CN114058654B - 一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法 - Google Patents

一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种用于提高γ‑氨基丁酸产量的发酵方法。本发明所述用于提高γ‑氨基丁酸产量的发酵方法，包括如下步骤：（1）菌种斜面活化；（2）种子培养；（3）发酵培养；（3）发酵培养中，在DO‑stat结合pH‑stat方式流加葡萄糖溶液的基础上，采用变pH控制方式发酵和在发酵过程中加入混合促进剂，可显著提高收集的发酵液中γ‑氨基丁酸浓度和发酵培养的糖酸转化率。

Description

一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法。
背景技术
γ-氨基丁酸，简称GABA，是一种天然的生物活性成分，广泛的存在于动植物体内以及微生物当中，具有十分重要的生理功能。在动植物体和微生物中，γ-氨基丁酸是一种重要的中间体，在生物体对环境压力的响应方面具有重要作用。具体来说，γ-氨基丁酸在植物耐旱、抗虫、自我防御以及信号转导等方面具有重要作用；在微生物中，因为生成γ-氨基丁酸的过程中会使胞内pH升高，所以γ-氨基丁酸对于微生物抵抗酸性环境具有重要功能；在哺乳动物中，γ-氨基丁酸是神经系统中的一种重要的抑制性神经递质，在大脑发育、抗焦虑、降血压以及止痛等方面具有十分重要的作用。同时，γ-氨基丁酸还是食品当中重要的生物活性成分添加剂。综上所述，γ-氨基丁酸在医药和保健食品等领域具有非常广泛的应用。
γ-氨基丁酸的生产方法包括化学合成法、天然产物提纯法和生物发酵法，由于化学合成法的反应条件苛刻、能耗大、成本高，而天然产物提纯法从植物富集得到的γ-氨基丁酸的量相对较低等原因，只有生物发酵法在生产γ-氨基丁酸方面具有良好的开发前景。目前工业生产中，主要采用微生物全细胞转化法和添加前体物质（谷氨酸钠）发酵法这两种生物发酵法来生产γ-氨基丁酸，上述两种生物发酵法在生产γ-氨基丁酸时除了添加微生物生长所需的成分以外，还需要以谷氨酸钠为底物，生产成本过高。因此，以成本低廉的葡萄糖为底物生物发酵法生产γ-氨基丁酸，将大大降低γ-氨基丁酸生产成本。但是，目前以葡萄糖为底物生物发酵法生产γ-氨基丁酸得到的发酵物中γ-氨基丁酸浓度较低、糖酸转化率也不高。
发明内容
本发明为了弥补现有技术中以葡萄糖为底物生物发酵法生产γ-氨基丁酸得到的发酵物中γ-氨基丁酸浓度较低、糖酸转化率不高的问题，提供了一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，包括如下步骤：
（1）菌种斜面活化：将希氏乳杆菌斜面活化，用无菌水洗涤希氏乳杆菌活化斜面，得到活化菌种液；
（2）种子培养：取10-15%种子培养基体积的活化菌种液接种至装有种子培养基的5L自控发酵罐中，控制5L自控发酵罐内的培养温度为30-34℃、pH为6.0-7.0，通过调节通气量0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持5L自控发酵罐内溶氧在15-35%，培养12 h得到种子液；
（3）发酵培养：取10-15%发酵培养基体积的种子液接种至装有发酵培养基的10L自控发酵罐中，控制10L自控发酵罐内的培养温度为30-34℃、pH初始为7.0，通过调节通气量0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持10L自控发酵罐内溶氧在15-35%，并采用变pH控制方式发酵49-55h；发酵过程中，向10L自控发酵罐中加入混合促进剂，并在10L自控发酵罐内容物的初始葡萄糖消耗殆尽后，采用DO-stat结合pH-stat方式向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液并维持10L自控发酵罐内容物的葡萄糖浓度0.5-3%；所述变pH控制方式发酵的具体过程为：发酵0-30h控制10L自控发酵罐内容物的pH为7.0，发酵30-45h控制10L自控发酵罐内容物的pH为6.5，发酵45 h时停止流加葡萄糖溶液，继续发酵2-4 h至10L自控发酵罐内容物中的葡萄糖消耗完后，调节并维持10L自控发酵罐内容物的pH为4.0-5.0，再继续发酵2-6 h至10L自控发酵罐内容物的谷氨酸残留量低于2g/L时，停止发酵，收集发酵液。
进一步的，所述步骤（1）中，希氏乳杆菌为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心、编号为：CICC24171的希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii。
进一步的，所述步骤（2）中，种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20-30 g/L、硫酸铵3-10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉15 g/L、KH2PO4 3-6 g/L、MgSO4 1-2 g/L、MnSO40.01-0.1 g/L、FeSO4 0.01-0.1 g/L、5-磷酸吡哆醛0.05-1 mmol/L。
进一步的，所述步骤（3）中，发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20-60 g/L、硫酸铵1-20 g/L、蛋白胨1-5 g/L、酵母浸粉2-10 g/L、KH2PO4 1-9 g/L、MgSO4 1-5 g/L、豆粕水解液5-20 g/L、玉米浆5-20 g/L、生物素50-100 μg/L、MnSO4 0.01-0.1 g/L、FeSO40.01-0.1 g/L、5-磷酸吡哆醛0.05-1 mmol/L。
进一步的，所述步骤（3）中，混合促进剂包括以下浓度的组分：5-磷酸吡哆醛浓度为0.05-10 mol/L、L-谷氨酸钠浓度为50-100 g/L、维生素B1浓度为0.2-2 mg/L，氨水调节所述混合促进剂的pH为7.0。
进一步的，所述步骤（3）中，在发酵24h、32h、40h时分别向10L自控发酵罐中流加100mL混合促进剂。
进一步的，所述步骤（3）中，采用DO-stat结合pH-stat方式向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液并维持10L自控发酵罐内容物的葡萄糖浓度0.5-1%。
进一步的，所述步骤（3）中，发酵45h时停止流加葡萄糖溶液，继续发酵2-4h至10L自控发酵罐内容物中的葡萄糖消耗完后，向10L自控发酵罐中流加30%硫酸，调节并维持10L自控发酵罐内容物的pH为4.5-5.0。
进一步的，所述步骤（3）中，DO-stat结合pH-stat方式是指将补料控制开关与10L自控发酵罐的溶氧及pH信号关联，当溶氧信号高于设定值10%或pH信号高于设定值0.1时，启动补料控制开关向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明根据希氏乳杆菌合成代谢γ-氨基丁酸的特点，在发酵培养过程中加入对希氏乳杆菌有生长调节作用的混合促进剂，从而有效提高了希氏乳杆菌发酵浓度；混合促进剂中廉价的前体物质L-谷氨酸钠，还能进一步提高收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度。发酵培养过程中，采用变pH 控制方式发酵，提高了希氏乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径中相关酶系的稳定性，延长了γ-氨基丁酸的有效发酵时间；同时采用DO-stat结合pH-stat方式流加补充葡萄糖，有效缓解了葡萄糖的分解代谢物阻遏效应，有利于补充的葡萄糖更多的用于γ-氨基丁酸合成，提高了糖酸转化率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，以便于对本发明的理解，但并不是对本发明的限制。
实施例1：一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，包括如下步骤：
（1）菌种斜面活化：将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心、编号为：CICC24171的希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii斜面活化，用无菌水洗涤希氏乳杆菌活化斜面，得到活化菌种液。
（2）种子培养：取300mL活化菌种液接种至装有3L种子培养基的5L自控发酵罐中，控制5L自控发酵罐内的培养温度为30℃、pH为6.0-7.0，通过调节通气量0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持5L自控发酵罐内溶氧在15-35%，培养12 h得到种子液；所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖30 g/L、硫酸铵6 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉15 g/L、KH2PO46 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.01 g/L、FeSO4 0.01 g/L、5-磷酸吡哆醛0.05 mmol/L。
（3）发酵培养：取600mL种子液接种至装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐中，控制10L自控发酵罐内的培养温度为30℃、pH初始为7.0，通过调节通气量 0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持10L自控发酵罐内溶氧在15-35%，并采用变pH控制方式发酵49h；发酵过程中，在发酵24h、32h、40h时分别向10L自控发酵罐中流加100mL混合促进剂，并在10L自控发酵罐内容物的初始葡萄糖消耗殆尽后，采用DO-stat结合pH-stat方式向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液并维持10L自控发酵罐内容物的葡萄糖浓度0.5-3%；所述变pH控制方式发酵的具体过程为：发酵0-30h控制10L自控发酵罐内容物的pH为7.0，发酵30-45h控制10L自控发酵罐内容物的pH为6.5，发酵45 h时停止流加葡萄糖溶液，继续发酵2h至10L自控发酵罐内容物中的葡萄糖消耗完后，向10L自控发酵罐中流加30%硫酸，调节并维持10L自控发酵罐内容物的pH为4.5，再继续发酵2h至10L自控发酵罐内容物的谷氨酸残留量低于2g/L时，停止发酵，收集发酵液；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20 g/L、硫酸铵20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉2 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 3 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米浆5 g/L、生物素75 μg/L、MnSO4 0.1 g/L、FeSO4 0.1 g/L、5-磷酸吡哆醛1 mmol/L；所述混合促进剂包括以下浓度的组分：5-磷酸吡哆醛浓度为0.05 mol/L、L-谷氨酸钠浓度为50 g/L、维生素B1浓度为1 mg/L，氨水调节所述混合促进剂的pH为7.0；所述DO-stat结合pH-stat方式是指将补料控制开关与10L自控发酵罐的溶氧及pH信号关联，当溶氧信号高于设定值10%或pH信号高于设定值0.1时，启动补料控制开关向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液。
实施例1中，收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度为98.4g/L，发酵培养的糖酸转化率为48.7%。
实施例2：一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，包括如下步骤：
（1）菌种斜面活化：将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心、编号为：CICC24171的希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii斜面活化，用无菌水洗涤希氏乳杆菌活化斜面，得到活化菌种液。
（2）种子培养：取450mL活化菌种液接种至装有3L种子培养基的5L自控发酵罐中，控制5L自控发酵罐内的培养温度为34℃、pH为6.0-7.0，通过调节通气量0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持5L自控发酵罐内溶氧在15-35%，培养12 h得到种子液；所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖25 g/L、硫酸铵10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉15 g/L、KH2PO44.5 g/L、MgSO4 1.5 g/L、MnSO4 0.1 g/L、FeSO4 0.1 g/L、5-磷酸吡哆醛1 mmol/L。
（3）发酵培养：取900mL种子液接种至装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐中，控制10L自控发酵罐内的培养温度为34℃、pH初始为7.0，通过调节通气量 0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持10L自控发酵罐内溶氧在15-35%，并采用变pH控制方式发酵55h；发酵过程中，在发酵24h、32h、40h时分别向10L自控发酵罐中流加100mL混合促进剂，并在10L自控发酵罐内容物的初始葡萄糖消耗殆尽后，采用DO-stat结合pH-stat方式向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液并维持10L自控发酵罐内容物的葡萄糖浓度0.5-1%；所述变pH控制方式发酵的具体过程为：发酵0-30h控制10L自控发酵罐内容物的pH为7.0，发酵30-45h控制10L自控发酵罐内容物的pH为6.5，发酵45 h时停止流加葡萄糖溶液，继续发酵4h至10L自控发酵罐内容物中的葡萄糖消耗完后，向10L自控发酵罐中流加30%硫酸，调节并维持10L自控发酵罐内容物的pH为5.0，再继续发酵6h至10L自控发酵罐内容物的谷氨酸残留量低于2g/L时，停止发酵，收集发酵液；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖60 g/L、硫酸铵1 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸粉10 g/L、KH2PO4 9 g/L、MgSO4 5 g/L、豆粕水解液12 g/L、玉米浆20 g/L、生物素100 μg/L、MnSO4 0.05 g/L、FeSO4 0.05 g/L、5-磷酸吡哆醛0.05mmol/L；所述混合促进剂包括以下浓度的组分：5-磷酸吡哆醛浓度为10 mol/L、L-谷氨酸钠浓度为75 g/L、维生素B1浓度为2 mg/L，氨水调节所述混合促进剂的pH为7.0；所述DO-stat结合pH-stat方式是指将补料控制开关与10L自控发酵罐的溶氧及pH信号关联，当溶氧信号高于设定值10%或pH信号高于设定值0.1时，启动补料控制开关向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液。
实施例2中，收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度为101.7g/L，发酵培养的糖酸转化率为49.1%。
实施例3：一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，包括如下步骤：
（1）菌种斜面活化：将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心、编号为：CICC24171的希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii斜面活化，用无菌水洗涤希氏乳杆菌活化斜面，得到活化菌种液。
（2）种子培养：取360mL活化菌种液接种至装有3L种子培养基的5L自控发酵罐中，控制5L自控发酵罐内的培养温度为32℃、pH为6.0-7.0，通过调节通气量0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持5L自控发酵罐内溶氧在15-35%，培养12 h得到种子液；所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20 g/L、硫酸铵3 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉15 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4 2 g/L、MnSO4 0.02 g/L、FeSO4 0.02 g/L、5-磷酸吡哆醛0.1 mmol/L。
（3）发酵培养：取720mL种子液接种至装有6L发酵培养基的10L自控发酵罐中，控制10L自控发酵罐内的培养温度为32℃、pH初始为7.0，通过调节通气量 0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持10L自控发酵罐内溶氧在15-35%，并采用变pH控制方式发酵52h；发酵过程中，在发酵24h、32h、40h时分别向10L自控发酵罐中流加100mL混合促进剂，并在10L自控发酵罐内容物的初始葡萄糖消耗殆尽后，采用DO-stat结合pH-stat方式向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液并维持10L自控发酵罐内容物的葡萄糖浓度0.5-1%；所述变pH控制方式发酵的具体过程为：发酵0-30h控制10L自控发酵罐内容物的pH为7.0，发酵30-45h控制10L自控发酵罐内容物的pH为6.5，发酵45 h时停止流加葡萄糖溶液，继续发酵3h至10L自控发酵罐内容物中的葡萄糖消耗完后，向10L自控发酵罐中流加30%硫酸，调节并维持10L自控发酵罐内容物的pH为4.5，再继续发酵4h至10L自控发酵罐内容物的谷氨酸残留量低于2g/L时，停止发酵，收集发酵液；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖30 g/L、硫酸铵10 g/L、蛋白胨1 g/L、酵母浸粉5 g/L、KH2PO4 5 g/L、MgSO4 1 g/L、豆粕水解液5 g/L、玉米浆10 g/L、生物素50 μg/L、MnSO4 0.01 g/L、FeSO4 0.01 g/L、5-磷酸吡哆醛0.1 mmol/L；所述混合促进剂包括以下浓度的组分：5-磷酸吡哆醛浓度为0.1 mol/L、L-谷氨酸钠浓度为100 g/L、维生素B1浓度为0.2 mg/L，氨水调节所述混合促进剂的pH为7.0；所述DO-stat结合pH-stat方式是指将补料控制开关与10L自控发酵罐的溶氧及pH信号关联，当溶氧信号高于设定值10%或pH信号高于设定值0.1时，启动补料控制开关向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液。
实施例3中，收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度为103.5g/L，发酵培养的糖酸转化率为49.6%。
为体现本发明所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法的技术优势，将下述对比例1-3与实施例3进行对比分析。
对比例1：一种生产γ-氨基丁酸的发酵方法。对比例1所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法与实施例3所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法的区别在于：对比例1所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法未采用变pH控制方式发酵，也未在发酵过程中加入混合促进剂，其余同实施例3所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法。
对比例1中，收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度为68.7g/L，发酵培养的糖酸转化率为43.2%。由此可见，即便对比例1所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法同样采用了DO-stat结合pH-stat方式流加葡萄糖溶液，但对比例1中收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度和发酵培养的糖酸转化率仍显著低于实施例3中的相应数据。
对比例2：一种生产γ-氨基丁酸的发酵方法。对比例2所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法与实施例3所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法的区别在于：对比例2所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法未采用变pH控制方式发酵，其余同实施例3所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法。
对比例2中，收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度为87.3g/L，发酵培养的糖酸转化率为46.8%。由此可见，即便对比例2所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法同样采用了DO-stat结合pH-stat方式流加葡萄糖溶液，并在发酵过程中加入混合促进剂，但对比例2中收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度和发酵培养的糖酸转化率仍明显低于实施例3中的相应数据。
对比例3：一种生产γ-氨基丁酸的发酵方法。对比例3所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法与实施例3所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法的区别在于：对比例3所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法未在发酵过程中加入混合促进剂，其余同实施例3所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法。
对比例3中，收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度为83.7g/L，发酵培养的糖酸转化率为47.5%。由此可见，即便对比例3所述生产γ-氨基丁酸的发酵方法同样采用了DO-stat结合pH-stat方式流加葡萄糖溶液，并采用变pH控制方式发酵，但对比例3中收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度和发酵培养的糖酸转化率仍明显低于实施例3中的相应数据。
对比例1-3与实施例3对比结果说明：本发明所述用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，在DO-stat结合pH-stat方式流加葡萄糖溶液的基础上，采用变pH控制方式发酵和在发酵过程中加入混合促进剂，可显著提高收集的发酵液中γ-氨基丁酸浓度和发酵培养的糖酸转化率。
在上述实施例中，对本发明的最佳实施方式做了描述，很显然，在本发明的发明构思下，仍可做出很多变化。在此，应该说明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征为，包括如下步骤：
（1）菌种斜面活化：将希氏乳杆菌斜面活化，用无菌水洗涤希氏乳杆菌活化斜面，得到活化菌种液；
（2）种子培养：取10-15%种子培养基体积的活化菌种液接种至装有种子培养基的5L自控发酵罐中，控制5L自控发酵罐内的培养温度为30-34℃、pH为6.0-7.0，通过调节通气量0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持5L自控发酵罐内溶氧在15-35%，培养12 h得到种子液；
（3）发酵培养：取10-15%发酵培养基体积的种子液接种至装有发酵培养基的10L自控发酵罐中，控制10L自控发酵罐内的培养温度为30-34℃、pH初始为7.0，通过调节通气量 0.2-3 vvm和转速200-900 r/min维持10L自控发酵罐内溶氧在15-35%，并采用变pH控制方式发酵49-55h；发酵过程中，向10L自控发酵罐中加入混合促进剂，并在10L自控发酵罐内容物的初始葡萄糖消耗殆尽后，采用DO-stat结合pH-stat方式向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液并维持10L自控发酵罐内容物的葡萄糖浓度0.5-3%；所述变pH控制方式发酵的具体过程为：发酵0-30h控制10L自控发酵罐内容物的pH为7.0，发酵30-45h控制10L自控发酵罐内容物的pH为6.5，发酵45 h时停止流加葡萄糖溶液，继续发酵2-4 h至10L自控发酵罐内容物中的葡萄糖消耗完后，调节并维持10L自控发酵罐内容物的pH为4.0-5.0，再继续发酵2-6 h至10L自控发酵罐内容物的谷氨酸残留量低于2g/L时，停止发酵，收集发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，希氏乳杆菌为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心、编号为：CICC24171的希氏乳杆菌（ Lactobacillus hilgardii） 。
3.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（2）中，种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20-30 g/L、硫酸铵3-10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉15 g/L、KH2PO4 3-6 g/L、MgSO4 1-2 g/L、MnSO4 0.01-0.1 g/L、FeSO40.01-0.1 g/L、5-磷酸吡哆醛0.05-1 mmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中，发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20-60 g/L、硫酸铵1-20 g/L、蛋白胨1-5 g/L、酵母浸粉2-10 g/L、KH2PO4 1-9 g/L、MgSO4 1-5 g/L、豆粕水解液5-20 g/L、玉米浆5-20 g/L、生物素50-100 μg/L、MnSO4 0.01-0.1 g/L、FeSO4 0.01-0.1 g/L、5-磷酸吡哆醛0.05-1 mmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中，混合促进剂包括以下浓度的组分：5-磷酸吡哆醛浓度为0.05-10 mol/L、L-谷氨酸钠浓度为50-100 g/L、维生素B1浓度为0.2-2 mg/L，氨水调节所述混合促进剂的pH为7.0。
6.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中，在发酵24h、32h、40h时分别向10L自控发酵罐中流加100mL混合促进剂。
7.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中，采用DO-stat结合pH-stat方式向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液并维持10L自控发酵罐内容物的葡萄糖浓度0.5-1%。
8.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中，发酵45h时停止流加葡萄糖溶液，继续发酵2-4h至10L自控发酵罐内容物中的葡萄糖消耗完后，向10L自控发酵罐中流加30%硫酸，调节并维持10L自控发酵罐内容物的pH为4.5-5.0。
9.根据权利要求1所述的一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中，DO-stat结合pH-stat方式是指将补料控制开关与10L自控发酵罐的溶氧及pH信号关联，当溶氧信号高于设定值10%或pH信号高于设定值0.1时，启动补料控制开关向10L自控发酵罐中流加500g/L葡萄糖溶液。
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