CN114686407A - 一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法 - Google Patents

一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：（1）将嗜酸乳杆菌在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，至所述MRS琼脂培养基中出现直径至少为3‑5 mm的菌落；（2）培养得到的菌落接种于MRS液体培养基中进行梯度发酵培养，结束培养后再向MRS液体培养基中混合渗透压调节剂和/或酶类物质，收集，得到菌体；（3）将菌体与保护剂混合，进行静电干燥，得到嗜酸乳杆菌菌粉。本发明通过对嗜酸乳杆菌菌株及生产工艺改善，保证菌粉初始活菌数的同时降低菌粉中VBNC状态的菌体数量，提升可培养菌体活菌数数量及占比，降低了工业化生产的成本。

Description

一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法。
背景技术
对不可培养微生物的培养及其机制的研究一直是微生物领域的研究热点和难点。活的但非可培养(viable but non-culturable，VBNC)是指处于代谢活性非常低的状态并且不分裂、但一旦被复苏就具有存活能力并且能够变得可培养的细菌。有生理活性的细菌数，包括可培养的活菌数和VBNC状态的菌体数。VBNC生理状态广泛存在于已培养和未可培养的微生物中。
乳酸菌在一定的条件下（低温、营养物质影响、pH值变化、底物浓度影响、渗透压变化等），也可以形成VBNC的生理状态，这种状态下的乳酸菌，仍具有其生理活性，但是在普通的常规培养基上很难检测出来，因此会影响最终乳酸菌在活菌计数平板（GB4789.35）上的检测结果。
目前，有很多文献报道主要采用各种方法来诱导产生VBNC的状态，如采用物理胁迫因素和化学诱导因素两大类诱导细菌进入VBNC状态；还有就是将得到的乳酸菌菌粉采用外界干预手段对其进行复苏，但是没有提到从如何在生产乳酸菌的工艺角度上，降低或者减少VBNC菌体的数量，提升可培养的乳酸菌数量。而活菌数是目前乳酸菌菌粉的质量评价关键指标，其检测的高低，直接影响了菌粉的使用（添加量）及企业成本，而且其检测方法都是标准化的国标，不能在检测方法上进行更改。
CN109749964A提供了一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法。本发明同现有技术相比，根据嗜酸乳杆菌营养需求，在添加有机豌豆蛋白粉增菌试验的基础上，减少发酵液离心、乳化、冻干后的杂质，以提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数。但该方法还是较为容易因培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生，且发酵液中渗透压及代谢产物过氧化氢过高对菌体形成VBNC的影响，发酵与冻干活菌数仍有待提高。
CN112694976A提供了一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，所述制备方法为：将嗜酸乳杆菌接种到以乳酸为碳源、酵母粉、蛋白胨和牛肝浸粉为组合氮源的高密度发酵培养基中在温度30-37℃、转速60-150 rpm、初始pH 6.2-6.5的条件下发酵10-12 h，发酵过程中用碳酸钠溶液控制pH 5.5-6.0，维持罐压0.03 Mpa；得到的发酵液离心去上清后收集菌泥，菌泥与冻干保护剂按质量比1:1-1.2混匀，真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。该方法通过对培养基营养成分的调整来达到提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数，但难以避免的仍存在培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生、发酵速度过快造成的代谢产物抑制对菌体造成反馈影响形成VBNC状态等问题。
因此，如何更好的将乳酸菌菌粉中的可培养的活菌数提升，降低VBNC状态的菌体数量，提升菌粉的检测活菌数，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法。本发明所述制备方法通过将乳酸菌在MRS琼脂培养基（GB4789.35-2016）上进行划线分离培养，连续多次划线传代达到一定条件后，再进行发酵培养，采用相应的控制条件进行发酵培养，添加特定物质，收集菌体，添加保护剂进行静电干燥，得到乳酸菌菌粉。通过此方法，菌粉中可培养细胞含量能达到87%以上（例如可以是87%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、99%等）。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将嗜酸乳杆菌在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，至所述MRS琼脂培养基中出现直径至少为3-5 mm（例如可以是3 mm、3.5 mm、3.8 mm、3.9 mm、4 mm、4.1 mm、4.2mm、4.3 mm、4.4 mm、4.5 mm、4.6 mm、4.7 mm、4.8 mm、4.9 mm、5 mm等）的菌落；
（2）将步骤（1）培养得到的菌落接种于MRS液体培养基中进行梯度发酵培养，结束培养后再向MRS液体培养基中混合渗透压调节剂和/或酶类物质，收集，得到菌体；
所述梯度发酵培养的程序为：在36-38℃（例如可以是36℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.2℃、37.5℃、38℃等）下发酵培养2-2.5 h（例如可以是2 h、2.1 h、2.2 h、2.3 h、2.4 h、2.5 h等），再将温度降至34-36℃（例如可以是34℃、34.5℃、34.8℃、35℃、35.2℃、35.5℃、35.8℃、35.9等，不包括36℃）发酵培养4-4.5 h（例如可以是4 h、4.1 h、4.2 h、4.3 h、4.4h、4.5 h等），再将温度降至31-33℃（例如可以是31℃、31.5℃、31.8℃、32℃、32.2℃、32.5℃、32.8℃、32.9℃、33℃等）发酵培养6-6.5 h（例如可以是6 h、6.1 h、6.2 h、6.3 h、6.4h、6.5 h等），再将温度降至29-31℃（例如可以是29℃、229.5℃、2.8℃、30℃、30.2℃、30.5℃、30.8℃、30.9℃等，不包括31℃）发酵培养8-8.5 h（例如可以是8 h、8.1 h、8.2 h、8.3h、8.4 h、8.5 h等），最后将温度降至29℃以下（例如可以是29℃、28.5℃、28℃、27.5℃、27℃、26℃、25℃、20℃等）结束培养；
（3）将步骤（2）得到的菌体与保护剂混合，进行静电干燥，得到嗜酸乳杆菌菌粉。
在本发明中，首先从菌株水平上，对嗜酸乳杆菌LA85在相应MRS琼脂培养基（即计数培养基）上进行多次传代培养直至满足所述MRS琼脂培养基中出现直径为4-5 mm的菌落，筛选生长旺盛的、可培养的菌体，减少因培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生；其次，从菌粉生产工艺的水平上，通过梯度控制温度，以保证菌体不因生长过快，代谢产物抑制对菌体造成反馈影响形成VBNC状态；再次，在发酵后期添加渗透压调节剂及酶，从而减轻发酵液中渗透压及代谢产物过氧化氢过高对菌体形成VBNC的影响；最后，采用温和温度进行干燥的方式，降低因低温冷冻干燥造成菌体VBNC现象的产生。
在本发明中，通过对嗜酸乳杆菌的菌株层面及菌粉生产工艺两方面进行改善以降低VBNC状态菌体细胞的产生，多参数控制、协同作用，在保证活菌数的前提下，从而最终降低嗜酸乳杆菌菌粉中的VBNC状态的菌体，提升可培养的菌体数量，方法操作简单，还为工业化生产菌粉活菌计数活菌数提升的检测提供指导。
在本发明中，步骤（1）中，所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA85菌株，保藏编号为CCGMCC No.1.12735，保藏日期为2020年07月20日。
其保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明中，步骤（1）中，所述分离培养的温度为36-38℃（例如可以是36℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.2℃、37.5℃、38℃等），所述分离培养的时间为48-72 h（例如可以是48h、50 h、52 h、54 h、56 h、58 h、60 h、62 h、64 h、66 h、68 h、70 h、72 h等）。
在本发明中，步骤（2）中，所述梯度发酵培养前还需对步骤（1）培养得到的菌落进行活化培养，所述活化培养的温度为36.5-37.5℃（例如可以是36.5℃、36.8℃、37℃、37.2℃、37.5℃等），所述活化培养的时间为15-20 h（例如可以是15 h、16 h、17 h、18 h、19 h、20 h等）；所述活化培养用培养基为MRS液体培养基。
在本发明中，步骤（2）中，所述梯度发酵培养的过程需控制发酵液pH为5.0-6.2，例如可以是5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2等。
在本发明中，步骤（2）中，所述控制发酵液pH的物质为碱性混合物。
在本发明中，所述碱性混合物选自氨水和碳酸钠的混合物、氢氧化钠和碳酸钠的混合物、氢氧化钠和氨水的混合物、硝酸钠和氨水的混合物、硝酸钠和氢氧化钠的混合物、硝酸钠和碳酸钠的混合物中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，采用上述碱性混合物调节pH，一方面能够避免单一碱性过强或过弱无法精确控制pH的问题，一方面上述碱性混合物中还能提供适宜的营养物质。
在本发明中，步骤（2）中，所述渗透压调节剂的添加量占所述MRS液体培养基的0.1-0.5 wt%（例如可以是0.1 wt%、0.2 wt%、0.3 wt%、0.4 wt%、0.5 wt%等）；其中，所述渗透压调节剂选自甜菜碱、甘露醇或四氢嘧啶中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，步骤（2）中，所述酶类物质的添加量占所述MRS液体培养基的0.1-0.5wt%（例如可以是0.1 wt%、0.2 wt%、0.3 wt%、0.4 wt%、0.5 wt%等）；其中，所述酶类物质选自过氧化氢酶。
在本发明中，步骤（3）中，所述菌体与保护剂的质量比为(1-2):(1-3)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1.5:1、1.5:2、1.5:3、2:1、2:3等。
其中，所述保护剂按质量百分含量计由如下组分组成：海藻糖10-30%、蔗糖0.5-5%、甘油0.5-3%，余量为水。
以所述保护剂的总质量为100%计，海藻糖的含量为10-30%，例如可以是10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%、28%、30%等。
以所述保护剂的总质量为100%计，蔗糖的含量为0.5-5%，例如可以是0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%等。
以所述保护剂的总质量为100%计，甘油的含量为0.5-3%，例如可以是0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%等。
在本发明中，步骤（3）中，所述静电干燥采用喷觜式喷雾干燥器进行，具体条件为：进风温度为40-60℃（例如可以是40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等），进风流量为15-25 Nm3/h（例如可以是15 Nm3/h、16 Nm3/h、18 Nm3/h、20 Nm3/h、22 Nm3/h、25 Nm3/h等），出风温度为20-30℃（例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等），雾化温度为30-46℃（例如可以是30℃、35℃、40℃、42℃、44℃、46℃等），雾化压力为100-350 kPa（例如可以是100 kPa、150 kPa、200 kPa、250 kPa、300 kPa、350 kPa等），静电电压为15-30 kV（例如可以是15kV、16 kV、18 kV、20 kV、22 kV、25 kV、28 kV、30 kV等）。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明通过对嗜酸乳杆菌LA85的菌株层面及菌粉生产工艺两方面进行改善以降低VBNC状态菌体细胞的产生，多参数控制、协同作用，在保证活菌数的前提下，从而最终降低嗜酸乳杆菌菌粉LA85中的VBNC状态的菌体，提升可培养的菌体数量，方法操作简单，为工业化生产菌粉活菌计数活菌数提升的检测提供指导；
（2）由本发明所述制备方法制备得到的嗜酸乳杆菌菌粉的活菌数均在2400亿CFU/g以上，甚至达到2600亿CFU/g以上；可培养活菌数在1800亿CFU/g以上，甚至达到2500亿CFU/g以上；菌粉VBNC活菌数在600亿CFU/g以下，甚至达到50亿CFU/g以上；可培养活菌数占比在75%以上，甚至达到95%以上。
下述涉及的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA85菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCGMCCNo.1.12735，保藏日期为2020年07月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明采用的常见试剂的配方如下，在后续实施例中不再赘述。
① MRS液体培养基：将蛋白胨10.00 g、牛肉膏10.00 g、酵母膏5.00 g、柠檬酸氢二铵2.00 g、葡萄糖20.00 g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2.00 g、硫酸锰0.58 g和硫酸镁0.28 g溶于1 L蒸馏水，调节pH值至6.4。
② MRS琼脂培养基：参见国标GB4789.35-2016中的配制。
实施例1
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）从-80℃冰箱中取出嗜酸乳杆菌LA85的甘油管，通过平板划线于MRS琼脂培养基中，在37℃条件下厌氧培养72 h得到单菌落，此为划线传代1次，再挑取平板上最大的菌落在MRS琼脂培养基上按上述条件再进行培养得到单菌落，此为划线传代2次，连续划线传代15次。每次记录直径较大靠前10的菌落大小（单位：mm），划线传代记录结果如下表1所示：
表1
Figure 525365DEST_PATH_IMAGE001
（2）将步骤（1）得到的菌落直径为4.2 mm的菌落（传代15次，菌落6）接种于MRS液体培养基中于37℃下进行活化培养18 h，再以2%的接种量转接入含MRS液体培养基的5 L发酵罐的中进行培养，发酵初始pH 6.5，发酵过程中采用不同的温度梯度进行控制（在37℃下发酵培养2 h，再将温度降至35℃发酵培养4 h，再将温度降至32℃发酵培养6 h，再将温度降至30℃发酵培养8 h，最后将温度降至28℃结束培养），该梯度发酵过程中采用氢氧化钠和碳酸钠的水溶液（其中，氢氧化钠的质量百分含量为10%，碳酸钠的质量百分含量为10%）控制发酵液的pH维持在5.0；在对数期后期稳定性初期（当发酵培养时间为8 h时降至28℃时添加）添加四氢嘧啶0.2 wt%、过氧化氢酶（0.3 wt%，50000 U/g），离心后收集菌体；
（3）将质量比为1:2的菌体和保护剂（所述保护剂按质量百分含量计由如下组分组成：海藻糖20%、蔗糖2%、甘油2%和水76%）混合均匀后，进行静电干燥（干燥条件为：进风温度：50℃，进风流量：25 Nm3/h，雾化温度：40℃，雾化压力：250 kPa，静电电压1 kV，出风温度50℃），得到LA85的嗜酸乳杆菌菌粉。
实施例2
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，选取步骤（1）得到的菌落直径为3.2 mm的菌落（传代8次，菌落2）进行活化接种。
实施例3
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，选取步骤（1）得到的菌落直径为3.7 mm的菌落（传代13次，菌落5）进行活化接种。
实施例4
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，温度梯度程序不同，具体为：在37℃下发酵培养2.5 h，再将温度降至35℃发酵培养4.5 h，再将温度降至32℃发酵培养6.5 h，再将温度降至30℃发酵培养8.5 h，最后将温度降至28℃结束培养。
实施例5
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，梯度发酵过程中采用氢氧化钠和碳酸钠的水溶液（其中，氢氧化钠的质量百分含量为10%，碳酸钠的质量百分含量为10%）控制发酵液的pH维持在6.0。
实施例6
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，梯度发酵过程中采用氢氧化钠和碳酸钠的水溶液（其中，氢氧化钠的质量百分含量为10%，碳酸钠的质量百分含量为10%）控制发酵液的pH维持在6.5。
实施例7
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，梯度发酵过程中采用10wt%的氨水和10wt%的碳酸钠的水溶液控制发酵液的pH维持在5.0。
实施例8
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，梯度发酵过程中采用10wt%的氨水和10wt%的硝酸钠的水溶液控制发酵液的pH维持在5.0。
实施例9
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，四氢嘧啶的含量减至0.1 wt%。
实施例10
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，四氢嘧啶的含量增至0.5 wt%。
实施例11
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，过氧化氢酶的含量减至0.1 wt%。
实施例12
本实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，过氧化氢酶的含量增至0.5 wt%。
实施例13
实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，不再添加四氢嘧啶，但添加过氧化氢酶，且含量增至0.5 wt%。
实施例14
实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，不再添加过氧化氢酶，但添加四氢嘧啶，且含量增至0.5 wt%。
实施例15
实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，将四氢嘧啶替换为等质量百分含量的甘露醇。
实施例16
实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，将四氢嘧啶替换为等质量百分含量的甜菜碱。
实施例17
实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，出风口温度为40℃。
实施例18
实施例提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，出风口温度为60℃。
对比例1
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，选取步骤（1）得到的菌落直径为2.0 mm的菌落（传代4次，菌落1）进行活化接种。
对比例2
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，不进行梯度发酵培养，而是进行恒温培养，具体为：在32℃下发酵培养24 h。
对比例3
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，梯度发酵培养的程序不同，具体为：在37℃下发酵培养1.5 h，再将温度降至35℃发酵培养3.5 h，再将温度降至32℃发酵培养5.5 h，再将温度降至30℃发酵培养7.5 h，最后将温度降至28℃结束培养。
对比例4
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，梯度发酵培养的程序不同，具体为：在37℃下发酵培养3 h，再将温度降至35℃发酵培养5 h，再将温度降至32℃发酵培养7 h，再将温度降至30℃发酵培养9 h，最后将温度降至28℃结束培养。
对比例5
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中，不再添加四氢嘧啶和过氧化氢酶。
对比例6
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，与实施例1的区别仅在于，添加四氢嘧啶和过氧化氢酶的时机不同，再将温度降至32℃发酵培养6 h后，就添加四氢嘧啶0.2wt%、过氧化氢酶（0.3 wt%，50000 U/g），再将温度降至30℃发酵培养8 h，最后将温度降至28℃结束培养。
测试例
测试样品：实施例1-18制备得到的嗜酸乳杆菌菌粉和对比例1-6制备得到的嗜酸乳杆菌菌粉；
测试方法：（1）可培养活菌数的检测方法：参见国标GB4789.35-2016的《食品微生物学检验乳酸菌检验》；（2）活菌数测定方法：采用PI/cFDA双染法：具体步骤：分别称各样品菌粉2 g，溶于38 mL灭菌后的0.85 wt%的生理盐水中，将其与30 mmol/L的PI在冰浴中孵育10 min，然后与50 mmol/L的cFDA在37℃孵育10 min，4℃、6500 rpm离心15 min，用无菌生理盐水洗涤去除过量的染料，孵育完成后用流式细胞仪结合绝对计数荧光微球进行定量分析；（3）VBNC菌体的检测方法：采用上述的方法分别测定嗜酸乳杆菌LA85菌粉的活菌数和可培养菌数，从而计算出活的不可培养状态VBNC状态的活菌数（活菌数-可培养活菌数）；
具体测试结果如下表2所示：
表2
Figure 733624DEST_PATH_IMAGE002
由表2测试数据可知，由本发明所述制备方法制备得到的嗜酸乳杆菌菌粉的活菌数均在2400亿CFU/g以上，甚至达到2600亿CFU/g以上；可培养活菌数在1800亿CFU/g以上，甚至达到2500亿CFU/g以上；菌粉VBNC活菌数在600亿CFU/g以下，甚至达到50亿CFU/g以上；可培养活菌数占比在75%以上，甚至达到95%以上。
由实施例1和实施例2、3的对比可知，至所述MRS琼脂培养基中至少出现直径为4-5mm的菌落，能够筛选得到生长更加旺盛的、可培养的菌体，从而进一步地减少因培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生。
由实施例1和实施例5、6的对比可知，梯度发酵过程中pH范围更加适宜控制在6.0以下，更加优选为5.0~5.4，在该范围内能进一步保证代谢产物抑制对菌体造成反馈影响形成VBNC状态。
由实施例1和实施例9、10的对比可知，本发明意外地发现四氢嘧啶的含量优选为0.2~0.4%，而四氢嘧啶的含量过少或过多，均无法达到减轻发酵液中渗透压对菌体形成VBNC的影响的目的。
由实施例1和实施例11、12的对比可知，本发明意外地发现过氧化氢酶的含量优选为0.2~0.4%，而过氧化氢酶的含量过少或过多，也无法达到减轻发酵液中代谢产物过氧化氢过高对菌体形成VBNC的影响的目的。
由实施例1和实施例17、18的对比可知，本发明出风口温度优选为45~55℃，而出风口温度过高或过低，菌体VBNC现象仍然比较明显。
由实施例1和对比例1的对比可知，所述MRS琼脂培养基中至少出现直径为3-5 mm的菌落，可培养活菌数占比可达到88%以上；而采用2 mm的菌落可培养活菌数占比的下降及其明显。
由实施例1和对比例2的对比可知，不进行梯度发酵培养，而是进行恒温培养，菌体或因生长过快，代谢产物无法抑制对菌体造成反馈影响形成VBNC状态，因此VBNC活菌数明显上升，可培养活菌数占比明显下降。
由实施例1和对比例3、4的对比可知，进行梯度发酵培养，但程序范围不在本申请范围内，VBNC活菌数也会明显上升，可培养活菌数占比明显下降。
由实施例1和对比例5、6的对比可知，在发酵后期合适的试剂添加渗透压调节剂及酶，才能够达到减轻发酵液中渗透压及代谢产物过氧化氢过高对菌体形成VBNC的影响。
由此，充分说明在本发明中，通过对嗜酸乳杆菌的菌株层面及菌粉生产工艺两方面进行改善以降低VBNC状态菌体细胞的产生，多参数控制、协同作用，在保证活菌数的前提下，从而最终降低嗜酸乳杆菌菌粉中的VBNC状态的菌体，提升可培养的菌体数量。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将嗜酸乳杆菌在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，至所述MRS琼脂培养基中出现直径至少为4-5 mm的菌落；
（2）将步骤（1）培养得到的菌落接种于MRS液体培养基中进行梯度发酵培养，结束培养后再向MRS液体培养基中混合渗透压调节剂和酶类物质，收集，得到菌体；
所述梯度发酵培养的程序为：在36-38℃下发酵培养2-2.5 h，再将温度降至34-36℃发酵培养4-4.5 h，再将温度降至31-33℃发酵培养6-6.5 h，再将温度降至29-31℃发酵培养8-8.5 h，最后将温度降至29℃以下结束培养；
（3）将步骤（2）得到的菌体与保护剂混合，进行静电干燥，得到嗜酸乳杆菌菌粉；
步骤（1）中，所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA85菌株，保藏编号为CCGMCC No.1.12735，保藏日期为2020年07月20日；
步骤（2）中，所述梯度发酵培养的过程需控制发酵液pH为5.0-6.2；
步骤（2）中，所述渗透压调节剂的添加量占所述MRS液体培养基的0.1-0.5 wt%；其中，所述渗透压调节剂为四氢嘧啶；所述酶类物质的添加量占所述MRS液体培养基的0.1-0.5wt%；其中，所述酶类物质为过氧化氢酶。
2.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离培养的温度为36-38℃，所述分离培养的时间为48-72 h。
3.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述控制发酵液pH的物质为碱性混合物。
4.根据权利要求3所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，所述碱性混合物选自氨水和碳酸钠的混合物、氢氧化钠和碳酸钠的混合物、氢氧化钠和氨水的混合物、硝酸钠和氨水的混合物、硝酸钠和氢氧化钠的混合物、硝酸钠和碳酸钠的混合物中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述菌体与保护剂的质量比为(1-2):(1-3)；
其中，所述保护剂按质量百分含量计由如下组分组成：海藻糖10-30%、蔗糖0.5-5%、甘油0.5-3%，余量为水。
6.根据权利要求1所述的提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述静电干燥采用喷觜式喷雾干燥器进行，具体条件为：进风温度为40-60℃，进风流量为15-25 Nm3/h，出风温度为20-30℃，雾化温度为30-46℃，雾化压力为100-350 kPa，静电电压为15-30 kV。
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