CN115820426A - 宛氏拟青霉在降解乳酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酿酒技术领域，涉及宛氏拟青霉在降解乳酸中的应用以及一种降解乳酸的方法，所述方法包括向发酵基质中加入宛氏拟青霉的步骤。本发明利用霉菌宛氏拟青霉对发酵基质中的乳酸进行降解且达到了较好的降解乳酸作用，进一步丰富了白酒固态发酵过程中堆积阶段霉菌的作用，为白酒酿造过程中微生物作用的机理研究提供了参考，且所用菌株筛选自酒醅发酵环境，不会对酿酒过程产生影响。
Description
技术领域
本发明属于酿酒技术领域，涉及宛氏拟青霉在降解乳酸中的应用。
背景技术
目前，降低酒醅中乳酸主要有两种途径：一是物理途径除酸，主要是通过延长蒸馏时间、加大蒸汽气压来排酸。但乳酸为不易挥发性酸，该途径对乳酸的降解效果并不理想；另一种途径是生物途径，即筛选能利用乳酸的微生物进行降酸，该方法能耗小、无污染且效率高，是当前的主流研究方向。
如：国内专利CN105420168A《利用乳酸产己酸的瘤胃梭菌及其用途》公开了一株可以利用乳酸产己酸的瘤胃梭菌；国内专利CN105586293A《一种新的乳酸利用梭菌及其用途》公开了一种新的利用乳酸的梭菌；国内专利CN111254085A《一种降解乳酸的微生物复合菌剂》公开了一株降解乳酸的库德里阿兹威毕赤酵母；国内专利CN104059854A《一种宛氏拟青霉菌株及其应用》公开了一株宛氏拟青霉，具有纤维素降解的作用。但目前对霉菌降解乳酸的研究尚处空白阶段。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种宛氏拟青霉在降解乳酸中的应用以及一种降解乳酸的方法。
一方面，本发明提供了一种宛氏拟青霉在降解乳酸中的应用。
在一些实施方案中，包括降解发酵基质中的乳酸，所述发酵基质包括发酵培养基或酒醅。
另一方面，本发明还提供了一种降解乳酸的方法，所述方法包括向发酵基质中加入宛氏拟青霉的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：
S1制备宛氏拟青霉菌种子液；
S2向所述发酵基质中加入所述宛氏拟青霉菌种子液进行发酵培养；
其中，所述发酵基质包括发酵培养基或酒醅。
在一些实施方案中，所述宛氏拟青霉菌种子液相对于所述发酵基质的加入量为：1％-5％；所述宛氏拟青霉菌种子液的初始浓度为：104-105cfu/ml；所述发酵培养的条件为：有氧条件下，28℃-45℃，培养2-12天；优选地，所述发酵培养的条件为：有氧条件下，30℃-40℃，培养3-10天。
在一些实施方案中，当所述发酵基质为发酵培养基时，所述宛氏拟青霉菌种子液相对于所述发酵基质的加入量为：1％-3％；所述宛氏拟青霉菌种子液的初始浓度为：104-105cfu/ml；所述发酵培养的条件为：有氧条件下，38℃-41℃，培养2-5天；优选地，所述发酵培养的条件为：有氧条件下，40℃，培养3天。
在一些实施方案中，当所述发酵基质为酒醅时，所述宛氏拟青霉菌种子液相对于所述发酵基质的加入量为：3％-5％；所述宛氏拟青霉菌种子液的初始浓度为：104-105cfu/ml；所述发酵培养的条件为：有氧条件下，28℃-35℃，培养8-12天；优选地，所述发酵培养的条件为：有氧条件下，30℃，培养10天。
在一些实施方案中，所述宛氏拟青霉选自保藏号为：CGMCC NO.7903的宛氏拟青霉MM2。
在一些实施方案中，所述发酵培养基中的乳酸含量为0.1-4％；优选地，所述发酵培养基中的乳酸含量为0.4-3％。
在一些实施方案中，所述发酵培养基还包含如下组分：蛋白胨、酵母膏；所述乳酸与蛋白胨、酵母膏三者之间的重量比为：4-40：20：10；优选地，所述乳酸与蛋白胨、酵母膏三者之间的重量比为：10-20：20：10；优选地，所述乳酸与蛋白胨、酵母膏三者之间的重量比为：20：20：10。
在一些实施方案中，所述酒醅为制酒过程一轮次堆积发酵过程中的酒醅或者制酒过程三轮次堆积发酵过程中的酒醅；所述酒醅中的乳酸含量为0.5％-3％。
在一些实施方案中，所述酒醅为制酒过程一轮次堆积发酵过程中的酒醅或者制酒过程三轮次堆积发酵过程中的酒醅经高温灭菌后得到；所述酒醅中的乳酸含量为0.5％-3％；所述高温灭菌条件为：121℃，灭菌15-20min。
在一些实施方案中，所述发酵培养基的制备方法为：根据所述发酵培养基的配方，用蒸馏水进行配制，经高温灭菌后得到；所述高温灭菌条件为：121℃，灭菌15-20min。
在一些实施方案中，所述宛氏拟青霉种子液的制备方法包括如下步骤：将宛氏拟青霉菌株划线培养于YPD培养基，培养条件为：30℃，3d，培养结束后，挑取平板上的宛氏拟青霉单菌落，均匀混入无菌水中，制备成菌悬液，得到所述宛氏拟青霉菌液。
综上所述，本申请至少具有一项如下有益效果：
(1)霉菌是白酒固态发酵过程不可或缺的微生物，目前现有技术针对霉菌的研究主要以酶的提供及风味物质的代谢为主，发酵过程中霉菌降解乳酸的研究尚处于空白阶段，宛氏拟青霉是白酒固态发酵阶段优势霉菌。本发明利用霉菌宛氏拟青霉对发酵基质中的乳酸进行降解且达到了较好的降解乳酸作用，进一步丰富了白酒固态发酵过程中堆积阶段霉菌的作用，为白酒酿造过程中微生物作用的机理研究提供了参考，且所用菌株筛选自酒醅发酵环境，不会对酿酒过程产生影响。
(2)本发明所提供的利用宛氏拟青霉对发酵基质中的乳酸进行降解，当以乳酸为唯一碳源的发酵基质中的乳酸含量小于等于1.2％时，宛氏拟青霉的乳酸降解率可以达到100％；宛氏拟青霉在乳酸浓度1.2％及以下生长情况较好，随着乳酸浓度的增加，生长逐渐受到抑制；当培养温度为40℃时，宛氏拟青霉对发酵基质中的乳酸降解效率可以达到100％；当发酵基质中的乳酸浓度小于等于2％时，宛氏拟青霉的乳酸降解效率达到100％，当发酵基质中的乳酸浓度为3％时，宛氏拟青霉的乳酸降解效率达到53％。
附图说明
图1为本发明实施例中宛氏拟青霉在有氧培养条件下降解乳酸情况；
图2为本发明实施例中宛氏拟青霉的菌落形态图；
图3为本发明实施例中不同乳酸浓度条件下宛氏拟青霉的乳酸降解率情况；
图4为本发明实施例中不同乳酸浓度条件下宛氏拟青霉的生长情况；
图5为本发明实施例中不同温度下宛氏拟青霉乳酸降解能力情况；
图6为本发明实施例中40℃培养条件下宛氏拟青霉对不同乳酸浓度的乳酸降解情况；
图7为本发明实施例中宛氏拟青霉对固态酒醅的乳酸降解效果；
图8为本发明实施例中宛氏拟青霉对模拟固态发酵的乳酸降解效果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例所使用的宛氏拟青霉菌株可从已授权的专利文献CN104059854B中获取得到，本发明实施例所使用的宛氏拟青霉菌株的保藏号为：CGMCC NO.7903的宛氏拟青霉菌株MM2，分类命名为Paecilomyces varioti，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏日期2013年7月8日，本发明实施例所使用的宛氏拟青霉菌株为公众可以直接得到而不需要进行保藏的菌株。
发酵培养基的配制：按照相应配方：乳酸4-40g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，加蒸馏水至1L进行配制，经121℃灭菌15min后，即得到所述发酵培养基；本发明实施例中所使用的各个发酵培养基除乳酸含量有所不同，别的组分及用量均相同；如：实施例3中所使用的发酵培养基中的乳酸含量为：4g/L、8g/L、12g/L、16g/L、20g/L；实施例2、实施例5所使用的发酵培养基中的乳酸含量均为：20g/L；实施例4中所使用的发酵培养基中的乳酸含量为：0g/L、4g/L、8g/L、12g/L、16g/L、20g/L的发酵培养基；实施例6中所使用的发酵培养基中的乳酸含量为：乳酸含量为12g/L、20g/L、30g/L、40g/L。
利用HPLC测定发酵液中乳酸的方法具体如下：
发酵液于4℃、12000rpm离心10min，离心后取上清液0.1mL加入2.9mL超纯水，上机测定，色谱条件如下：色谱柱采用4.6×50mm，1.8ym的安捷伦ZORBX RRHT SB-C18色谱柱；0.12％磷酸溶液及2％的甲醇作为流动相A，100％甲醇作为流动相B，梯度洗脱(流动相A8min，流动相B5min，流动相A1min)；色谱柱温度为30℃，检测波长为214nm，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。
实施例1宛氏拟青霉种子液的制备方法
对宛氏拟青霉菌株进行活化培养：将宛氏拟青霉菌株划线培养于YPD培养基，在30℃培养3d，培养结束后，挑取平板上的宛氏拟青霉单菌落，均匀混入1mL无菌水中，取100μL于10mL无菌水中，制备成孢子含量为105cfu/ml的菌悬液，得到宛氏拟青霉种子液。
实施例2宛氏拟青霉对乳酸的降解情况检测
将上述得到的宛氏拟青霉种子液按照1％的接种量接入灭菌后的发酵培养基中，分别在有氧/厌氧条件下，30℃培养2天，结束后通过HPLC测定发酵培养基中发酵液的乳酸含量，具体结果如图1所示。根据图1的结果表明，上述宛氏拟青霉在有氧条件下可以降解乳酸，上述发酵培养基配方为：乳酸20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，加蒸馏水至1L进行配制得到。
实施例3不同乳酸浓度下宛氏拟青霉降解乳酸的能力检测
将实施例1制备得到的宛氏拟青霉菌菌株的种子液按照1％的接种量分别接入乳酸浓度分别为4g/L、8g/L、12g/L、16g/L、20g/L(乳酸含量为0.4％、0.8％、1.2％、1.6％、2％)的发酵培养基，乳酸含量为4g/L、8g/L、12g/L、16g/L、20g/L的发酵培养基中的pH分别为4.14、3.67、3.45、3.28、3.15，有氧条件下，30℃培养3天，结束后测定其乳酸降解率，乳酸降解率为发酵培养基中宛氏拟青霉接种前后乳酸浓度的变化率，结果见图3。
根据图3结果表明，当以乳酸为唯一碳源的发酵培养基中的乳酸含量小于等于1.2％时，宛氏拟青霉的乳酸降解率可以达到100％。
实施例4不同乳酸浓度条件下宛氏拟青霉的生长情况
将实施例1制备得到的宛氏拟青霉菌菌株的种子液按照1％的接种量接入乳酸含量分别为0g/L、4g/L、8g/L、12g/L、16g/L、20g/L的发酵培养基，有氧条件下，30℃培养3天，结束后滤纸过滤，烘干称重，具体结果如图4所示。
根据图4的结果表明，宛氏拟青霉在乳酸浓度1.2％及以下生长情况较好，随着乳酸浓度的增加，生长逐渐受到抑制。
实施例5不同温度下宛氏拟青霉乳酸降解的能力情况
将实施例1制备得到的宛氏拟青霉菌菌株的种子液按照1％的接种量接入乳酸浓度为20g/L的发酵培养基中，分别于30℃、37℃、40℃、42℃、45℃下有氧条件培养3天，结束后测定其乳酸降解率，如图5所示。
根据图5结果表明，随着培养温度的升高，宛氏拟青霉对乳酸的降解效率呈现先升高后降低的趋势，当培养温度为40℃时，宛氏拟青霉的乳酸降解效率达到100％。
实施例640℃培养条件下宛氏拟青霉对不同乳酸浓度的乳酸降解效果
将实施例1制备得到的宛氏拟青霉菌菌株的种子液按照1％的接种量接入乳酸含量分别为12g/L、20g/L、30g/L、40g/L的发酵培养基(pH分别为3.45、3.15、2.95、2.86)，有氧条件下，40℃培养3天，结束后测定其乳酸降解率，结果见图6。
根据图6结果表明，培养温度为40℃条件下，宛氏拟青霉对乳酸的降解效果较好，当培养基中的乳酸浓度小于等于2％时，宛氏拟青霉的乳酸降解效率达到100％，当培养基中的乳酸浓度为3％时，宛氏拟青霉的乳酸降解效率达到53％。
实施例7宛氏拟青霉对固态酒醅中的乳酸降解能力检测
将宛氏拟青霉菌菌株的种子液按照5％的接种量分别接入制酒一轮次(乳酸含量0.93g/100g酒醅)和制酒三轮次(乳酸含量2.50g/100g酒醅)堆积发酵过程的酒醅中，分别于30℃、37℃、40℃、42℃、45℃条件下发酵培养10天，测定发酵前、后酒醅中乳酸含量变化，实验步骤如下：
(1)分别称取20g一轮次和三轮次堆积发酵2天的酒醅于250mL三角瓶中，121℃灭菌15min，每一种酒醅样品设置三个平行，待用。
(2)取在YPD平板培养基上，30℃培养3天的宛氏拟青霉，用接种环刮取平板上拟青霉菌落，均匀混入1mL无菌水中，取100μL于10mL无菌水中，制备成孢子含量为105cfu/ml的菌悬液，按照5％的接种量，分别加入灭菌后的酒醅中，搅拌均匀，分别于30℃、37℃、40℃、42℃、45℃下静止培养10天，每天搅拌一次。测定不同温度梯度发酵条件下酒醅中的乳酸含量变化。根据不同温度梯度发酵条件下的乳酸含量变化结果发现，宛氏拟青霉以酒醅为发酵基质进行发酵培养时，在30℃培养条件下，降解乳酸效果最优。
30℃培养条件下，宛氏拟青霉对固态酒醅中乳酸降解效果如图7所示，根据图7结果可以看出，在30℃培养条件下，宛氏拟青霉可以将酒醅中的乳酸彻底降解，即宛氏拟青霉对酒醅中乳酸有较好的降解作用。
实施例8宛氏拟青霉对模拟固态酒醅中的乳酸降解能力检测
本实施例与实施例7的主要区别在于，对酒醅直接进行发酵，不进行灭菌，模拟固态酒醅真实发酵环境，具体如下：
(1)分别称取20g一轮次和三轮次堆积发酵2天的酒醅于250mL三角瓶中，分为模拟实验组和空白对照组，待用。
(2)模拟实验组处理如下：取在YPD平板培养基上，30℃培养3天的宛氏拟青霉，用接种环刮取平板上宛氏拟青霉菌落，均匀混入1mL无菌水中，取100μL于10mL无菌水中，制备成孢子含量为105cfu/ml的宛氏拟青霉菌悬液，按照5％的接种量，分别加入步骤(1)准备好的称取有酒醅的三角瓶中，搅拌均匀，30℃静止培养10天，每天搅拌一次。每组三个平行，测定上述发酵酒醅中的乳酸含量。
空白对照组处理如下：酒醅中不加宛氏拟青霉，直接将步骤(1)准备好的称取有酒醅的三角瓶，30℃静止培养10天，每天搅拌一次。每组三个平行，测定上述发酵酒醅中的乳酸含量。
上述宛氏拟青霉对模拟固态酒醅中乳酸降解效果如图8所示，根据图8结果可知，宛氏拟青霉对真实堆积过程酒醅中的乳酸同样具有较好的降解作用。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，使得本领域技术人员能够更加准确地理解本发明的发明思路以及操作方案，并不是对本发明的进一步限制，本领域技术人员在此基础上作出的非突出的实质性特征和非显著进步的改进，均属于本发明的保护范畴。
Claims (10)
1.宛氏拟青霉在降解乳酸中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括降解发酵基质中的乳酸，所述发酵基质包括发酵培养基或酒醅。
3.一种降解乳酸的方法，其特征在于，所述方法包括向发酵基质中加入宛氏拟青霉的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1制备宛氏拟青霉菌种子液；
S2向所述发酵基质中加入所述宛氏拟青霉菌种子液进行发酵培养；
其中，所述发酵基质包括发酵培养基或酒醅。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述宛氏拟青霉菌种子液相对于所述发酵基质的加入量为：1％-5％；所述宛氏拟青霉菌种子液的初始浓度为：104-105cfu/ml；所述发酵培养的条件为：有氧条件下，28℃-45℃，培养2-12天。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，当所述发酵基质为发酵培养基时，所述宛氏拟青霉菌种子液相对于所述发酵基质的加入量为：1％-3％；所述宛氏拟青霉菌种子液的初始浓度为：104-105cfu/ml；所述发酵培养的条件为：有氧条件下，38℃-41℃，培养2-5天；
当所述发酵基质为酒醅时，所述宛氏拟青霉菌种子液相对于所述发酵基质的加入量为：3％-5％；所述宛氏拟青霉菌种子液的初始浓度为：104-105cfu/ml；所述发酵培养的条件为：有氧条件下，28℃-35℃，培养8-12天。
7.如权利要求1所述的应用或者如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宛氏拟青霉选自保藏号为：CGMCC NO.7903的宛氏拟青霉MM2。
8.如权利要求2所述的应用或者如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的乳酸含量为0.1-4％。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还包含如下组分：蛋白胨、酵母膏；所述乳酸与蛋白胨、酵母膏三者之间的重量比为：4-40：20：10。
10.如权利要求2所述的应用或者如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酒醅为制酒过程一轮次堆积发酵过程中的酒醅或者制酒过程三轮次堆积发酵过程中的酒醅；所述酒醅中的乳酸含量为0.5％-3％；或者
所述酒醅为制酒过程一轮次堆积发酵过程中的酒醅或者制酒过程三轮次堆积发酵过程中的酒醅经高温灭菌后得到；所述酒醅中的乳酸含量为0.5％-3％；所述高温灭菌条件为：121℃，灭菌15-20min。
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