CN111286471A - 一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法 - Google Patents

一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法 Download PDF

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CN111286471A CN201911275123.5A CN201911275123A CN111286471A CN 111286471 A CN111286471 A CN 111286471A CN 201911275123 A CN201911275123 A CN 201911275123A CN 111286471 A CN111286471 A CN 111286471A
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Abstract

本发明涉及一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，具体包括以下步骤：S1：将甘油管菌种进行划线得到单菌落，单菌落在种子培养基上进行种子培养并保藏；S2：将S1中保藏的甘油管接种于活化培养基上，静置培养形成一级种子液；S3：吸取一定量的一级种子液接到种子扩大培养基上，静置培养形成二级种子液；S4：将二级种子液接入含有豆粕水解液的发酵培养基中厌氧发酵，得到副干酪乳杆菌发酵液。本发明提出的培养副干酪乳杆菌的方法是采用豆粕水解液作为氮源，替代或减少酵母粉等昂贵氮源的用量，降低副干酪乳杆菌的生产成本；通过优化培养基成分、发酵条件，能从发酵液中获得高浓度副干酪乳杆菌，同时发酵液中无不溶性物质，便于浓缩。

Description

一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法。
背景技术
副干酪乳杆菌属于革兰氏阳性菌，是一种益生菌，对维持动物肠道菌群生态平衡起到重要作用，特别是在幼龄动物的肠道保健和疾病的防疫和治疗上有突出的表现。许多企业将其制成微生态饲料添加剂。研究表明：副干酪乳杆菌不仅对很多细菌有拮抗作用，有的菌株还可抑制酵母及霉菌的生长。Nemcova等报道L.paracasei可显著降低刚断奶幼猪体内梭菌属和肠杆菌的数量。Schwenninger等用副干酪乳杆菌副干酪亚种L.paracaseisubsp.paracasei和詹氏丙酸细菌Propionibacteriumjensenii的混合培养物添加到酸奶中，在6℃下也能够有效抑制酵母腐败菌、霉菌等的生长。在副干酪乳杆菌生产过程中，培养基的配方及发酵条件的控制至关重要，直接影响着发酵液中的活菌数量。
传统副干酪乳杆菌生产方法中，发酵液中的副干酪乳杆菌总菌数不高，用于生产的发酵培养基中常用玉米粉、豆饼粉来当微生物生长所需的碳源和氮源，由于玉米粉、豆饼粉水溶性不好，一方面不利于微生物利用，另一方面发酵液残留的这些不溶性成分，会引起后处理困难，使得副干酪乳杆菌生产成本较高。又或者采用酵母膏及酵母浸粉这类昂贵氮源，造成资源浪费。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提出了一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，解决现有副干酪乳杆菌制备成本高，发酵液残留不溶性成分造成后期处理困难的技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，具体包括以下步骤：
S1：将甘油管菌种进行划线得到单菌落，再将得到的单菌落在种子培养基上进行种子培养，并保藏；
S2：取S1中保藏的甘油管接种于活化培养基上，静置培养形成一级种子液；
S3：吸取一定量的一级种子液接到种子扩大培养基上，静置培养形成二级种子液；
S4：将二级种子液接入含有豆粕水解液的发酵培养基中厌氧发酵，得到副干酪乳杆菌发酵液。
进一步的，S1中在甘油管菌种的斜面培养基上划线得到单菌落，所述斜面培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖0.5-1％、酵母浸粉0.5-1％、胰蛋白胨0.5-1％、牛肉浸粉0.2-1％，硫酸镁0.01-0.02％、硫酸锰0.005-0.008％、乙酸钠0.5-0.1％、柠檬酸铵0.2-0.5％、磷酸氢二钾0.2-1％、吐温-80 0.1-0.5％、琼脂粉1.5％、余量为水。
进一步的，所述斜面培养基的制备过程为：将葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸粉、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、吐温-80、琼脂粉及水按配方称取混合溶解，制成培养液，加热升温灭菌一定时间后，分装至平板中，待冷却放入37℃培养箱过夜培养，选出无杂菌平板放入4℃冰箱待用。
进一步的，S1中的种子培养基、S2中的活化培养基及S3中的种子扩大培养基均包括如下体积百分比组分：葡萄糖1-2％、酵母浸粉0.5-1％、胰蛋白胨0.5-1％、牛肉浸粉1-2％、硫酸镁0.01-0.05％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌1-2滴、余量为水。
进一步的，S2中种子的活化及S3中扩大培养均是在30-37℃下静置培养。
进一步的，S4中发酵培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖2-5％、豆粕水解液20-30％、硫酸锰0.1-0.5％、碳酸钙0.5-1％、无水乙酸钠0.5-1.0％、硫酸镁0.1-5％、吐温-800.1-1％、谷氨酸钠0.1-1％、泡敌0.01-0.2％、余量为水。
进一步的，S4中，发酵培养基中豆粕水解液的制备步骤，具体包括：
S41：将豆粕粉按固液比1:5～1:10的比例制成豆粕粉水溶液，定容，加氢氧化钠，混合均匀后升温至100℃预处理20～30min；
S42：冷却到45℃，加入碱性蛋白酶，调节PH至10.5，并于45℃下水解1～1.5h；
S43：降低PH至8.0，升温至65℃，保温一段时间后，加水定容、过滤，取上清，加热升温灭菌，制得豆粕水解液。
进一步的，S4中发酵的条件是：30-37℃厌氧发酵，搅拌转速50-100rpm，用氨水调节PH 6.0-6.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提出的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，采用豆粕水解液作为氮源，降低副干酪乳杆菌的生产成本；通过优化培养基、发酵条件，使得获得的发酵液中副干酪乳杆菌浓度较高，且无不溶性成分，后期离心浓缩方便，从总体上降低生产成本。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。
实施例1
一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，具体包括以下步骤：
在甘油管菌种的斜面培养基上划线得到单菌落，再将得到的单菌落在种子培养基上进行种子培养，并于-50℃冰箱保藏；取保藏的菌种1ml接种于装有100ml活化培养基的500ml三角瓶中，30℃下静置培养24h形成一级种子液；无菌条件下以1％的接种量将上述的一级种子液接到装有100ml种子扩大培养基的500ml三角瓶中上，30℃下静置培养24h形成二级种子液；在30L发酵罐中装入15L发酵培养基，115℃灭菌30min结束后，关闭进罐蒸汽，稍微打开发酵罐罐体尾气阀门使其自然降温，降至105℃时，关闭尾气阀门并用无菌八层纱布封住出气口，手动注入冷却水降温至100℃以下，打开尾气阀门，当培养基温度降至37℃时，停止降温，并将100mL三角瓶种子菌液接入发酵罐中，在37℃、搅拌转速100rpm，开始厌氧发酵，并用氨水控发酵pH 6.0，发酵全程中尾气阀门全开，最终制得副干酪乳杆菌发酵液。
在本实施例中，斜面培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖0.5％、酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨0.5％、牛肉浸粉0.2％，硫酸镁0.01％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、琼脂粉1.5％、余量为水。所述斜面培养基的制备过程为：将葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸粉、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、吐温-80、琼脂粉及水按配方称取混合溶解，制成培养液，在115℃下灭菌30min，分装至平板中，待冷却放入37℃培养箱过夜培养，选出无杂菌平板放入4℃冰箱待用。
在本实施例中，种子培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖1％、酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨0.5％、牛肉浸粉1％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌1滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，活化培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖1％、酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨0.5％、牛肉浸粉1％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌1滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，种子扩大培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖1％、酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨0.5％、牛肉浸粉1％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌1滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，发酵培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖2％、豆粕水解液20％、硫酸锰0.1％、碳酸钙0.5％、无水乙酸钠0.5％、硫酸镁0.1％、吐温-80 0.1％、谷氨酸钠0.1％、泡敌0.01％、余量为水，调节pH 6.0-6.5。
在本实施例中，豆粕水解液的制备步骤，具体包括：将豆粕粉按固液比1:5的比例制成豆粕粉水溶液，定容15L，加60g氢氧化钠，400rpm混合均匀后将豆粕粉水溶液在100℃下预处理20min；待豆粕粉水溶液冷却到45℃，加入20g碱性蛋白酶，调节PH至10.5左右，并于45℃下水解1h；待PH降低至8.0左右，升温至65℃，保温30min后，加水定容20L，用双层纱布过滤，取上清以115℃灭菌，制得豆粕水解液。
实施例2
一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，具体包括以下步骤：
在甘油管菌种的斜面培养基上划线得到单菌落，再将得到的单菌落在种子培养基上进行种子培养，并于-70℃冰箱保藏；取保藏的菌种1ml接种于装有100ml活化培养基的500ml三角瓶中，32℃下静置培养24h形成一级种子液；无菌条件下以1％的接种量将上述的一级种子液接到装有100ml种子扩大培养基的500ml三角瓶中上，32℃下静置培养24h形成二级种子液；在30L发酵罐中装入15L发酵培养基，115℃灭菌30min结束后，关闭进罐蒸汽，稍微打开发酵罐罐体尾气阀门使其自然降温，降至105℃时，关闭尾气阀门并用无菌八层纱布封住出气口，手动注入冷却水降温至100℃以下，打开尾气阀门，当培养基温度降至37℃时，停止降温，并将100mL三角瓶种子菌液接入发酵罐中，在37℃、搅拌转速100rpm，开始厌氧发酵，并用氨水控发酵pH 6.2，发酵全程中尾气阀门全开，最终制得副干酪乳杆菌发酵液。
在本实施例中，斜面培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.8％、胰蛋白胨0.8％、牛肉浸粉0.5％，硫酸镁0.015％、硫酸锰0.006％、乙酸钠0.8％、柠檬酸铵0.4％、磷酸氢二钾0.6％、吐温-800.4％、琼脂粉1.5％、余量为水。斜面培养基的制备过程为：将葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸粉、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、吐温-80、琼脂粉及水按配方称取混合溶解，制成培养液，在115℃下灭菌30min，分装至平板中，待冷却放入37℃培养箱过夜培养，选出无杂菌平板放入4℃冰箱待用。
在本实施例中，种子培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖1.5％、酵母浸粉0.8％、胰蛋白胨0.7％、牛肉浸粉1.5％、硫酸镁0.04％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌2滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，活化培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖1.5％、酵母浸粉0.7％、胰蛋白胨0.8％、牛肉浸粉1.5％、硫酸镁0.04％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌2滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，种子扩大培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖1.6％、酵母浸粉0.9％、胰蛋白胨0.6％、牛肉浸粉1.6％、硫酸镁0.04％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌2滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，发酵培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖3％、豆粕水解液26％、硫酸锰0.4％、碳酸钙0.6％、无水乙酸钠0.8％、硫酸镁2％、吐温-80 0.6％、谷氨酸钠0.5％、泡敌0.03％、余量为水，调节pH 6.2。
在本实施例中，豆粕水解液的制备步骤，具体包括：将豆粕粉按固液比1:8的比例制成豆粕粉水溶液，定容18L，加60g氢氧化钠，400rpm混合均匀后将豆粕粉水溶液在100℃下预处理10min；待豆粕粉水溶液冷却到45℃，加入20g碱性蛋白酶，调节PH至10.5左右，并于45℃下水解1.2h；待PH降低至8.0左右，升温至65℃，保温30min后，加水定容20L，用双层纱布过滤，取上清以115℃灭菌，制得豆粕水解液。
实施例3
一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，具体包括以下步骤：
在甘油管菌种的斜面培养基上划线得到单菌落，再将得到的单菌落在种子培养基上进行种子培养，并于-80℃冰箱保藏；取保藏的菌种1ml接种于装有100ml活化培养基的500ml三角瓶中，37℃下静置培养24h形成一级种子液；无菌条件下以1％的接种量将上述的一级种子液接到装有100ml种子扩大培养基的500ml三角瓶中上，37℃下静置培养24h形成二级种子液；在30L发酵罐中装入15L发酵培养基，115℃灭菌30min结束后，关闭进罐蒸汽，稍微打开发酵罐罐体尾气阀门使其自然降温，降至105℃时，关闭尾气阀门并用无菌八层纱布封住出气口，手动注入冷却水降温至100℃以下，打开尾气阀门，当培养基温度降至37℃时，停止降温，并将100mL三角瓶种子菌液接入发酵罐中，在37℃、搅拌转速100rpm，开始厌氧发酵，并用氨水控发酵pH 6.5，发酵全程中尾气阀门全开，最终制得副干酪乳杆菌发酵液。
在本实施例中，斜面培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖1％、酵母浸粉1％、胰蛋白胨1％、牛肉浸粉1％，硫酸镁0.02％、硫酸锰0.008％、乙酸钠1％、柠檬酸铵0.5％、磷酸氢二钾1％、吐温-800.5％、琼脂粉1.5％、余量为水。斜面培养基的制备过程为：将葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸粉、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、吐温-80、琼脂粉及水按配方称取混合溶解，制成培养液，在115℃下灭菌30min，分装至平板中，待冷却放入37℃培养箱过夜培养，选出无杂菌平板放入4℃冰箱待用。
在本实施例中，种子培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖2％、酵母浸粉1％、胰蛋白胨1％、牛肉浸粉2％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌2滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，活化培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖2％、酵母浸粉1％、胰蛋白胨1％、牛肉浸粉2％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌2滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，种子扩大培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖2％、酵母浸粉1％、胰蛋白胨1％、牛肉浸粉2％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-80 0.1％、泡敌2滴、余量为水，在115℃下灭菌30min，用500mL三角瓶装100mL/瓶。
在本实施例中，发酵培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖5％、豆粕水解液30％、硫酸锰0.5％、碳酸钙1％、无水乙酸钠1.0％、硫酸镁5％、吐温-80 1％、谷氨酸钠1％、泡敌0.2％、余量为水，调节pH 6.5。
在本实施例中，豆粕水解液的制备步骤，具体包括：将豆粕粉按固液比1:10的比例制成豆粕粉水溶液，定容15-20L，加60g氢氧化钠，400rpm混合均匀后将豆粕粉水溶液在100℃下预处理20min；待豆粕粉水溶液冷却到45℃，加入20g碱性蛋白酶，调节PH至10.5左右，并于45℃下水解1.5h；待PH降低至8.0左右，升温至65℃，保温30min后，加水定容20L，用双层纱布过滤，取上清以115℃灭菌，制得豆粕水解液。
将本发明实施例1-3制备的副干酪乳杆菌与传统的制备方法制备副干酪乳杆菌(对照例)进行性能测试，结果见下表1：
表1 性能测试结果
对照例 实施例1 实施例2 实施例3
发酵周期(hr) 48 14 15 16
总菌数(亿cfu/mL) 60 100 98 101
发酵液固形物(％) 30 25 24 26
改进之前，采用玉米粉，豆饼粉作为氮源，发酵周期延长至48-72h，而现有工艺周期14h，比之前发酵周期缩短了30h左右；改进前发酵总菌数60亿cfu/mL，只有现工艺的0.6％；发酵结束，观察发酵液依然可以看到未完全利用完的玉米粉渣和豆饼粉渣，在后期的离心及冷冻干燥中造成了提取困难。其次，本申请还优化了培养基及发酵条件，使得获得的发酵液中副干酪乳杆菌浓度较高，且无不溶性成分，后期离心浓缩方便，从总体上降低生产成本。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1：将甘油管菌种进行划线得到单菌落，再将得到的单菌落在种子培养基上进行种子培养，并保藏；
S2：取S1中保藏的甘油管接种于活化培养基上，静置培养形成一级种子液；
S3：吸取一定量的一级种子液接到种子扩大培养基上，静置培养形成二级种子液；
S4：将二级种子液接入含有豆粕水解液的发酵培养基中厌氧发酵，得到副干酪乳杆菌发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，S1中在甘油管菌种的斜面培养基上划线得到单菌落，所述斜面培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖0.5-1％、酵母浸粉0.5-1％、胰蛋白胨0.5-1％、牛肉浸粉0.2-1％，硫酸镁0.01-0.02％、硫酸锰0.005-0.008％、乙酸钠0.5-0.1％、柠檬酸铵0.2-0.5％、磷酸氢二钾0.2-1％、吐温-80 0.1-0.5％、琼脂粉1.5％、余量为水。
3.根据权利要求2所述的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，所述斜面培养基的制备过程为：将葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉浸粉、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、吐温-80、琼脂粉及水按配方称取混合溶解，制成培养液，加热升温灭菌一定时间后，分装至平板中，待冷却放入37℃培养箱过夜培养，选出无杂菌平板放入冰箱待用。
4.根据权利要求1所述的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，S1中的种子培养基、S2中的活化培养基及S3中的种子扩大培养基均包括如下体积百分比组分：葡萄糖1-2％、酵母浸粉0.5-1％、胰蛋白胨0.5-1％、牛肉浸粉1-2％、硫酸镁0.01-0.05％、硫酸锰0.005％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、吐温-800.1％、泡敌1-2滴、余量为水。
5.根据权利要求1所述的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，S2中种子的活化及S3中扩大培养均是在30-37℃下静置培养。
6.根据权利要求1所述的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，S4中发酵培养基包括如下体积百分比组分：葡萄糖2-5％、豆粕水解液20-30％、硫酸锰0.1-0.5％、碳酸钙0.5-1％、无水乙酸钠0.5-1.0％、硫酸镁0.1-5％、吐温-80 0.1-1％、谷氨酸钠0.1-1％、泡敌0.01-0.2％、余量为水。
7.根据权利要求1或6任意一项所述的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，S4中，发酵培养基中豆粕水解液的制备步骤，具体包括：
S41：将豆粕粉按固液比1:5～1:10的比例制成豆粕粉水溶液，定容，加氢氧化钠，混合均匀后预处理；
S42：冷却到45℃，加入碱性蛋白酶，调节pH至10.5，并于45℃下水解1～1.5h；
S43：降低pH至8.0，升温至65℃，保温一段时间后，加水定容、过滤，取上清，加热升温灭菌，制得豆粕水解液。
8.根据权利要求1所述的一种利用豆粕水解液高密度培养副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，S4中发酵的条件是：30-37℃厌氧发酵，搅拌转速50-100rpm，用氨水调节pH 6.0-6.5。
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