CN112694976A - 一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，属于益生菌生产领域。将嗜酸乳杆菌接种到以乳酸为碳源、酵母粉、蛋白胨和牛肝浸粉为组合氮源的高密度发酵培养基中在温度30‑37℃、转速60‑150rpm、初始pH6.2‑6.5的条件下发酵10‑12h，发酵过程中用碳酸钠溶液控制pH 5.5‑6.0，维持罐压0.03Mpa；得到的发酵液离心去上清后收集菌泥，菌泥与冻干保护剂按质量比1:1‑1.2混匀，真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。本发明发酵过程简单，发酵周期短，发酵液活菌数高，最后得到的冻干菌粉活菌数高，冻干菌粉制备方法简单，稳定性好，适合放大至工业化生产。

Description

一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法

技术领域

本发明属于益生菌生产领域，具体涉及一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法。

背景技术

嗜酸乳杆菌是人体肠道内一种重要的益生菌，其具有调节肠道菌群、缓解乳糖不耐症、增强机体免疫力、降低胆固醇等益生作用，在食品、医疗等方面的应用日益广泛，市场需求巨大。但是目前嗜酸乳杆菌制品存在活菌数低、生产成本高等问题，因此嗜酸乳杆菌的高密度发酵是生产高活菌数嗜酸乳杆菌产品的重要环节。

嗜酸乳杆菌有较高的营养需求，需要糖类、蛋白质、多种氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶等生长因子满足其生长。因此，需要研究一种高密度发酵培养基及其发酵方法，以提高嗜酸乳杆菌发酵液活菌数。

此外，嗜酸乳杆菌作为益生菌在生产制备、贮藏中很容易失活，为减少冷冻干燥过程的菌体失活，确保生产的菌粉具有较高的活菌数，需要添加合适的保护剂提高冻干存活率和贮存稳定性。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的嗜酸乳杆菌发酵液活菌数低、发酵过程复杂、发酵周期较长、冻干菌粉活菌数低、冻干存活率低等问题，提供一种嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基、高密度发酵方法、冻干保护剂，以及高活菌数菌粉的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基，其配方为：30-60g/L乳糖，10-20g/L酵母粉，10-20g/L蛋白胨，5-10g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

优选的，所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基的配方为：50g/L乳糖，15g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，5g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

一种嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法，包括如下步骤：将嗜酸乳杆菌种子液接种到装有上述高密度发酵培养基的发酵罐中，在温度30-37℃、转速60-150rpm、初始pH6.2-6.5的条件下发酵10-12h，发酵过程中用碳酸钠溶液控制pH为5.5-6.0，维持罐压0.03-0.05MPa。所述的碳酸钠溶液的浓度优选为23%。

优选的，所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法中，为在温度35℃、转速100 rpm、初始pH调节为6.5的条件下发酵10-12h，发酵过程中用碳酸钠溶液控制pH为5.8，维持罐压0.03MPa。

优选的，所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法中，所述的嗜酸乳杆菌种子液的制备包括如下步骤：将保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌菌株接入10mL种子培养基中，37℃静置培养6-8h即为一级种子；将一级种子以5%的接种量接种于200mL种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子；所述的种子培养基的配方优选为：20g/L葡萄糖，10g/L牛肉浸粉，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

一种冻干保护剂，包含如下按质量百分比计的组分：15%海藻糖，5%脱脂奶粉，2%蔗糖，2%甘油，0.5%山梨醇。

一种嗜酸乳杆菌高活菌数菌粉的制备方法，包括如下步骤：

（1）将通过上述嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法得到的发酵液离心，去上清，收集菌泥。所述的离心的方法优选为4℃、8000rpm离心10min。

（2）按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1-1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。所述的真空冷冻干燥的条件优选为：预冻温度为-42～-45℃，真空度10-20pa，时间24-28h。

采用上述嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基发酵，发酵过程简单，发酵周期短，发酵液活菌数高；采用上述冻干保护剂得到的嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数高，不低于8.0×10¹¹cfu/g，该菌粉制备方法简单，稳定性高，适合放大至工业化生产。与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）采用的培养基配方所含成分和比例通过大量试验所得，以乳糖作为碳源，可以减缓发酵中乳酸产生，减少乳酸对菌体抑制，有利于菌体生长。

（2）以酵母粉、蛋白胨和牛肝浸粉为组合氮源，这一组合氮源含有大量游离氨基酸、核苷酸及维生素，为嗜酸乳杆菌生长提供大量生长因子，显著促进菌体生长。

（3）发酵中使用碳酸钠控制pH，解除了低pH对菌体生长的抑制，并维持了一定的渗透压，相较于其他碱液，使用碳酸钠控制pH显著提高了发酵的菌体浓度。

（4）采用本发明方法的发酵配方及工艺，无需进行补料，仅通过分批发酵即可获得高密度嗜酸乳杆菌发酵液，发酵过程简单，周期短。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

（1）种子培养：将保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌接入10mL种子培养基中，37℃静置培养8h即为一级种子，将活化的一级种子以5%（v/v）的接种量接种于200mL种子培养基中，37℃静置培养6h即为二级种子。所述种子培养基配方为：20g/L葡萄糖，10g/L牛肉浸粉，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

（2）发酵罐培养：发酵罐体积为15L，装入发酵培养基10L，115℃灭菌20min，以2%（v/v）的接种量将培养获得的二级种子全部接种到不同配方（表1）所组成的发酵培养基的发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23%碳酸钠维持pH为5.8，通入氮气维持罐压为0.03MPa，发酵10 h。所述发酵培养基配方如下表1：

表1

原料含量（g/L）	配方1	配方2	配方3	配方4
					葡萄糖	30
半乳糖		30
					乳糖			30
蔗糖				30
					酵母粉	10	10	10	10
蛋白胨	10	10	10	10
					无水乙酸钠	5	5	5	5
柠檬酸钠	3	3	3	3
					磷酸氢二钾	3	3	3	3
吐温 80	1	1	1	1
					硫酸镁	0.5	0.5	0.5	0.5
硫酸锰	0.1	0.1	0.1	0.1
					L-半胱氨酸盐酸盐	1	1	1	1

（3）将使用上述不同配方发酵培养基得到的发酵液使用MRS培养基进行平板计数培养，活菌数如下表2：

表2

（4）发酵液分离：将配方3的发酵液于4℃、8000rpm离心10min，去上清，收集菌泥。

（5）菌粉制备：按照菌泥:冻干保护剂为1:1（m/m）的比例将冻干保护剂添加到菌泥中，搅拌20min使乳化均匀，然后置于不锈钢托盘中进行真空冷冻干燥，预冻温度为-45℃，时间1h，真空度20pa，经升华干燥26h后获得嗜酸乳杆菌冻干菌粉。所述冻干保护剂配方为：15%海藻糖，5%脱脂奶粉，2%蔗糖，2%甘油，0.5%山梨醇，115℃灭菌20min。通过稀释倒平板法进行活菌数检测，检测培养基为MRS培养基，制备的冻干菌粉活菌数为4.0×10¹¹cfu/g，冻干存活率可达到96.1%。

实施例2

（1）种子液制备同实施例1。

（2）发酵罐培养：发酵罐体积为15L，装入发酵培养基10L，115℃灭菌20min，以2%（v/v）的接种量将培养获得的二级种子全部接种到不同配方（表3）所组成的发酵培养基的发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23%碳酸钠维持pH为5.8，维持罐压为0.03MPa，发酵10 h。所述发酵培养基配方如下表3：

表3

原料含量（g/L）	配方1	配方2	配方3	配方4	配方5	配方6
							乳糖	30	30	30	30	30	30
酵母粉	10	10	10	10	10	5
							蛋白胨	10	10	10	10	10	15
牛肉浸粉		2.5
							番茄浸粉			2.5
牛肝浸粉				2.5	5	7.5
							无水乙酸钠	5	5	5	5	5	5
柠檬酸钠	3	3	3	3	3	3
							磷酸氢二钾	3	3	3	3	3	3
吐温 80	1	1	1	1	1	1
							硫酸镁	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
硫酸锰	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
							L-半胱氨酸盐酸盐	1	1	1	1	1	1

（3）将使用上述不同配方发酵培养基得到的发酵液使用MRS培养基进行平板计数培养，活菌数如下表4：

表4

实施例3

本实施例步骤如下

（1）种子液制备同实施例1。

（2）发酵罐培养：发酵罐体积为15L，装入发酵培养基10L，灭菌温度为115℃，20min，以2%（v/v）的接种量将培养获得的二级种子全部接种到发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始pH调节为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中分别用23%（m/v）碳酸钠、23%（m/v）氢氧化钠和10%（m/v）氨水维持pH为5.8，维持罐压为0.03MPa，培养10h。所述发酵培养基配方为：50g/L乳糖，15g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，5g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。

（3）将使用不同中和剂进行pH控制的发酵液进行活菌计数，结果如下表5：

表5

中和剂种类	发酵液活菌数（10<sup>8</sup>cfu/mL）
		碳酸钠	80
氢氧化钠	37
		氨水	58

（4）发酵液分离：将以碳酸钠为中和剂的发酵液于4℃、8000rpm离心10min，去上清，收集菌泥。

（5）菌粉制备：按照菌泥:冻干保护剂为1:1（m/m）的比例将冻干保护剂添加到菌泥中，搅拌20min使乳化均匀，然后置于不锈钢托盘中进行真空冷冻干燥，预冻温度为-45℃左右，真空度20pa，经升华干燥26h后获得嗜酸乳杆菌冻干菌粉，所述冻干保护剂配方为：15%海藻糖，5%脱脂奶粉，2%蔗糖，2%甘油，0.5%山梨醇，灭菌温度115℃，20min。经检测制备的冻干菌粉活菌数为8.5×10¹¹cfu/g，冻干存活率可达到96.8%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基，其特征在于：配方为：30-60g/L乳糖，10-20g/L酵母粉，10-20g/L蛋白胨，5-10g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐。

2.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基，其特征在于：配方为：50g/L乳糖，15g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，5g/L牛肝浸粉，5g/L乙酸钠，3g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐。

3.一种嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于：包括如下步骤：将嗜酸乳杆菌种子液接种到装有权利要求1或2所述的高密度发酵培养基的发酵罐中，在温度30-37℃、转速60-150rpm、初始pH6.2-6.5的条件下发酵10-12h，发酵过程中用碳酸钠溶液控制pH为5.5-6.0，维持罐压0.03-0.05MPa。

4.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于：所述的碳酸钠溶液的浓度为23%。

5.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于：为在温度35℃、转速100 rpm、初始pH调节为6.5的条件下发酵10-12h，发酵过程中用碳酸钠溶液控制pH为5.8，维持罐压0.03MPa。

6.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌种子液的制备包括如下步骤：将保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌菌株接入10mL种子培养基中，37℃静置培养6-8h即为一级种子；将一级种子以5%的接种量接种于200mL种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子。

7.根据权利要求6所述的嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于：所述的种子培养基的配方为：20g/L葡萄糖，10g/L牛肉浸粉，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸钠，3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，0.1g/L硫酸锰，1g/L吐温80，1g/L L-半光氨酸盐酸盐。

8.一种冻干保护剂，其特征在于：包含如下按质量百分比计的组分：15%海藻糖，5%脱脂奶粉，2%蔗糖，2%甘油，0.5%山梨醇。

9.一种嗜酸乳杆菌高活菌数菌粉的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将通过权利要求3-7任一项所述的方法得到的发酵液离心，去上清，收集菌泥；

（2）按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1-1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述的真空冷冻干燥的条件为：预冻温度为-42～-45℃，真空度10-20pa，时间24-28h。