CN112813000A

CN112813000A - 一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基及发酵方法

Info

Publication number: CN112813000A
Application number: CN202110087447.7A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 史祯晖; 王桂龙
Original assignee: Wuhan Weikang Probiotics Research Institute Co ltd
Current assignee: Wuhan Weikang Probiotics Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明公开了一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基及发酵方法，属于发酵工程技术领域。本发明的高密度发酵培养基配方为：乳糖20‑30g/L、牛肉浸粉10‑15g/L、酵母浸粉10‑15g/L、牛骨蛋白胨5‑10g/L、磷酸氢二钾2‑5g/L、柠檬酸氢铵2‑5g/L、乙酸钠2‑5g/L、硫酸镁0.2‑0.5g/L、硫酸锰0.1‑0.2g/L、吐温‑80 1‑2mL/L、L‑半胱氨酸盐酸盐1‑2g/L。本发明的高密度发酵方法为：将乳双歧杆菌种子液接种到高密度发酵培养基中进行发酵，发酵过程中流加中和剂的任一种维持发酵液pH值为5.5～6.0。本发明实现了乳双歧杆菌的高密度发酵，降低了生产成本、提高了生产效率。

Description

一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基及发酵方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基及发酵方法。

背景技术

乳双歧杆菌是人体肠道中常见的益生菌，也是世界上广泛研究的益生菌菌种之一。乳双歧杆菌可以产生乙酸、乳酸，来抑制肠道腐败菌的生长和有毒代谢产物的形成，从而调整肠道菌群，同时乳双歧杆菌还能刺激肠道蠕动，从而缓解便秘的症状。另外，乳双歧杆菌可以促进人体对乳糖的消化，从而缓解因为乳糖不耐受而引起的肠痉挛、肠胀气以及腹泻的症状。

在生物技术转化过程中，低成本转化、规模化和工业化，是面临的主要问题。本发明针对乳双歧杆菌大规模工业化中遇到的生产成本高、发酵技术工艺流程复杂等问题，通过对发酵培养基成分及发酵过程工艺控制进行摸索，实现了乳双歧杆菌的高密度发酵。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基及发酵方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基，其配方如下：乳糖20-30g/L、牛肉浸粉10-15g/L、酵母浸粉10-15g/L、牛骨蛋白胨5-10g/L、磷酸氢二钾2-5g/L、柠檬酸氢铵2-5g/L、乙酸钠2-5g/L、硫酸镁0.2-0.5g/L、硫酸锰0.1-0.2g/L、吐温-80 1-2mL/L、L-半胱氨酸盐酸盐1-2g/L。

优选的，所述的乳双歧杆菌高密度发酵培养基的配方如下：乳糖20g/L、牛肉浸粉10g/L、酵母浸粉10g/L、牛骨蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾3g/L、柠檬酸氢铵3g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.1g/L、吐温-80 1mL/L、L-半胱氨酸盐酸盐1g/L。

一种乳双歧杆菌高密度发酵方法，包括如下步骤：将乳双歧杆菌种子液接种到上述高密度发酵培养基中，在温度37～39℃、转速50～100rpm条件下发酵12～18小时；发酵过程中流加中和剂维持发酵液pH值为5.5～6.0；发酵过程不通气或通入N₂；当发酵液在600nm波长下的吸光值（OD₆₀₀）不再增加时，终止发酵。所述的中和剂优选为氨水、Na₂CO₃或NaOH中的任一种。

所述的乳双歧杆菌种子液优选通过包括如下步骤的方法制备：将冷冻保存的乳双歧杆菌取出接种到5mL的MARS培养基中，在37℃、厌氧条件下进行活化培养；待到24h后，将菌液以2%（V/V）的接种量再接种于MARS培养基中（二代），在37℃、厌氧条件下培养12h后，再以2%的接种量接入MARS培养基中（三代），于37℃、厌氧条件下培养12h后作为种子液。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明中以乳糖代替常规培养基中的速效碳源葡萄糖能有效的减缓乳双歧杆菌产生乳酸，同时通过流加中和剂中和发酵液中的酸根离子，从而解除乳酸的反馈抑制作用，使用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法发酵的乳双歧杆菌，菌体密度较普通发酵显著提高，活菌数不低于2.1×10¹⁰cfu/mL，这是现有的技术难以达到的发酵水平，较普通MARS培养基培养活菌数2×10⁹cfu/mL提高了10倍，实现了乳双歧杆菌的高密度发酵；可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本、提高生产效率。

附图说明

图1是实验组、对照组发酵过程中不同时间点的OD₆₀₀结果图。

具体实施方式

通过以下实施例来更好的阐述本发明的目的、结果及其技术方案，但所述实施例只是为了解释本发明，而不能作为限制本发明。

实施例1

一、实验组

1、发酵培养基组分及其含量：乳糖20/L、牛肉浸粉10/L、酵母浸粉10/L、牛骨蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾3g/L、柠檬酸氢铵3g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.1g/L、吐温-80 1mL/L、L-半胱氨酸盐酸盐1g/L。

2、制备种子液：将冷冻保存的乳双歧杆菌取出接种到5mL的L-MARS培养基中，在37℃、厌氧条件下进行活化培养；待到24h后，取1mL种子液再接种于50mL的L-MARS培养基中（二代），在37℃、厌氧条件下培养12h后，再取4mL接入200mL的L-MARS培养基中（三代），于37℃、厌氧条件下培养12h后作为发酵罐的种子液。

3、发酵：配制10L步骤（1）中的发酵培养基加到15L厌氧发酵罐中，121℃灭菌20分钟，降温后用NaOH调发酵培养基pH至7。将步骤（2）得到的乳双歧杆菌种子液200mL接入到发酵培养基中，在温度37℃、转速100rpm的条件下发酵。发酵过程中自动流加25%氨水以维持发酵液pH值为5.5-6.0，发酵全程通入氮气。发酵16h时，当发酵液的OD₆₀₀不再增加时，终止发酵。

二、对照组：

除发酵培养基组分及含量不同外，其余步骤同实验组。

对照组发酵培养基为普通MARS培养基，其组分及含量为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、酵母浸粉4g/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸钠2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温-80 1mL/L。

比较实验组、对照组发酵过程中不同时间点的OD₆₀₀，结果见图1。

从图中结果可以发现采用本发明发酵培养基，无论是乳双歧杆菌生长速率和最高OD₆₀₀值都远高于传统发酵配方，将放罐液进行活菌计数后，实验组活菌达到2.2×10¹⁰cfu/mL，而对照组活菌只有2.1×10⁹cfu/mL。

Claims

1.一种乳双歧杆菌高密度发酵培养基，其特征在于：配方如下：乳糖20-30g/L、牛肉浸粉10-15g/L、酵母浸粉10-15g/L、牛骨蛋白胨5-10g/L、磷酸氢二钾2-5g/L、柠檬酸氢铵2-5g/L、乙酸钠2-5g/L、硫酸镁0.2-0.5g/L、硫酸锰0.1-0.2g/L、吐温-80 1-2mL/L、L-半胱氨酸盐酸盐1-2g/L。

2.根据权利要求1所述的乳双歧杆菌高密度发酵培养基，其特征在于：配方如下：乳糖20g/L、牛肉浸粉10g/L、酵母浸粉10g/L、牛骨蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾3g/L、柠檬酸氢铵3g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.1g/L、吐温-80 1mL/L、L-半胱氨酸盐酸盐1g/L。

3.一种乳双歧杆菌高密度发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：将乳双歧杆菌种子液接种到权利要求1或2所述的高密度发酵培养基中，在温度37～39℃、转速50～100rpm条件下发酵；发酵过程中流加中和剂维持发酵液pH值为5.5～6.0；发酵过程不通气或通入N₂；当发酵液在600nm波长下的吸光值不再增加时，终止发酵。

4.根据权利要求3所述的乳双歧杆菌高密度发酵方法，其特征在于：所述的乳双歧杆菌种子液通过包括如下步骤的方法制备：将冷冻保存的乳双歧杆菌取出接种到5mL的MARS培养基中，在37℃、厌氧条件下进行活化培养；待到24h后，将菌液以2%的接种量再接种于MARS培养基中，在37℃、厌氧条件下培养12h后，再以2%的接种量接入MARS培养基中，于37℃、厌氧条件下培养12h后作为种子液。

5.根据权利要求3所述的乳双歧杆菌高密度发酵方法，其特征在于：所述的中和剂为氨水、Na₂CO₃或NaOH。