CN117286064A - 一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌、方法及在白酒生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域,公开了一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌,名称为:XDNZ_BI_27,分类名称为:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),保藏编号为:CGMCC NO.28071,保藏日期为:2023年7月31日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明能够为解决酱香型白酒生产中酒醅酸度大、高级醇过高而造成的原料利用率低、产品饮后舒适度低等问题提供全新的策略和思路。该菌株均有很强的应用价值,有助于改善传统的白酒生产,促进白酒生产与质量的提高,产生较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及到一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌、方法及在白酒生产中的应用。
背景技术
酱香型白酒酿造是开放式的生态发酵过程,原料、环境、工具上的微生物自然富集到发酵体系中,在工艺的作用下自发组装,各种微生物协同生长代谢。多轮次发酵是酱香型白酒的生产特点之一,一、二轮次是酱香型白酒酿造的基础和开端,在这两个轮次中所产生的物质会对后续轮次发酵产生重要影响,如果一、二轮次发酵过程中产生过多的有机酸,尤其是非挥发有机酸,会导致有机酸的异常积累,使得酒醅酸度过高,进而影响微生物菌群的演替和代谢,最终影响基酒的产量和质量,不利于白酒的稳定生产。此外,高级醇含量偏高是酱香型白酒一、二轮次基酒面临的普遍问题。高级醇是饮料酒中重要的风味物质。然而,高级醇含量过高会降低酒精饮料的饮后舒适度,含量过低则会造成风味寡淡。因此,要严格控制它们在饮料酒中的浓度。
目前,降低酱酒生产过程中酒醅酸度的研究主要集中在酵母上。研究发现粟酒裂殖酵母对乙酸有较好的耐受性,有可能利用甲羟戊酸途径降解乙酸,合成甲羟戊酸(Microorganisms,2019,7,606)。此外,库德里亚兹毕赤酵母可以降低酒醅中乳酸浓度,进而缓解发酵体系中酸对酿酒酵母的影响(Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2020,68,4903-4911)。而对于高级醇过量积累的问题,已报道的专利多集中在利用微生物菌剂来调控发酵体系内高级醇的合成和积累,如利用白地霉处理葡萄酒来降低其高级醇含量(ZL201310359885.X);利用具耐低温和耐酸生长能力强、酒精产率高、乙醛和高级醇含量低的矮小假丝酵母来控制白酒中高级醇的含量(ZL202011215672.6);通过添加乳杆菌的方式来获得低高级醇含量、高乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的清香型小曲白酒(ZL202210636063.0)。
地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌普遍存在于酱酒制曲、堆积和窖池发酵等过程中。前期的研究表明,地衣芽孢杆菌具有较强的耐高温能力,并可以分泌大量的淀粉酶、蛋白酶等水解酶类,还具有合成酱香型白酒重要风味物质四甲基吡嗪前体物质的能力。在发酵过程中强化芽孢菌可以显著提高四甲基吡嗪的含量(ZL202111409409.5)。然而,目前为止还未有其在降酸、降高级醇方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌、方法及在白酒生产中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌,名称为:XDNZ_BI_27,分类名称为:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),保藏编号为:CGMCC NO.28071,保藏日期为:2023年7月31日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地,所述地衣芽孢杆菌是从酱香型生产酒醅中分离筛选获得的。
进一步地,所述地衣芽孢杆菌的形态特征为:菌落呈圆形、较扁平、半透明,表面粗糙,边缘不整齐,质地均匀易挑起;染色后,呈短杆状,两端钝圆,无鞭毛。
如上所述的地衣芽孢杆菌在白酒酿造中的应用。
进一步地,所述白酒为酱香型白酒。
进一步地,采用地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27进行酱香型白酒原位环境发酵。
进一步地,所述地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27在酱香型白酒原位发酵结束后,地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的使用并未改变堆积末和出窖两个时间节点的酒醅水分、还原糖和淀粉浓度,而酒醅的酸度从原来的3.24±0.02mmol/10g酒醅降低到了2.33±0.01mmol/10g酒醅,降低了28%;
酒醅中乙酸含量从原来的2542.85±179.17mg/kg降低到了1006.25±9.16mg/kg,降低了60.4%,乳酸从6518.72±85.75mg/kg降低到了5003.8±44.97mg/kg,降低了23.2%;丙酸也降低了54.7%;
酒醅中正丙醇含量从原有的1973.38±70.77mg/kg显著降低到了1080.6±9.49mg/kg,降低了45.2%;酒醅中的乙醛降低了61.7%;
乙酸乙酯含量提升至12.9%。
如上所述的地衣芽孢杆菌进行酱香型白酒原位环境发酵的方法,包括如下步骤:
从平板挑取地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27单菌落接种于LB培养基中,在37℃,200r/min摇床培养至稳定期;以10%的接种量接种至新鲜的LB液体培养基,37℃、200r/min培养至对数中后期,用无菌生理盐水洗2次菌液,然后用无菌生理盐水悬浮菌体得到高浓度菌液,以106CFU/g的接种量加入蒸酒摊凉后糟醅中;翻拌均匀后,分至布袋中,放置到酒醅堆的中部位置,堆积发酵3-5d后,将样品进行翻拌,模拟移堆操作,取样后,将其再放入纱布袋中,随着酒醅堆进入到窖池发酵阶段,窖池发酵持续30d,得到酱香型白酒。
本发明取得的优点和积极效果为:
本发明从酱香型酒醅中分离出了一种产酶性能优良地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)XDNZ_Bl_27(CGMCC No.28071),在酱香型白酒原位环境中发酵可以有效降低酒醅酸度和高级醇含量。本发明能够为解决酱香型白酒生产中酒醅酸度大、高级醇过高而造成的原料利用率低、产品饮后舒适度低等问题提供全新的策略和思路。该菌株均有很强的应用价值,有助于改善传统的白酒生产,促进白酒生产与质量的提高,产生较大的经济效益。
附图说明
图1为本发明中地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的菌落形态和显微形态;其中,(a)为菌落形态图,(b)为显微镜图;
图2为本发明中本发明所述地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27在酱香型白酒原位发酵样品位置示意图;其中,(a)为堆积阶段,(b)为窖池阶段;
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明,下属实施例是叙述性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作,均为本领域的常规技术,本文中没有特别注释的部分,本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌,名称为:XDNZ_BI_27,分类名称为:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),保藏编号为:CGMCC NO.28071,保藏日期为:2023年7月31日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
较优地,所述地衣芽孢杆菌是从酱香型生产酒醅中分离筛选获得的。
较优地,所述地衣芽孢杆菌的形态特征为:菌落呈圆形、较扁平、半透明,表面粗糙,边缘不整齐,质地均匀易挑起;染色后,呈短杆状,两端钝圆,无鞭毛。
如上所述的地衣芽孢杆菌在白酒酿造中的应用。
较优地,所述白酒为酱香型白酒。
较优地,采用地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27进行酱香型白酒原位环境发酵。
较优地,所述地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27在酱香型白酒原位发酵结束后,地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的使用并未改变堆积末和出窖两个时间节点的酒醅水分、还原糖和淀粉浓度,而酒醅的酸度从原来的3.24±0.02mmol/10g酒醅降低到了2.33±0.01mmol/10g酒醅,降低了28%;
酒醅中乙酸含量从原来的2542.85±179.17mg/kg降低到了1006.25±9.16mg/kg,降低了60.4%,乳酸从6518.72±85.75mg/kg降低到了5003.8±44.97mg/kg,降低了23.2%;丙酸也降低了54.7%;
酒醅中正丙醇含量从原有的1973.38±70.77mg/kg显著降低到了1080.6±9.49mg/kg,降低了45.2%;酒醅中的乙醛降低了61.7%;
乙酸乙酯含量提升至12.9%。
如上所述的地衣芽孢杆菌进行酱香型白酒原位环境发酵的方法,包括如下步骤:
从平板挑取地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27单菌落接种于LB培养基中,在37℃,200r/min摇床培养至稳定期;以10%的接种量接种至新鲜的LB液体培养基,37℃、200r/min培养至对数中后期,用无菌生理盐水洗2次菌液,然后用无菌生理盐水悬浮菌体得到高浓度菌液,以106CFU/g的接种量加入蒸酒摊凉后糟醅中;翻拌均匀后,分至布袋中,放置到酒醅堆的中部位置,堆积发酵3-5d后,将样品进行翻拌,模拟移堆操作,取样后,将其再放入纱布袋中,随着酒醅堆进入到窖池发酵阶段,窖池发酵持续30d,得到酱香型白酒。
相关制备及检测如下:
实施例1芽孢杆菌的分离筛选
(1)菌种来源:某酒厂自制高温大曲。
(2)培养基:
牛肉膏蛋白胨培养基(LB):蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂粉20g,加蒸馏水定容至1000mL,121℃灭菌20min。
(3)筛选方法:
称取10g酒醅加入到100mL 0.9%无菌生理盐水中,在60℃条件下水浴20min,取100μL悬浮液,采用梯度稀释法涂布于LB固态培养基,37℃培养24h,挑取长势良好的菌落,采用三区划线对各菌落纯化两次,最终得到纯化后菌株,甘油管保存,备用。
(4)鉴定
菌落形态、微观形态观察:
菌落:将纯化后的单菌落以稀释涂板的方式接种于LB培养基,37℃培养24h,观察并记录菌落形态。菌落呈半球状,颜色为乳白色,边缘整齐,不透明,质地均匀易挑起,其中图1-a为XDNZ_Bl_27菌落形态图。
显微镜检:美兰染色,40×油镜观察。9株菌菌体均呈球状或椭圆状,无鞭毛。其中,图1-b为XDNZ_Bl_27菌体形态。
分子生物学鉴定:
对这株菌进行16S rDNA鉴定。所选通用引物为:
27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R:5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’
扩增片段长度约为1500bp。目的片段送金唯智测序,测序结果与GenBank中所登录的16S rDNA序列进行比对分析,确定为地衣芽孢杆菌。
所述地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的16S rDNA核苷酸序列如下:
CTACATCTGTCAGCTTCGGCGGCTGGCTCCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTG
TTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGC
GGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGC
GATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTT
GTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTC
ATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTG
GCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGA
GCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTA
GGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCA
CATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGT
ACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTA
ACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCC
CACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTT
CCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAAATTCCACTCTCCTCTTCTGCAC
TCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCCGGGGGCTTTCACATCAGA
CTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCCGGACACGCTTGCCACCT
ACGTATTACCGCGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGCTTTCTGTAGTACGTCAGGTGCCG
CCCTATCGACGTACTGTCTCCTAACAACAGGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCATT
CA
实施例2酱香型白酒原位发酵实验
从平板挑取单菌落接种于200 mL LB培养基中,在37℃,200 r/min摇床培养至稳定期。以10%的接种量接种至新鲜的LB液体培养基(37℃、200r/min),培养至对数中后期,用无菌生理盐水洗2次菌液,然后用适量的无菌生理盐水悬浮菌体得到高浓度菌液,以106CFU/g的接种量加入10 kg蒸酒摊凉后糟醅中,对照组为等体积的无菌生理盐水。翻拌均匀后,分至布袋中,放置到酒醅堆的中部位置,具体位置如图2a所示,堆积发酵3-5 d后,将样品进行翻拌,模拟移堆操作,取样后,将其再放入纱布袋中,随着酒醅堆进入到窖池发酵阶段,样品在窖池中的具体位置如图2b所示,窖池发酵持续30 d左右。发酵结束后取出样品,检测酒醅中的总酸、还原糖、水分、淀粉、有机酸和风味物质的含量。
如表1所示,酒醅理化分析显示,地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的使用并未改变堆积末和出窖两个时间节点的酒醅水分、还原糖和淀粉浓度,而酒醅的酸度出现了显著下降,从原来的3.24±0.02 mmol/10 g酒醅降低到了2.33±0.01 mmol/10 g酒醅,降低了28%。这里值得注意的是,在添加强化菌剂的情况下,酒醅的还原糖和淀粉未出现显著降低,这意味着对原料淀粉的利用未发生变化,这有利于各个轮次出酒率的控制。
表1堆积末和窖池末酒醅理化检测分析
为了深入解析酒醅酸度的变化,我们对酒醅中的风味物质进行了定量分析,结果如表2所示,与对照组相比,酒醅中乙酸含量从原来的2542.85±179.17 mg/kg降低到了1006.25±9.16mg/kg,降低了60.4%,乳酸从6518.72±85.75 mg/kg降低到了5003.8±44.97 mg/kg,降低了23.2%。此外,丙酸也降低了54.7%。这些有机酸含量的变化对酒醅酸度的变化具有重要的贡献。
除了有机酸之外,酒醅中正丙醇含量从原有的1973.38±70.77 mg/kg显著降低到了1080.6±9.49 mg/kg,降低了45.2%,有助于提高饮后舒适度。此外,乙醛也是引起上头的主要因素之一,地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的应用,使酒醅中的乙醛降低了61.7%。已有报道表明在小曲白酒酿造过程中,地衣芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的添加可以降低29.87%的高级醇含量(现代食品科技,2023,39(2),10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.2.0251),由此可以推测地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27具有更优秀的应用效果。
此外,乙酸乙酯是白酒中四大酯,对风味具有重要的贡献作用。强化实验表明,地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的使用可以提升乙酸乙酯含量12.9%。
由此可见,地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27在白酒发酵体系中可以有效降低挥发性和非挥发性有机酸,降低高级醇,提高风味酯含量,有利于基酒质量的提升,具有重要的应用价值。
表2窖池发酵后酒醅中淀粉和乙醇含量
化合物(mg/kg) | 对照组 | 实验组 |
乙醛 | 19.65±3.52 | 7.52±2.2 |
乙酸乙酯 | 222.9±10.83 | 251.67±7.94 |
正丙醇 | 1973.38±70.77 | 1080.6±9.49 |
异戊醇 | 17.94±3.24 | 12.52±2.66 |
乙酸 | 2542.85±179.17 | 1006.25±9.16 |
丙酸 | 592.8±62.07 | 268.58±16.79 |
乳酸 | 6518.72±85.75 | 5003.8±44.97 |
尽管为说明目的公开了本发明的实施例,但是本领域的技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内,各种替换、变化和修改都是可能的,因此,本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (8)
1.一株能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌,其特征在于:名称为:
XDNZ_BI_27,分类名称为:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),保藏编号为:CGMCCNO.28071,保藏日期为:2023年7月31日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌,其特征在于:所述地衣芽孢杆菌是从酱香型生产酒醅中分离筛选获得的。
3.根据权利要求1所述的能够降低酒醅酸度和高级醇含量的地衣芽孢杆菌,其特征在于:所述地衣芽孢杆菌的形态特征为:菌落呈圆形、较扁平、半透明,表面粗糙,边缘不整齐,质地均匀易挑起;染色后,呈短杆状,两端钝圆,无鞭毛。
4.如权利要求1至3任一项所述的地衣芽孢杆菌在白酒酿造中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述白酒为酱香型白酒。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:采用地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27进行酱香型白酒原位环境发酵。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27在酱香型白酒原位发酵结束后,地衣芽孢杆菌XDNZ_Bl_27的使用并未改变堆积末和出窖两个时间节点的酒醅水分、还原糖和淀粉浓度,而酒醅的酸度从原来的3.24±0.02mmol/10g酒醅降低到了2.33±0.01mmol/10g酒醅,降低了28%;
酒醅中乙酸含量从原来的2542.85±179.17mg/kg降低到了1006.25±9.16mg/kg,降低了60.4%,乳酸从6518.72±85.75mg/kg降低到了5003.8±44.97mg/kg,降低了23.2%;丙酸也降低了54.7%;
酒醅中正丙醇含量从原有的1973.38±70.77mg/kg显著降低到了1080.6±9.49mg/kg,降低了45.2%;酒醅中的乙醛降低了61.7%;
乙酸乙酯含量提升至12.9%。
8.如权利要求1至3任一项所述的地衣芽孢杆菌进行酱香型白酒原位环境发酵的方法,其特征在于:包括如下步骤:
从平板挑取地衣芽孢杆菌XDNZ_BI_27单菌落接种于LB培养基中,在37℃,200r/min摇床培养至稳定期;以10%的接种量接种至新鲜的LB液体培养基,37℃、200r/min培养至对数中后期,用无菌生理盐水洗2次菌液,然后用无菌生理盐水悬浮菌体得到高浓度菌液,以106CFU/g的接种量加入蒸酒摊凉后糟醅中;翻拌均匀后,分至布袋中,放置到酒醅堆的中部位置,堆积发酵3-5d后,将样品进行翻拌,模拟移堆操作,取样后,将其再放入纱布袋中,随着酒醅堆进入到窖池发酵阶段,窖池发酵持续30d,得到酱香型白酒。
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