CN110541014A - 一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法 - Google Patents
一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110541014A CN110541014A CN201910946640.4A CN201910946640A CN110541014A CN 110541014 A CN110541014 A CN 110541014A CN 201910946640 A CN201910946640 A CN 201910946640A CN 110541014 A CN110541014 A CN 110541014A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- tryptophan
- culture
- concentration
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 152
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 150
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 title claims abstract description 91
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 26
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 23
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 15
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 4
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 19
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 18
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 6
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 53
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 9
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 8
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 208000012788 shakes Diseases 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法，在发酵罐培养过程中，通过流加磷酸氢二钾溶液或硫酸铵溶液或精氨酸水溶液补料生产色氨酸，培养至40h结束。本发明在不增加任何额外设备和人力投入的情况下，延长了发酵周期，降低了劳动强度,使色氨酸的产量得到显著提高。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法。
背景技术
色氨酸的分子式为C11H12O2N2，分子量为204.21，含氮13.72％。色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状白色晶体，无臭，有甜味。在水中溶解度1.14g/L(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于饲料行业中。
色氨酸的生产方法先后经历了蛋白质水解法、化学合成法和微生物法三种方法，其中微生物法又包括直接发酵法、微生物转化法和酶法。目前，色氨酸发酵企业大多采用分批补料发酵方式。这种方式对发酵液中残留葡萄糖浓度控制和补入糖(包括葡萄糖和液糖)的分散程度要求较高。残留葡萄糖浓度若要控制的不当，就会影响到菌体的正常代谢，使菌体的代谢途径发生变化，严重影响色氨酸的发酵水平和产量，甚至会导致无色氨酸产生。所以，培养基中营养物质对菌体的生长和代谢产物的产生起着决定作用。
申请人之前的专利技术“一种L-色氨酸的发酵工艺” 针对发酵工序的进行改进，避免L-色氨酸浓度积累到引起反馈抑制，针对发酵后的废弃菌体进行二次产酸处理，增加了细胞膜的通透性，提高了菌株的产酸能力，发酵周期大大延长。专利技术“一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸绿色生产方法” 以L-色氨酸发酵菌体蛋白为原料，经胰蛋白酶水解后代替酵母粉作为L-色氨酸作为有机氮源制成发酵培养基，原料来自发酵后遗留菌体，成本低廉，与用做饲料相比，蛋白效价更高，效益更好，可以直接降低工业成本，提高产品效益。文献“L-色氨酸清液发酵工艺研究，食品与发酵科技2017年第2期” 以发酵中后期发酵液代谢流分布作为监测点，研究了清液发酵培养基对大肠杆菌 TRTH 发酵生产L-色氨酸的影响，较传统普通发酵培养基相比，在发酵中后期清液发酵培养基中，L-色氨酸合成的代谢流增加，主要副产物乙酸代谢流明显减少；但是该清洁发酵培养基使用了大量不同种类的氨基酸，成本较高，不宜大规模推广使用。
发明内容
在现有技术的基础上，本发明对发酵工艺进行了进一步改进，提供了一种流加培养基发酵生产色氨酸的方法，在提高色氨酸产量的同时，保证了流加效果。
本发明采用如下技术方案:
一种流加培养液发酵生产色氨酸的方法，其包括如下的步骤：
1）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0- 3.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束；
2）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以0.5-1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加硫酸铵溶液，直至发酵结束；
3）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0-2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加精氨酸水溶液，直至发酵结束；
4）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以2.0- 4.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。
优选地，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为5.0%（w/v）。
优选地，所述硫酸铵溶液的浓度为10.0%（w/v）。
优选地，所述精氨酸水溶液的浓度为5.0%（w/v）。
优选地，所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为10-20%（v/v），三氟乙酸的浓度为10-20%（v/v）。
优选地，所述发酵的总时间为40h。
优选地，所述发酵过程为：
将二级发酵罐种子以1%-10%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，转速300-500rpm，温度35- 37℃，罐压0.05-0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，流加浓度为400-500g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1-1.5g/L，溶氧量：在发酵前期控制在25-30%和发酵后期控制在15-20%，发酵周期为40h。
优选地，发酵前期为0-12h，发酵后期为13h-发酵结束。
优选地，
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1mg/L。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明发酵培养基中采用蛋白胨替代酵母膏作为迟效氮源，杂蛋白、色素等复杂不稳定物质降低，并且添加量较少，微生物生长通过迟效氮源，以及流加速效氮源来维持，发酵培养基相对较为清洁，菌体代谢所产生的能量循环与传递通畅，多数能量供应自身生长需求，较少生成乙酸；
控制葡萄糖的摄入速率对L-色氨酸发酵具有重要意义。发酵初期葡萄糖浓度过高，会造成乙酸产量增加，但是浓度过低不利于菌株增殖；发酵中后期保持较低葡萄糖的摄入速率有利于抑制乙酸等副产物的生成，过高葡萄糖的摄入速率使TCA循环代谢流增加，HMP途径流量不充足。本发明采用发酵前期相对较高葡萄糖浓度，发酵中后期葡萄糖浓度控制在较低水平，以达到控制乙酸生长，并且保持菌株增殖效率的目的。
本发明通过在发酵后期流加磷酸氢二钾以及硫酸铵，有效补充了氮源以及菌株生长所需要的营养物质，维持了菌株的生长活力，发酵产酸性能大幅提升；发酵中后期，代谢副产物增多，添加适量的精氨酸可提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力，降低代谢副产物的积累量，从而进一步提高L-色氨酸的产率。
丙二酸和三氟乙酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，增加非氧化磷酸戊糖循环的流量，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，进一步增加了L-色氨酸的产率；但是TCA循环也不易过度弱化，过度弱化会造成菌株生长受到明显抑制，从而造成L-色氨酸的产量下降。
本发明补入的糖能够快速均匀分布到发酵液中，有效的解决了糖局部浓度过高造成发酵液渗透压过和过多的副产物乙酸；同时也解决了发酵液中局部葡萄糖浓度过低而使底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产能力不能得到最大限度发挥的问题；
在溶氧回升前，通过调整搅拌转速或者空气流量，将溶氧维持在较高的水平，解氧回升后按固定时间间隔调整搅拌转速或者空气流量，同时增加补糖速率，在发酵前期 (0〜12h)和发酵后期（13h〜培养结束)将溶解氧控制在不同的水平，这一方面加快了菌种的生长速率，另一方面避免了工艺参数调整过快，糖补入量过多，造成发酵失控；
本发明与现有生产工艺相比不增加任何额外设备和人力投入的情况下，稳定了种子罐的生长周期，延长了发酵罐的发酵周期，降低了劳动强度和生产成本，整个工艺过程得到简化，十分适合于工业化生产。
附图说明
图1：磷酸氢二钾流加速率对L-色氨酸产量的影响；
图2：硫酸铵流加速率对L-色氨酸产量的影响；
图3：精氨酸添加量对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响；
图4：丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种流加培养液发酵生产色氨酸的方法，其包括如下步骤：
步骤1)：将L-色氨酸工程菌大肠杆菌(E. coli) TRTH，培养至一定浓度的菌液；
步骤2)：将步骤1)得到的菌液以0.5%的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于36℃中，以100-200rpm培养10-20h；
步骤3)：将步骤2)得到的一级摇瓶种子以5%的接种量接种于二级种子培养基的种子罐中，控制风量5-10L/min，转速200-400rpm，温度35-37℃，罐压0.05- 0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，培养10-20h；
步骤4)：将步骤3)得到的二级发酵罐种子（OD600值为11）以7%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，转速400rpm，温度36℃，罐压0.06MPa，pH 值通过氨水控制在6.6，流加浓度为400g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1g/L，溶氧量：在发酵前期 (0〜12h)控制在25%和发酵后期（13h〜培养结束)控制在20%，发酵周期40h。
所述一级培养基的组分为：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，盐酸四环素50mg/l，pH,值6.6。
所述二级种子培养基的组分为：磷酸氢二钾10g/l，酵母粉10g/l，
葡萄糖20 g/l，磷酸氢二钠2 g/l，胰蛋白胨4g/l，氯化镁1.0 g/l，柠檬酸三钠0.2 g/l，硫酸亚铁0.005 g/l，一水硫酸锰0.005 g/l，pH控制在6.6，在115℃下灭菌15min。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1 mg/L；pH控制在6.6，在115℃下灭菌15min。发酵过程中流加培养液的流程为：
1）在培养30h左右，于每升发酵液中以2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束。
2）在培养30h左右，于每升发酵液中以1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加10.0%（w/v）硫酸铵溶液，直至发酵结束。
3）在培养30h左右，于每升发酵液中以2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）精氨酸水溶液，直至发酵结束。
4）在培养30h左右，于每升发酵液中以4.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为15%（v/v），三氟乙酸的浓度为15%（v/v）。
实施例2
一种流加培养液发酵生产色氨酸的方法，其包括如下步骤：
步骤1)：将L-色氨酸工程菌大肠杆菌(E. coli) TRTH，培养至一定浓度的菌液；
步骤2)：将步骤1)得到的菌液以0.1%-1%的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于36℃中，以100-200rpm培养10-20h；
步骤3)：将步骤2)得到的一级摇瓶种子以1%-10%的接种量接种于二级种子培养基的种子罐中，控制风量5-10L/min，转速200-400rpm，温度35-37℃，罐压0.05-0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，培养10-20h；
步骤4)：将步骤3)得到的二级发酵罐种子（OD600值为12）以6%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，转速300rpm，温度35℃，罐压0.05MPa，pH 值通过氨水控制在6.5，流加浓度为500g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1.2g/L，溶氧量：在发酵前期 (0〜12h)控制在30%和发酵后期（13h〜培养结束)控制在20%，发酵周期40h。
所述一级培养基的组分为：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，盐酸四环素100mg/l， pH 值6.7。
所述二级种子培养基的组分为：磷酸氢二钾10g/l，酵母粉10g/l，
葡萄糖30g/l，磷酸氢二钠3g/l，胰蛋白胨3g/l，氯化镁0.1 g/l，柠檬酸三钠0.10g/l，七水硫酸亚铁0.001g/l，一水硫酸锰0.001g/l，pH控制在6.7，在115℃下灭菌15min。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1 mg/L；pH控制在6.7，在115℃下灭菌15min。发酵过程中流加培养液的流程为：
1）在培养30h左右，于每升发酵液中以1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束。
2）在培养30h左右，于每升发酵液中以1ml/h的流速往发酵罐中补料流加10.0%（w/v）硫酸铵溶液，直至发酵结束。
3）在培养30h左右，于每升发酵液中以1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加5.0%（w/v）精氨酸水溶液，直至发酵结束。此时色氨酸的产量为50g/l。
4）在培养30h左右，于每升发酵液中以3.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为15%（v/v），三氟乙酸的浓度为15%（v/v）。
实施例3
一、磷酸氢二钾添加量对L-色氨酸产量的影响。
发酵工艺同实施例1，不采用培养液的步骤。首先，通过实验验证流加磷酸氢二钾溶液对发酵的影响，如图1所述，随着磷酸氢二钾流加量的增大，发酵液中L-色氨酸的含量相应提高，流速为2ml/h时，基本达到峰值，继续增加流速，对色氨酸产量没有明显提高，磷酸氢二钾对菌体生物量的影响趋势和色氨酸类似（附图未显示），主要原因是，流加磷酸氢二钾溶液能够提高菌体生物量，从而提高色氨酸的产率。
二、硫酸铵添加量对L-色氨酸产量的影响。
选择磷酸氢二钾的流速为2ml/h，设置不同梯度的硫酸铵添加量，如图2所示，硫酸铵流速为1.5ml/h时，L-色氨酸的含量为43.9g/L，继续增大硫酸铵的流速，对色氨酸的影响并不大，说明1.5ml/h的流速已经满足了菌株正常产酸的需求。
三、精氨酸添加量对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。
选择磷酸氢二钾的流速为2ml/h，硫酸铵流速为1.5ml/h时，验证精氨酸对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。如图3所示，设置不同的梯度的流加量，随着精氨酸的流加速率的增加，L-色氨酸产量和菌体生物量持续增加，流速为2ml/h时，L-色氨酸产量和菌体生物量均达到峰值，较未添加精氨酸相比较，分别提高了5.01%和4.75%。
原因是，发酵中后期，代谢副产物增多，添加适量的精氨酸可提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力，降低代谢副产物的积累量，减少对菌株的损害，进一步提高L-色氨酸的产率。
四、丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液对L-色氨酸产量和菌体生物量的影响。
选择磷酸氢二钾的流速为2ml/h，硫酸铵流速为1.5ml/h，精氨酸流速为2ml/h时，设置不同流加速率的丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，通过梯度试验发现，随着流加量的增大，色氨酸产量稳步提升，但是菌体生物量有所下降，流速为4ml/h时，色氨酸含量达到峰值，继续增加流加速率，色氨酸含量有所降低，菌体生物量受到抑制，降幅明显。原因可能是，丙二酸和三氟乙酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，增加非氧化磷酸戊糖循环的流量，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，进一步增加了L-色氨酸的产率，提高了6.72%；但是TCA循环也不易过度弱化，过度弱化会造成菌株生长受到明显抑制，从而造成L-色氨酸的产量下降。仅采用单一的丙二酸或者三氟乙酸时，对色氨酸产率也有一定程度的提高，最高分别为3.3%和4.1%，效果远不如较二者协同使用，可能原因是，丙二酸和三氟乙酸采用不同的机制对三羧酸循环进行抑制，能够更加有效地干预色氨酸的合成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种流加培养液发酵生产色氨酸的方法，其包括如下的步骤：
1）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0- 3.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束；
2）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以0.5-1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加硫酸铵溶液，直至发酵结束；
3）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0-2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加精氨酸水溶液，直至发酵结束；和/或
4）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以2.0- 4.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为5.0%（w/v）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵溶液的浓度为10.0%（w/v）。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸水溶液的浓度为5.0%（w/v）。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为10-20%（v/v），三氟乙酸的浓度为10-20%（v/v）。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的总时间为40h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程为：
将二级发酵罐种子以1%-10%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养，转速300-500rpm，温度35-37℃，罐压0.05-0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，流加浓度为400-500g/L葡萄糖溶液控制残糖浓度为1-1.5g/L，溶氧量为：在发酵前期控制在25-30%和发酵后期控制在15-20%，发酵周期为40h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵前期为0-12h，发酵后期为13h-40h。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1mg/L。
10.按照权利要求1-9任其一的方法获得的色氨酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910946640.4A CN110541014A (zh) | 2019-10-06 | 2019-10-06 | 一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910946640.4A CN110541014A (zh) | 2019-10-06 | 2019-10-06 | 一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110541014A true CN110541014A (zh) | 2019-12-06 |
Family
ID=68715447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910946640.4A Pending CN110541014A (zh) | 2019-10-06 | 2019-10-06 | 一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110541014A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112430633A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-03-02 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺 |
| CN112813115A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-05-18 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种高纯度l-精氨酸的生产工艺 |
| CN114381477A (zh) * | 2020-10-19 | 2022-04-22 | 江苏元易邦生物科技有限公司 | 一种提高l-色氨酸发酵过程产率和糖酸转化率的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007001097A1 (en) * | 2005-06-29 | 2007-01-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-threonine |
| CN103443267A (zh) * | 2011-01-18 | 2013-12-11 | Cj第一制糖株式会社 | L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生l-氨基酸的方法 |
| CN103614428A (zh) * | 2013-06-26 | 2014-03-05 | 山东鲁抗医药股份有限公司 | 一种高效发酵生产l-色氨酸的方法 |
| CN108285914A (zh) * | 2017-12-03 | 2018-07-17 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种l-色氨酸的发酵工艺 |
| CN109517858A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-03-26 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种生产和提取l-色氨酸的方法 |
| US20200216867A1 (en) * | 2019-01-07 | 2020-07-09 | Evonik Operations Gmbh | Method for producing l-tryptophan using improved strains of the enterobacteriaceae family |
| CN113265432A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-08-17 | 内蒙古阜丰生物科技有限公司 | 一种发酵培养基及其在微生物发酵制备氨基酸中的应用 |
-
2019
- 2019-10-06 CN CN201910946640.4A patent/CN110541014A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007001097A1 (en) * | 2005-06-29 | 2007-01-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-threonine |
| CN103443267A (zh) * | 2011-01-18 | 2013-12-11 | Cj第一制糖株式会社 | L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生l-氨基酸的方法 |
| CN103614428A (zh) * | 2013-06-26 | 2014-03-05 | 山东鲁抗医药股份有限公司 | 一种高效发酵生产l-色氨酸的方法 |
| CN108285914A (zh) * | 2017-12-03 | 2018-07-17 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种l-色氨酸的发酵工艺 |
| CN109517858A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-03-26 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种生产和提取l-色氨酸的方法 |
| US20200216867A1 (en) * | 2019-01-07 | 2020-07-09 | Evonik Operations Gmbh | Method for producing l-tryptophan using improved strains of the enterobacteriaceae family |
| CN113265432A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-08-17 | 内蒙古阜丰生物科技有限公司 | 一种发酵培养基及其在微生物发酵制备氨基酸中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PATNAIK 等: "L-Tyrosine production by recombinant Escherichia coli: Fermentation optimization and recovery", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 * |
| 杨梦晨 等: "精氨酸对Escherichia coli发酵生产L-色氨酸的影响", 《发酵科技通讯》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114381477A (zh) * | 2020-10-19 | 2022-04-22 | 江苏元易邦生物科技有限公司 | 一种提高l-色氨酸发酵过程产率和糖酸转化率的方法 |
| CN112430633A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-03-02 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺 |
| CN112430633B (zh) * | 2020-11-02 | 2023-05-09 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺 |
| CN112813115A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-05-18 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种高纯度l-精氨酸的生产工艺 |
| CN112813115B (zh) * | 2020-11-11 | 2023-10-03 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种高纯度l-精氨酸的生产工艺 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110541014A (zh) | 一种利用流加培养液发酵生产色氨酸的方法 | |
| CN103060393A (zh) | 一种柠檬酸生产发酵工艺 | |
| CN106929548B (zh) | 一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺 | |
| CN112940945A (zh) | 一种中国被毛孢发酵的方法 | |
| CN103409477A (zh) | 一种提高l-色氨酸发酵过程中糖酸转化率的方法 | |
| CN103215323A (zh) | 一种采用分段梯度供氧方式发酵生产l-谷氨酸的方法 | |
| CN109593801A (zh) | 一种发酵生产l-色氨酸的工艺 | |
| CN109593797A (zh) | 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN112501221A (zh) | 一种提高苏氨酸糖酸转化率的方法 | |
| CN104560743B (zh) | 一种粉状毕赤酵母高密度发酵工艺方法 | |
| CN107201383B (zh) | 一种可提高d-乳酸生产强度的d-乳酸生产方法 | |
| CN110283854B (zh) | 一种发酵培养基及其应用和利用三孢布拉霉菌发酵制备番茄红素的方法 | |
| CN109161507B (zh) | 一种高产l-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用 | |
| CN109182438B (zh) | 利用芽孢杆菌发酵生产维生素b2的培养基及培养方法 | |
| CN101586133B (zh) | 阿维菌素批发酵优化工艺 | |
| CN114058654B (zh) | 一种用于提高γ-氨基丁酸产量的发酵方法 | |
| CN110387387A (zh) | 一种重组大肠杆菌产l-色氨酸的发酵工艺 | |
| CN110592154B (zh) | 一种生产和提取色氨酸的工艺 | |
| CN111154815B (zh) | 一种提高l-色氨酸生产效率的方法 | |
| WO2019127829A1 (zh) | 氧化型辅酶q10的发酵生产方法、及由其制备而得的高含量氧化型辅酶q10 | |
| CN109609566A (zh) | 一种提高苏氨酸产量的方法 | |
| CN109576196A (zh) | 一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法 | |
| CN109439703A (zh) | 一种用于苏氨酸发酵工艺的培养基 | |
| CN109609567B (zh) | 一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的l-色氨酸绿色生产方法 | |
| CN112852896A (zh) | 一种l-精氨酸的发酵生产方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200102 Address after: 830026 Xinjiang Fufeng Biotechnology Co., Ltd. ganquanbao Industrial Zone, Urumqi Economic and Technological Development Zone (Toutunhe District), Xinjiang Uygur Autonomous Region Applicant after: XINJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 830026 Xinjiang Fufeng Biotechnology Co., Ltd. ganquanbao Industrial Zone, Urumqi Economic and Technological Development Zone (Toutunhe District), Xinjiang Uygur Autonomous Region Applicant before: Feng Shihong |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191206 |