CN109576196A - 一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法 - Google Patents

一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法。所述发酵培养基组成包括：淀粉100‑140g/L、淀粉酶0.1‑0.2g/L、黄豆饼粉12‑18g/L、棉籽饼粉12‑18g/L、酵母粉0.5‑1.5g/L、2,2‑甲基丁酸0.01‑0.2g/L、环己甲酸或者环己甲酸钠0.2‑0.4g/L。本发明通过对发酵培养基及多拉菌素生产方法的改进，显著提高多拉菌素的发酵水平，在发酵370h，效价达到3545μg/ml，且整个生产工艺简单易操作，有利于工业化生产。

Description

一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法。
背景技术
多拉菌素(Doramectin，DRM)，为新一代大环内酯类抗寄生虫药，通过基因重组的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis strainNEAU1069)新菌株在发酵过程中以环己烷羧酸(cyclohexanec arboxylic acid，CHC)为前体而生成的一种阿维菌素类抗生素。因多拉菌素抗寄生虫范围广泛、效果显著，给药途径易于掌握，生物利用度高、药物残效期长等优势，已在兽医临床应用于牛、马、绵羊、山羊、猪、骆驼、犬等哺乳动物。
目前多拉菌素的生产主要通过生物发酵的方法进行。CN107723325A公开了一种基于pH控制的多拉菌素发酵生产方法，通过在次级代谢阶段补加生理碱性盐，流加第一碳源，并控制pH在6.7-7.0范围内。所得发酵产量达2100-2300μg/ml。但该方法存在效价相对较低；需要对淀粉进行预处理，工艺工程相对复杂；同时需要通过补加生理碱性盐和流加碳源来控制发酵过程中的pH，易出现控制pH偏差影响代谢水平等的问题。CN108396045A公开了一种通过改进前体加入方式及添加量来提高发酵水平，在发酵375h后，效价达到3558.20μg/ml。该方法虽然效价较高，但存在工艺复杂；对前体加入方式控制严格，稍有偏差就会影响代谢水平；同时，需要将前体分散到乳化体系，要用到甲醇、丙三醇等有机溶剂，增加作业操作及作业人员安全风险等问题。CN108018324A公开了一种生产多拉菌素的发酵培养基，其通过采用特定的复合氮源，显著提高多拉菌素的发酵水平，效价达到2900μg/ml。该方法的效价仍然不是十分理想。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法。本发明通过对发酵培养基及多拉菌素生产方法的改进，显著提高多拉菌素的发酵水平，在发酵370h，效价达到3545μg/ml，且整个生产工艺简单易操作，有利于工业化生产。
本发明的技术方案如下：
一种生产多拉菌素的发酵培养基，包括：淀粉100-140g/L、淀粉酶0.1-0.2g/L、黄豆饼粉12-18g/L、棉籽饼粉12-18g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、环己甲酸或者环己甲酸钠(前体)0.2-0.4g/L。
优选地，所述发酵培养基，包括：淀粉120g/L、淀粉酶0.12g/L、黄豆饼粉15g/L、棉籽饼粉15g/L、酵母粉1g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、前体0.3g/L。
进一步优选地，所述2,2-甲基丁酸含量为0.03-0.1g/L，进一步优选为0.04-0.07g/L。所述2,2-甲基丁酸含量≥99％。
所述淀粉选自玉米淀粉、黄豆饼粉为高温黄豆饼粉。
所述发酵培养基的pH值为7.0-7.3。
所述前体为环己甲酸或者环己甲酸钠。
现有多拉菌素发酵生产过程中，通常是以玉米淀粉作为主要发酵碳源，须先对玉米淀粉进行液化，其目的为把淀粉降解为便于菌种利用的小分子糖类；虽然多拉菌素生长需要一定的还原糖，但液化容易造成发酵液中还原糖浓度过高，对多拉菌素的合成造成一定的抑制，并且会延缓进入次级代谢的时间。本发明通过对现有培养基成分进行筛选，确立了最佳的发酵培养基配方，所有组分可一起混合灭菌，减少了淀粉酶作用的时间，不仅省略了玉米淀粉单独液化的步骤，避免了还原糖浓度过高的问题，而且也实现了原有液化的功效，促进其菌丝的生长代谢，提高发酵水平。
此外，在多拉菌素的发酵生产中，前体是生物合成的限制性因素，添加的前体物质能够被微生物全部利用或部分利用后进入目标代谢产物的代谢过程，保持前体物质在发酵液中的合适浓度，既能提高前体的利用率，又能防止前体浓度过高对代谢产生抑制作用，提高目标化合物产量。本发明从现有已知前体中筛选出环己甲酸或者环己甲酸钠，并确定其适宜的添加浓度，并通过实验验证了在此条件下得到的培养基可使多拉菌素发酵水平得到进一步提升。
为了获得更好的效果，所述发酵培养基还包括硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾、碳酸钙、消泡剂中的一种或多种。
作为本发明实施方式之一，所述发酵培养基的组成包括：淀粉100-140g/L、淀粉酶0.1-0.2g/L、黄豆饼粉12-18g/L、棉籽饼粉12-18g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、环己甲酸或者环己甲酸钠0.2-0.4g/L、硫酸镁3-5g/L、硫酸锌0.02-0.1g/L、磷酸氢二钾2-4g/L、碳酸钙4-6g/L、消泡剂0.5-1g/L。
作为本发明另一实施方式，所述发酵培养基的组成包括：淀粉120g/L、淀粉酶0.12g/L、黄豆饼粉15g/L、棉籽饼粉15g/L、酵母粉1g/L、2，2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、前体0.3g/L、硫酸镁4g/L、硫酸锌0.06g/L、磷酸氢二钾3g/L、碳酸钙5g/L、消泡剂0.8g/L。
本发明还提供一种多拉菌素的生产方法，包括：将菌株进行菌种接种、母瓶种子培养液制备、种子罐种子液制备、发酵培养；其中，所述发酵培养采用上述发酵培养基。
优选地，在所述菌种接种、母瓶种子培养液制备、种子罐种子液制备步骤中，至少一个步骤中的培养基中含有2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L，优选0.03-0.1g/L，进一步优选0.04-0.07g/L。
所述菌株为本领域常规使用的阿维链霉菌突变株。
在所述生产方法中，为了保证发酵效果，须在发酵培养到20h后开始流加前体，并控制发酵体系内前体浓度维持在0.1-0.4g/L之间。此外，在发酵培养的中后期，须补加液化淀粉或麦芽糊精，控制发酵液中总糖含量在2％以上。
作为本发明实施方式之一，所述多拉菌素的生产方法具体如下：
1)菌种活化：将低温保藏的阿维链霉菌突变株接种到斜面培养基上，在28±2℃条件下，培养6～8天，得到孢子；
斜面培养基组成如下(g/L)：葡萄糖5.0，麦芽提取物2.0，2，2-甲基丁酸0.01-0.2，酵母提取物5.0，琼脂20，pH7.0-7.3；
2)母瓶种子培养液制备：将经斜面培养所得的孢子接入种子培养基，于28±2℃，摇床转速为250r/min，培养40h～60h；
种子培养基组成如下(g/L)：玉米淀粉20，棉籽饼粉15，酵母抽提物5，2,2-甲基丁酸0.01-0.2，碳酸钙2，消泡剂0.3，并将种子培养基的pH值调节为7.0-7.3；
3)种子罐种子液制备：将母瓶种子培养液按体积比0.2-1.0％接种至一级种子培养基，进行种子培养；
所述种子培养条件如下：种子罐温度28±2℃，罐压0.03-0.06MPa，空气流量1:0.5VVM，搅拌转速100-300rpm；
所述的一级种子培养基组成如下(g/L)：玉米淀粉20，棉籽饼粉15，酵母抽提物5，2，2-甲基丁酸0.01-0.2，碳酸钙2，消泡剂0.5，并将种子培养基的pH值调节为7.0-7.3；
4)多拉菌素的发酵生产：按8-12％的接种量，将步骤3)制备的种子液接入装有3±0.2m3多拉菌素发酵用培养基的容积为5吨的发酵罐中，于温度28±2℃，通气量0.4-1.5VVM，搅拌转速80-250rpm，罐压0.03-0.06MPa的条件下进行发酵培养；全程控制溶氧30％以上，培养周期14-17天；且在发酵培养到20h后开始流加前体，并控制发酵体系内前体浓度维持在0.1-0.4g/L之间。此外，在发酵培养的中后期，须补加液化淀粉或麦芽糊精，控制发酵液中总糖含量在2％以上。
其中，在上述各步骤的培养基中，所述2，2-甲基丁酸含量优选为0.03-0.1g/L，进一步优选为0.04-0.07g/L。
本发明所取得的有益效果如下：
(1)本发明对现有多拉菌素发酵培养基进行改进，通过对组分的筛选及配比的优化，使淀粉不需要经过单独液化，而是和淀粉酶及其他物料一起混合灭菌即可，从而有效控制发酵液中还原糖的浓度，既能满足菌丝的快速生长、快速进入次级代谢阶段，还能减少因还原糖浓度高对多拉菌素合成的抑制作用；采用此方法后，极大的提高发酵液菌浓(30％以上)，为多拉菌素的高产提供了前提条件。
(2)通过对各阶段培养基中加入中间体2,2-甲基丁酸，并控制含量在0.03-0.1g/L之间，可以更好的促使菌丝加快生长代谢，最终极大的提高多拉菌素发酵生产水平。
(3)对现有发酵方法进行改进，通过采用补料方式，控制补料时机及前体浓度，进一步提升发酵水平；同时控制中后期补加液化淀粉或麦芽糊精，控制发酵液中总糖在2％以上。
(4)本发明所述生产方法简单、有效，能够极大提高多拉菌素发酵水平。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中，菌株、种子液制备、使用及发酵罐控制条件具体如下：
菌株：阿维链霉菌突变株，保藏编号：ATCC53568。
发酵步骤：
(1)菌种活化：将低温保藏的阿维链霉菌突变株接种到斜面培养基上，在28±1℃条件下，培养7天，得到孢子；
斜面培养基组成如下(g/L)：葡萄糖5.0，麦芽提取物2.0，2,2-甲基丁酸0.01-0.2，酵母提取物5.0，琼脂20，pH7.0-7.3。
(2)母瓶种子培养液制备：将经斜面培养所得的孢子接入种子培养基，于28±1℃，摇床转速为250r/min，培养46h～50h，得到母瓶种子培养液；
种子培养基组成如下(g/L)：玉米淀粉20，棉籽饼粉15，酵母抽提物5，2,2-甲基丁酸0.01-0.2，碳酸钙2，消泡剂0.3，并将种子培养基的pH值调节为7.0-7.3。
(3)种子罐种子液制备：将母瓶种子培养液按体积比0.5％接种至一级种子培养基，培养，得到种子罐种子液；
所述的种子培养条件如下：种子罐温度28±1℃，罐压0.04Mpa，空气流量1:0.5VVM，搅拌转速200rpm；
所述一级种子培养基组成如下(g/L)：玉米淀粉20，棉籽饼粉15，酵母抽提物5，2,2-甲基丁酸0.01-0.2，碳酸钙2，消泡剂0.5，并将种子培养基的pH值调节为7.0-7.3。
(4)发酵培养：按10％的接种量，将步骤(3)制备的种子罐种子液接入装有3m3多拉菌素发酵用培养基的容积为5吨的发酵罐中，于温度28±1℃，通气量0.4-1.5VVM，搅拌转速80-250rpm，罐压0.04MPa的条件下进行发酵培养，全程控制溶氧30％以上，培养周期14-17天；
发酵培养基组成如下(g/L)：淀粉100-140g/L、淀粉酶0.1-0.2g/L、黄豆饼粉12-18g/L、棉籽饼粉12-18g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、硫酸镁3-5g/L、硫酸锌0.02-0.1g/L、磷酸氢二钾2-4g/L、碳酸钙4-6g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、初始前体(环己甲酸或者环己甲酸钠)0.2-0.4g/L、消泡剂0.5-1g/L。
下述实施例中采用的发酵培养基具体配方为：淀粉120g/L、淀粉酶0.12g/L、黄豆饼粉15g/L、棉籽饼粉15g/L、酵母粉1g/L、硫酸镁4g/L、硫酸锌0.06g/L、磷酸氢二钾3g/L、碳酸钙5g/L、2，2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、初始前体0.3g/L、消泡剂0.8g/L，pH值为7.0-7.3。
实施例1
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)向各级培养基中加入2,2-甲基丁酸0.01g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.3％；
(3)发酵过程中代谢阶段的菌浓维持在44-45％；
(4)在发酵罐培养20h时，开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)第11天开始，每天补入质量分数0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位2969μg/ml。
实施例2
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)各级培养基中加入2,2-甲基丁酸0.02g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.2％；
(3)发酵过程中代谢阶段的菌浓维持在45-46％；
(4)在发酵罐培养20h时，开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)第11天开始，每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位3083μg/ml。
实施例3
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)各级培养基中加入2,2-甲基丁酸0.03g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.3％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在46-47％；
(4)在发酵罐培养20h时，开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)第11天开始，每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位3468μg/ml。
实施例4
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)各级培养基中加入2,2-甲基丁酸0.05g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.3％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在46-47％；
(4)在发酵罐培养20h时，开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)第11天开始，每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位3545μg/ml。
实施例5
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)各级培养基中加入2,2-甲基丁酸0.1g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.4％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在46-47％；
(4)在发酵罐培养20h时，开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)11天开始，每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位3517μg/ml。
实施例6
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)各级培养基中加入2,2-甲基丁酸0.12g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.3％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在45-46％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)第11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位3400μg/ml。
实施例7
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)各级培养基中加入2，2-甲基丁酸0.15g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.2％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在45-46％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位3273μg/ml。
实施例8
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)各级培养基中加入2，2-甲基丁酸0.2g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.2％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在44-45％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位3206μg/ml。
对比例1
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)本对比例各级培养基中加入2,2-甲基丁酸0.05g/L；
(2)发酵培养基中淀粉加淀粉酶单独液化，在85℃-90℃保温40分钟，灭菌后培养基还原糖浓度3.8％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在34-35％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)第11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位2727μg/ml。
对比例2
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)本对比例各级培养基中不加入2,2-甲基丁酸；
(2)发酵培养基中淀粉加淀粉酶单独液化，在85℃-90℃保温40分钟，灭菌后培养基还原糖浓度3.6％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在33-34％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位2236μg/ml。
对比例3
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)本对比例各级培养基中不加入2，2-甲基丁酸；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.3％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在44-45％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为0.1-0.4g/L；
(5)11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位2744μg/ml。
对比例4
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)本对比例各级培养基中加入2，2-甲基丁酸0.05g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.3％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在45-46％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度大于0.05，且小于0.1g/L；
(5)11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位2651μg/ml。
对比例5
采用上述发酵步骤生产多拉菌素，其中：
(1)本对比例各级培养基中加入2，2-甲基丁酸0.05g/L；
(2)发酵培养基中淀粉不单独液化，全部物料一起灭菌，灭菌后培养基还原糖浓度1.3％；
(3)发酵过程中代谢阶段菌浓维持在44-45％；
(4)在发酵罐培养20h时开始流加补入前体，控制发酵液中前体浓度为大于0.4，且小于0.7g/L；
(5)11天开始每天补入0.5％的液化淀粉；
发酵370h后放罐，放罐单位2708μg/ml。
通过以上实施例和对比例的发酵结果可以明显的看出，采用本发明发酵用培养基可以极大的提高多拉菌素的发酵水平，极大的降低规模化生产的成本。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种生产多拉菌素的发酵培养基，其特征在于，包括：淀粉100-140g/L、淀粉酶0.1-0.2g/L、黄豆饼粉12-18g/L、棉籽饼粉12-18g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、环己甲酸或者环己甲酸钠0.2-0.4g/L。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，包括：淀粉120g/L、淀粉酶0.12g/L、黄豆饼粉15g/L、棉籽饼粉15g/L、酵母粉1g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、环己甲酸或者环己甲酸钠0.3g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述2,2-甲基丁酸含量为0.03-0.1g/L，优选为0.04-0.07g/L；
和/或，所述发酵培养基的pH值为7.0-7.3。
4.根据权利要求1-3任一所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基还包括硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾、碳酸钙、消泡剂中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，包括：淀粉100-140g/L、淀粉酶0.1-0.2g/L、黄豆饼粉12-18g/L、棉籽饼粉12-18g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、环己甲酸或者环己甲酸钠0.2-0.4g/L、硫酸镁3-5g/L、硫酸锌0.02-0.1g/L、磷酸氢二钾2-4g/L、碳酸钙4-6g/L、消泡剂0.5-1g/L；
优选地，所述发酵培养基的组成包括：淀粉120g/L、淀粉酶0.12g/L、黄豆饼粉15g/L、棉籽饼粉15g/L、酵母粉1g/L、硫酸镁4g/L、硫酸锌0.06g/L、磷酸氢二钾3g/L、碳酸钙5g/L、2,2-甲基丁酸0.01-0.2g/L、环己甲酸或者环己甲酸钠0.3g/L、消泡剂0.8g/L。
6.一种多拉菌素的生产方法，其特征在于，包括：菌种接种、母瓶种子培养液制备、种子罐种子液制备、发酵培养；其中，所述发酵培养采用权利要求1-5任一所述发酵培养基。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，在所述菌种接种、母瓶种子培养液制备、种子罐种子液制备步骤中，至少其中一个步骤中的培养基含有2,2-甲基丁酸，其含量为0.01-0.2g/L，优选为0.03-0.1g/L，进一步优选为0.04-0.07g/L。
8.根据权利要求6或7所述的生产方法，其特征在于，在所述发酵培养20h后开始流加前体，并控制发酵体系内前体浓度维持在0.1-0.4g/L之间。
9.根据权利要求6-8任一所述的生产方法，其特征在于，在所述发酵培养的中后期，须补加液化淀粉或麦芽糊精，控制发酵液中总糖含量在2％以上。
10.根据权利要求6-9任一所述的生产方法，其特征在于，包括：
1)菌种活化：将低温保藏的阿维链霉菌突变株接种到斜面培养基上，在28±2℃条件下，培养6～8天，得到孢子；
斜面培养基组成如下，g/L：葡萄糖5.0，麦芽提取物2.0，2,2-甲基丁酸0.01-0.2，酵母提取物5.0，琼脂20，pH7.0-7.3；
2)母瓶种子培养液制备：将经斜面培养所得的孢子接入种子培养基，于28±2℃，摇床转速为250r/min，培养40h～60h；
种子培养基组成如下，g/L：玉米淀粉20，棉籽饼粉15，酵母抽提物5，2,2-甲基丁酸0.01-0.2，碳酸钙2，消泡剂0.3，并将种子培养基的pH值调节为7.0-7.3；
3)种子罐种子液制备：将母瓶种子培养液按体积比0.2-1.0％接种至一级种子培养基，进行种子培养；
所述种子培养条件如下：种子罐温度28±2℃，罐压0.03-0.06MPa，空气流量1:0.5VVM，搅拌转速100-300rpm；
所述的一级种子培养基组成如下，g/L：玉米淀粉20，棉籽饼粉15，酵母抽提物5，2,2-甲基丁酸0.01-0.2，碳酸钙2，消泡剂0.5，并将种子培养基的pH值调节为7.0-7.3；
4)多拉菌素的发酵生产：按8-12％的接种量，将步骤3)制备的种子液接入装有3±0.2m3多拉菌素发酵用培养基的容积为5吨的发酵罐中，于温度28±2℃，通气量0.4-1.5VVM，搅拌转速80-250rpm，罐压0.03-0.06MPa的条件下进行发酵培养；全程控制溶氧30％以上，培养周期14-17天。
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