,然后添加100L发酵培养基B,继续发酵培养30h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.9,搅拌转速300r/min,通过流加65%的葡萄糖溶液维持残糖不低于1.0%,通过流加氨水控制pH为6.5,流加消泡剂消泡;
发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为20g/L的K2HPO4水溶液,发酵结束之前2h,停止流加K2HPO4水溶液。
与现有技术相比,本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面:
本发明在发酵制备谷氨酸过程中,其发酵培养基采用两部分组成,先后使用,发酵培养基A侧重于菌株增殖的提升,发酵培养基B侧重于谷氨酸的合成和分泌;前期细胞增殖时,2-羟基乙胺可以促进磷脂酰乙醇胺细胞壁组分的合成,从而提高菌株增殖速率,后期菌株增殖放缓,以产酸为主,2-羟基乙胺还能够作为阳离子表面活性剂,使得细胞壁疏松,提高细胞通透性,促进谷氨酸释放到胞外,从而提高了转化率;
CeCl3稀土盐能够促进菌株增殖,提高谷氨酸相关合成酶的活力,提高谷氨酸的产量;但是过高的浓度会造成菌株增殖放缓和死亡,谷氨酸产量相应下降;
发酵中后期,菌株增殖速度放缓,以产酸为主,壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合,并螯合金属阳离子,从而改变细胞壁的通透性,促进谷氨酸分泌到胞外,从而提高了转化率;
发酵培养基中添加了琥珀酸,三羧酸循环有一定促进作用,而对乙醛酸循环途径具有抑制作用,从而导致中间代谢物更多地流向三羧酸循环途径,从而提高了谷氨酸的发酵转化效率;
本发明在发酵过程流加浓度高的60-65%含量的葡萄糖和一定浓度的磷酸盐溶液,减少发酵体积,保证了发酵溶氧,达到提高转化率效果。
附图说明
图1:发酵培养基B组分对糖酸转化率的影响;
图2:发酵培养基B组分对谷氨酸产量的影响;
图3:K2HPO4的浓度对糖酸转化率的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合本申请具体实施例,对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种提高谷氨酸发酵转化率的方法,其包括如下步骤:
将黄色短杆菌GDK-9种子液(OD600nm为12)按8%接种量接入装有500L发酵培养基A的1000L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养18h,然后添加100L发酵培养基B,继续发酵培养30h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.9,搅拌转速300r/min,通过流加质量百分比浓度为65%的葡萄糖维持残糖不低于1.0%,通过流加氨水控制pH为6.5,流加消泡剂消泡;发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为20g/L的K2HPO4,发酵结束之前2h,停止流加K2HPO4。
所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO42g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl3 10mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB1 10mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A;
所述发酵培养基B的制备方法为:取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B。
实施例2
一种提高谷氨酸发酵转化率的方法,其包括如下步骤:
将黄色短杆菌GDK-9种子液(OD600nm为12)按8%接种量接入装有500L发酵培养基A的1000L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养24h,然后添加100L发酵培养基B,继续发酵培养24h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.8,搅拌转速300r/min,通过流加质量百分比浓度为60%的葡萄糖维持残糖不低于1.0%,通过流加氨水控制pH为6.7,流加消泡剂消泡;发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为15g/L的K2HPO4,直至发酵结束。所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO42g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl3 10mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB1 10mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A;
所述发酵培养基B的制备方法为:取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B。
对比例1
将黄色短杆菌GDK-9种子液(OD600nm为12)按8%接种量接入装有600L发酵培养基A的1000L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养48h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.9,搅拌转速300r/min,通过流加质量百分比浓度为65%的葡萄糖维持残糖不低于1.0%,通过流加氨水控制pH为6.5,流加消泡剂消泡;
发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为20g/L的K2HPO4,发酵结束之前2h,停止流加K2HPO4。
所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO42g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB1 10mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A。
实施例3
1、以对比例1为基础进行研究CeCl3稀土盐对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。
设置CeCl3的添加浓度为0,2.5,5,10,20,40mg/L,随着CeCl3添加量的增加,菌体浓度和谷氨酸含量均有所提升,当添加量为10mg/L时,菌体浓度和谷氨酸含量达到峰值,继续增大浓度,菌体浓度和谷氨酸呈现出下降趋势,但是整个过程中,糖酸转化率没有明显改变;说明低浓度的CeCl3稀土盐能够促进菌株增殖,提高谷氨酸相关合成酶的活力,从而提高谷氨酸的产量,但是过高的浓度会造成菌株增殖放缓和死亡,谷氨酸产量相应下降。
2、设定CeCl3添加量为10mg/L,在此基础上,研究2-羟基乙胺对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。设置2-羟基乙胺的浓度为2.5,5,10,20,40,80,160mg/L,随着2-羟基乙胺添加量的增加,菌体浓度随之增加,相应地,谷氨酸含量和糖酸转化率也有所提升,当添加量为40mg/L时,菌体浓度和谷氨酸含量达到峰值,继续增加2-羟基乙胺的浓度,产生明显的抑菌效果,菌株密度下降明显;原因是,2-羟基乙胺可能促进磷脂酰乙醇胺细胞壁组分的合成,从而提高菌株增殖速率,但是浓度过大会导致抑菌现象,后期菌株增殖放缓,以产酸为主,2-羟基乙胺还能够作为阳离子表面活性剂,使得细胞壁疏松,提高细胞通透性,促进谷氨酸释放到发酵液,从而提高了谷氨酸产量和糖酸转化率。
3、通过上述实验确定发酵培养基A中CeCl3添加量为10mg/L、2-羟基乙胺的添加量40mg/L,在此基础上,研究发酵培养基B对谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。
对照组1:参照对比例1,即采用发酵培养基A进行发酵,不采用发酵培养基B。
对照组2:发酵培养基B中不添加琥珀酸,其余同实施例1。
对照组3:发酵培养基B中不添加壳聚糖,其余同实施例1。
对照组4:发酵培养基A中添加5g/L的琥珀酸,其余同对照组1。
如图1-2所示,对照组1采用单一发酵培养基A进行发酵,谷氨酸产量和糖酸转化率明显低于实验组;对照组4在对照组1的基础上添加了琥珀酸,谷氨酸产量和糖酸转化率也没有明显差异,可能原因是,发酵前期以菌体增殖为主,产酸较少,琥珀酸对菌体增殖并没有明显的刺激作用,从而不会明显影响谷氨酸的产量;实验组和对照组3选用发酵中期添加琥珀酸,此时,菌体增殖放缓,以产酸为主,琥珀酸对三羧酸循环有正向促进作用,而对乙醛酸循环途径起抑制作用,从而导致谷氨酸产量的增加;梯度试验发现,琥珀酸添加量过大(大于10g/L),并不会对谷氨酸产量带来更大的提升,综合成本考虑,选择低于10g/L的添加量较为合适。对照组2和实验组在发酵中后期添加壳聚糖,能够改变细胞壁的通透性,促进谷氨酸分泌到胞外,从而提升谷氨酸产量和糖酸转化率;但是壳聚糖添加量(超过100mg/L)过大会导致抑菌现象发生,进而造成菌株死亡,造成谷氨酸产量下降。
4、考虑到流加液对发酵体积不能产生过大的影响,会造成氨基酸含量降低,选择K2HPO4的流加速度为5ml/L为宜,同时检测K2HPO4的浓度对糖酸转化率的影响。设置浓度分别为0,2.5,5,10,20,40,80/L;如图3所示,K2HPO4的浓度较低时,K2HPO4的浓度和糖酸转化率呈明显的正相关,但是,当K2HPO4的浓度增大到40g/L时,糖酸转化率反而有所下降,主要原因是磷酸盐是谷氨酸发酵过程中合成谷氨酸必需的,但浓度不能过高,否则会导致碳代谢流转向缬氨酸发酵,从而降低糖酸转化率。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,或在实施案例之外的树种实施本方法,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改,改进或范围的扩大,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种提高谷氨酸发酵转化率的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
1)将产谷氨酸的黄色短杆菌的种子液接入发酵培养基A中进行发酵培养,发酵培养18-24h;
2)然后添加发酵培养基B,继续发酵培养24h以上,收集发酵液;控制总发酵时间为48-50h;
3)发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为15-25g/L的K2HPO4水溶液,在发酵结束前的2h之内停止流加;
整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.8-0.9,搅拌转速300r/min,通过流加葡萄糖溶液维持残糖不低于1.0%,通过流加氨水控制pH为6.5-7.0,流加消泡剂消泡;
所述葡萄糖溶液的质量分数为60-65%;
所述K2HPO4水溶液的浓度为15-25g/L;
所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl310mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O3mg/L,VB110mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A;
所述发酵培养基B的制备方法为:取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
将产谷氨酸的黄色短杆菌种子液按8-10%接种量接入装有500L发酵培养基A的1000L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养18h,然后添加100L发酵培养基B,继续发酵培养30h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.9,搅拌转速300r/min,通过流加65%的葡萄糖溶液维持残糖不低于1.0%,通过流加氨水控制pH为6.5,流加消泡剂消泡;
发酵至30h时,以5ml/min的流速流加浓度为20g/L的K2HPO4水溶液,发酵结束之前2h,停止流加K2HPO4水溶液。
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